本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用pcr扩增检测结合耐高温限制性内切酶处理检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法。
背景技术：
：pik3ca基因是由volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26.3，长34kb，包含21个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kd的蛋白。pik3ca编码i类磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylino-sitol3-kinases,pi3ks)的p110催化亚单位，即pi3kp110a。研究发现pik3ca是一种癌基因，生理情况下，基因pik3ca在正常脑、肺、乳腺、胃肠、宫颈、卵巢等组织中均有表达，具有调控体细胞增殖、分化、存活等许多重要的生理功能，但多以非激活的形式存在，通常不易检测到，而其突变后基因及其蛋白均可过度表达，可被检测到。研究表明，pik3ca基因的突变不仅可以引起pi3ks的催化活性增强，并且可促使细胞癌变。循环肿瘤dna(ctdna)突变检测是近年来兴起且发展迅速的肿瘤诊断技术，称为“液体活检”。ctdna是指肿瘤细胞体细胞dna经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统；随着基因测序的飞速发展，目前，已能在血液中对其进行检测并计数。ctdna来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。因此，ctdna是一种特征性的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪。与组织活检相比ctdna检查微创小、无放射性污染、经济、新dna无防腐剂污染等优点，并允许对治疗反应实时监测。由于ctdna含量低(<1.0％总cfdna)，片段短(180-200bp)，半衰期短(～2小时)，故其检测对痕量核酸检测技术提出全新的挑战。目前具备极微量核酸基因突变检测能力的技术主要有arms技术(包括super-arms)、第二代测序(ngs)和数字pcr(ddpcr，包括beaming技术)等。ngs技术可检测未知突变且检测基因数量不受限，在肿瘤耐药突变的监测与研究等领域有很大的应用潜力。然而，ngs建库技术复杂，常规建库测序方法使得血浆中含量极低的肿瘤信号完全淹没在背景噪声中，建库过程原始信息丢失严重或成为敏感度潜力发挥的限制因素。数字pcr技术，具有极高的敏感性，可绝对定量，但该方法检测通量较低。由于，ctdna含量极少，且肿瘤dna分子存在的数量远远不及正常细胞的dna，肿瘤相关dna被来自正常细胞dna严重稀释，单分子丰度仅0.01％，化验结果特别容易被干扰。因此，能够特异性的丰富样品靶序列的富集技术是液体活检技术发展的关键。技术实现要素：本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于富集技术的循环肿瘤dna(ctdna)pik3ca基因e545k(g>a)突变的检测试剂盒及方法。通过靶向富集血浆游离dna中pik3ca基因e545k(g>a)突变基因片段，提高该突变的检测灵敏度。为达到上述发明目的，本发明的技术方案为：所述检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒中含有特异性引物对和耐高温的限制性内切酶；所述特异性引物包括序列如seqidno.1(aatccagaggggaaaaatatg)所示的正义引物和序列如seqidno.2(attttagcacttacctgtgactc)所示的反义引物；所述耐高温的限制性内切酶tspri内切酶。所述试剂盒中还含有高保真dna聚合酶和pcr常规组件。优选地，所述高保真dna聚合酶为hotstartaqplusdna聚合酶。所述pcr常规组件包括dntp混合液、含镁离子的pcr反应缓冲液、去离子水。基于试剂盒检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的方法包括如下步骤：(1)按照血浆游离dna常规提取方法提取血浆游离dna；(2)采用本发明所述试剂盒进行pcr反应；(3)将步骤(2)获得的pcr产物送去一代测序，并通过与genebank中记录的序列做blast一致性分析，判断突变情况。即，利用sanger测序法分析pcr产物中是否有突变存在。其中，步骤(2)所述进行pcr反应的具体过程分为三步：a)采用试剂盒中的特异性引物对、高保真dna聚合酶、pcr常规组件构成的pcr反应体系，进行pcr反应；b)在pcr反应过程中加入试剂盒中的耐高温