一种四倍体北沙柳无性系品种的EST‑SSR鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别领域，具体涉及一种四倍体北沙柳无性系品种的est-ssr鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术：
：北沙柳(salixpsammophila)又称沙柳，分布在中国大陆的宁夏、山西、陕西、内蒙古等地。北沙柳枝稠叶茂，且柔嫩，营养价值高，富含较高的蛋白质和脂肪，纤维素含量较低，所含必需氨基酸也较一般禾谷类饲料多，大约与小麦麸含量相近，是牛、羊、驼的好饲料，在冬季饲料缺乏时，各类家畜都喜吃，为牲畜度荒年的主要饲料之一。在毛乌素沙地，每亩可产风干枝叶饲料120—155公斤。此外，北沙柳具有耐旱、耐寒、耐高温、耐沙埋压、抗风蚀、易繁殖、速生等特性，现已成为中国西北地区生态修复、园林绿化的主要造林树种，不仅是碳纤维、生物质资源、强化复合板等的原料，也是沙产业开发的主要灌木树种。随着北沙柳利用价值和方式的不断研发，为了实现高效利用北沙柳的目的，需要从现有资源中筛选和培育满足于不同利用目的的品种或类型。但是目前鉴别北沙柳种质及无性系主要技术是表型性状鉴别，表型性状是基因与环境共同作用的结果，致使表型性状鉴定法存在局限性，不仅耗时长，稳定性和一致性都很差。例如，目前在新品种权申请时采用的是表型性状鉴别方法，但是北沙柳的培育引种情况很多，受环境的影响，每个品种在不同地方的表型性状可能不同，这就很有可能造成同一无性系品种重复申请新品种权的问题。技术实现要素：本发明针对以上问题，提供了一种快速、准确鉴别北沙柳无性系的est-ssr(experssedsequeneetags-simplesequeneereapts)鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用。本发明的技术方案是：一种四倍体北沙柳无性系品种的ssr鉴定引物，包括核苷酸序列号为seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物。一种四倍体北沙柳无性系品种的ssr指纹图谱，所述指纹图谱如下表所示：一种四倍体北沙柳无性系品种的ssr指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：1)、dna提取采用天根植物dna试剂盒提取北沙柳基因组dna，提取后加入200μlte缓冲液进行稀释，用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000对其含量和纯度进行检测，将浓度调至50ng·μl-1，合格样品置于-20℃冰箱保存备用；2)、pcr扩增及毛细管电泳以步骤1)提取的dna为模板，以est-ssr鉴定引物为扩增引物，建立pcr反应体系并进行pcr扩增，扩增产物用dna分析仪进行毛细管电泳；3)、数据统计与分析用genemarkerv2.2.0软件参照mac-pr的方法对步骤2)中每个位点的峰面积进行比对读取峰图，建立原始数据矩阵，得到北沙柳无性系指纹图谱。所述步骤2)中的est-ssr鉴定引物包括核苷酸序列号为seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物。所述步骤2)中pcr扩增反应体系包括dna模板2体积份，10×buffer2体积份，dntp1.6体积份，mg1.2体积份，rtaq0.2体积份，正向引物0.2体积份，反向引物0.8体积份，m13引物0.8体积份，ddh2o11.2体积份；pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。所述步骤3)中读取峰图的方法为：a)根据每个引物总体的峰趋势进行判读主峰和副峰，对主峰进行判读。b)判读主峰时考虑每个引物的基序，读取相隔碱基数大小符合基序的主峰值，荧光量小于500的不读取峰值。c)根据北沙柳为四倍体的特性进行统计记录峰值：如出现一个主峰将主峰值读取四次；如出现两个主峰，按照峰面积进行读取记录，峰面积大的读三次峰值面积小的读一次，若两个主峰面积一样大，则两个主峰值分别读取两次；如出现三个主峰，读取方式参照出现两个主峰的方式进行读取，峰面积最大的主峰读取两次；如出现四个主峰，每个主峰值读取一次。一种四倍体北沙柳无性系品种的ssr指纹图谱在鉴定四倍体北沙柳无性系品种方面的应用。本发明的有益效果是：(1)采用位点的峰面积比对读取峰图的方法，借助四倍体带型组合的特性，构建了仅用1对多态性好、稳定性高、特异性强的引物区分48个北沙柳无性系的指纹图谱，具有有效、简捷、快速、经济的优点，可用于我国四倍体北沙柳无性系、良种及新品种鉴定、鉴别与保护等方面；(2)est-ssr分子标记技术扩增中，使用具有操作简便、高分辨率(可达到1bp)和便于多倍体共显性统计等优点的毛细管电泳检测法，相比之前相关研究利用非变性聚丙酰胺技术，毛细管电泳检测技术构建指纹图谱更准确、更清晰。附图说明图1是北沙柳9居群48份无性系采样地理位置示意；图2是无性系1-22指纹图谱毛细管电泳峰图；图3是无性系2-1指纹图谱毛细管电泳峰图；图4是无性系2-3指纹图谱毛细管电泳峰图；图5是无性系2-10指纹图谱毛细管电泳峰图；图6是无性系2-11指纹图谱毛细管电泳峰图；图7是无性系2-16指纹图谱毛细管电泳峰图；图8是无性系2-17指纹图谱毛细管电泳峰图；图9是无性系2-18指纹图谱毛细管电泳峰图；图10是无性系2-25指纹图谱毛细管电泳峰图；图11是无性系3-7指纹图谱毛细管电泳峰图；图12是无性系3-9指纹图谱毛细管电泳峰图；图13是无性系3-11指纹图谱毛细管电泳峰图；图14是无性系3-16指纹图谱毛细管电泳峰图；图15是无性系3-24指纹图谱毛细管电泳峰图；图16是无性系3-25指纹图谱毛细管电泳峰图；图17是无性系3-36指纹图谱毛细管电泳峰图；图18是无性系3-27指纹图谱毛细管电泳峰图；图19是无性系4-5指纹图谱毛细管电泳峰图；图20是无性系4-6指纹图谱毛细管电泳峰图；图21是无性系4-8指纹图谱毛细管电泳峰图；图22是无性系4-11指纹图谱毛细管电泳峰图；图23是无性系4-15指纹图谱毛细管电泳峰图；图24是无性系4-18指纹图谱毛细管电泳峰图；图25是无性系4-22指纹图谱毛细管电泳峰图；图26是无性系4-28指纹图谱毛细管电泳峰图；图27是无性系4-29指纹图谱毛细管电泳峰图；图28是无性系4-30指纹图谱毛细管电泳峰图；图29是无性系5-4指纹图谱毛细管电泳峰图；图30是无性系5-12指纹图谱毛细管电泳峰图；图31是无性系5-13指纹图谱毛细管电泳峰图；图32是无性系5-21指纹图谱毛细管电泳峰图；图33是无性系6-5指纹图谱毛细管电泳峰图；图34是无性系6-7指纹图谱毛细管电泳峰图；图35是无性系6-11指纹图谱毛细管电泳峰图；图36是无性系6-36指纹图谱毛细管电泳峰图；图37是无性系7-3指纹图谱毛细管电泳峰图；图38是无性系7-13指纹图谱毛细管电泳峰图；图39是无性系7-17指纹图谱毛细管电泳峰图；图40是无性系7-19指纹图谱毛细管电泳峰图；图41是无性系7-21指纹图谱毛细管电泳峰图；图42是无性系8-21指纹图谱毛细管电泳峰图；图43是无性系8-33指纹图谱毛细管电泳峰图；图44是无性系8-34指纹图谱毛细管电泳峰图；图45是无性系9-7指纹图谱毛细管电泳峰图；图46是无性系9-15指纹图谱毛细管电泳峰图；图47是无性系9-22指纹图谱毛细管电泳峰图；图48是无性系9-24指纹图谱毛细管电泳峰图；图49是无性系9-34指纹图谱毛细管电泳峰图；图1中p1表示种源区达拉特旗保绍圪堵，p2表示种源区伊金霍洛旗扎萨克镇，p3表示种源区乌审旗查汗淖尔，p4表示种源区乌审旗乌兰陶勒盖镇高勒，p5表示种源区乌审旗乌兰陶勒盖镇敖包，p6表示种源区鄂托克前旗城川镇，p7表示种源区马季沟，p8表示种源区蔡马场，p9表示种源区骆驼井。具体实施方式定义：居群：即北沙柳的采样种源区，本发明对北沙柳的9个采样种源区达拉特旗保绍圪堵、伊金霍洛旗扎萨克镇、乌审旗查汗淖尔、乌审旗乌兰陶勒盖镇高勒、乌审旗乌兰陶勒盖镇敖包、鄂托克前旗城川镇、马季沟、蔡马场、骆驼井依次用阿拉伯数字编号，分别为1,2,3,4,5,6,7,8,9，各种源区的具体地理信息见表1；居群内无性系编号：在每个居群中取50个无性系样本，依次用阿拉伯数字编号，分别为1,2,3…48,49,50；无性系编号表示方法：居群编号–居群内无性系编号，如无性系1-22表示达拉特旗保绍圪堵种源区中的第22个无性系样本。宋祥硕等(2014)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，报道了基于ssr分子(simplesequencerepeats)标记(通用引物)的沙柳遗传多样性，jiahuixia等(2016)首次报道北沙柳的染色体核型为四倍体。下面结合实施例对本发明作具体说明。实施例1表型性状国家沙柳种质资源保存库位于内蒙古鄂尔多斯达拉特旗，采集保存库内9个种源区各48个无性系样品，各收集地编号、地理分布和采样量如图1和表1所示。对其中48个(48个无性系编号如表2中所示)三年生无性系进行株高，地径测量，每个无性系测定5个分枝角度，同时每个无性系上选取当年生长良好的成熟叶片8-13片，集中照相后，利用mapgis67软件(mapgis是中地数码集团的产品名称，是中国具有完全自主知识版权的地理信息系统，是全球唯一的搭建式gis数据中心集成开发平台，实现遥感处理与gis完全融合，支持空中、地上、地表、地下全空间真三维一体化的gis开发平台)矢量化处理后，测量叶片表型性状，表型性状统计结果见表2所示。试验地地势平坦，生长环境条件一致，釆样时选取生长良好、无病虫害的幼嫩叶片，用塑封袋装好并放入带冰的保温箱中带回实验室，-80℃低温冰箱中保存待用。表1:群体采样信息表2:无性系表型性状调查表实施例2建立指纹图谱1)、dna提取采用天根植物dna试剂盒提取表2中各无性系的基因组dna，提取后加入200μlte缓冲液(tris和edta配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存dna和rna)进行稀释，用琼脂糖凝胶电泳和nanodrop2000(超微量分光光度计)对其含量和纯度进行检测，将浓度调至50ng·μl-1，合格样品置于-20℃冰箱保存备用。2)、est-ssr引物筛选取北沙柳同一株不同部位(根、茎、叶、雌花和雄花)的rna进行提取，使用等量mrna将五种组织混合并合成cdna，建立cdna文库并在lllumina平台进行测序，使用microsatellite(misa)软件分析查找所有的ssr(simplesequeneereapts，是一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna)，最终保留前后序列均不小于125bp的ssr用于引物设计，最后确定168对ssr引物，通过pcr反应、毛细管电泳检测(方法同步骤3)、pcr扩增及毛细管电泳)，筛选出22对多态性丰富、重复性高，稳定性好的est-ssr引物用作图谱构建的基本引物。然后用genemarkerv2.2.0软件参照mac-pr(esselinketal.,2004)的方法对每位点的峰面积进行比对读取峰图，建立原始数据矩阵。通过matlab编程软件筛选特异条带，对每个引物在不同无性系的四倍体带型组合分别进行筛选，筛选出仅出现一次的带型组合数，再与峰图进行比对，挑选出仅出现一次带型组合数最多，能够将48份无性系区分开的引物。最后确定1对引物可将48份无性系完全区分开。该对引物包括核苷酸序列号为seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物。3)、pcr扩增及毛细管电泳核苷酸序列号为seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物在上海thermofisher公司合成并进行ipagr纯化。荧光引物m13(5'-tgtaaaacgacggccagt-3'，带有荧光标记的通用引物)在上海捷瑞生物工程有限公司合成并进行pag纯化。buffer、dntp、mg、rtaq等pcr材料构自天根生化科技有限公司。参照tp-m13-ssr毛细管电泳荧光检测法进行pcr扩增。分别设计带有荧光标记的m13引物、5'接有m13序列的est-ssr正向f引物(即正向f引物的前端接m13引物，目的是为了和m13反应产生荧光)和est-ssr反向r引物。pcr反应体系总体积为20体积份：dna模板2体积份，10×buffer2体积份，dntp(脱氧核糖核苷三磷酸)1.6体积份，mg1.2体积份，rtaq(聚合酶)0.2体积份，接了m13的正向引物0.2体积份，反向引物0.8体积份，m13引物0.8体积份，ddh2o11.2体积份。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，8个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。用dna分析仪(abi，3730xl，appliedbiosystems，usa)检测带有荧光标记的est-ssr扩增产物，进行毛细管电泳。4)、建立指纹图谱用genemarkerv2.2.0(基因标记)软件参照mac-pr(esselinketal.,2004)的方法对每位点的峰面积进行比对读取峰图(如图2-49所示)，建立原始数据矩阵，得到48份无性系指纹图谱，如表3所示。读峰具体方法：a)根据每个引物总体的峰趋势进行判读主峰和副峰，对主峰进行判读。b)判读主峰时考虑每个引物的基序，读取相隔碱基数大小符合基序的主峰值(如本发明中est-ssr引物的基序为(ga)8,读取峰值时应间隔2bp的整数倍，目的是防止峰值偏移造成误差)，荧光量小于500的不读取峰值。c)根据沙柳为四倍体的特性进行统计记录峰值，如出现一个主峰将其主峰值读取四次；(例：主峰值为210bp，读取为210:210:210:210)如出现两个主峰，按照峰面积进行读取记录，峰面积大的重复读两次，若两个主峰面积一样大，则分别读取两次。(例：主峰值为210bp和212bp，210bp峰面积大于212bp，读取为210:210:210:212，若主峰值面积一样大，读取为210:210:212:212。)如出现三个主峰，读取方式参照出现两个主峰的方式进行读取，峰面积大的主峰读取两次。如出现四个主峰，每个主峰值读取一次。表3est-ssr引物扩增48个北沙柳无性系的不同大小片段构建的指纹图谱序号无性系编号四倍体带型组合序号无性系编号四倍体带型组合11-22290:294：294:296254-28288:288：288:29022-1288:288：294:300264-29288:288：298:30032-3282:288：288:300274-30274:276：288:29042-10288:288：288:298285-4274:274：288:29052-11274:288：296:300295-12274:290：290:29462-16290:290：296:300305-13288:290：290:30272-17284:284：288:288315-21282:288：288:29082-18288:288：306:306326-5304:304：304:30492-25290:290：292:292336-7288:288：296:298103-7284:288：294:296346-11276:284：288:288113-9282:288：290:296356-36288:288：290:296123-11274:288：288:298367-3296:296：296:296133-16272:272：290:296377-13288:290：296:296143-24282:288：288:294387-17290:290：290:292153-25274:276：284:294397-19284:288：288:296163-26290:290：298:298407-21290:296：296:296173-27298:298：298:298418-21290:294：294:294184-5272:290：290:296428-33294:294：294:294194-6274:296：296:296438-34274:284：288:288204-8276:276：296:302449-15272:288：288:294214-11282:290：290:296459-22276:288：288:288224-15298:298：300:300469-7278:288：288:290234-18276:288：290:298479-34282:282：290:298244-22288:288：288:302489-24288:294：296:298应用实施例获得未知北沙柳无性系的叶片材料，根据实施例2的方法和步骤，用核苷酸序列号为seqidno.1所示的正向引物和seqidno.2所示的反向引物进行pcr扩增，读取引物对应的片段大小为287.9:287.9:294.2:299.8，对该未知北沙柳无性系在北沙柳无性系指纹图谱(表3)中进行鉴定，可知，该未知北沙柳无性系为北沙柳无性系2-1。sequencelisting<110>内蒙古农业大学<120>一种四倍体北沙柳无性系品种的est-ssr鉴定引物、指纹图谱及其构建方法和应用<130>2017<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1accgtttcattaaccgctcc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agaaatcacgcctctctcca20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3tgtaaaacgacggccagt18当前第1页12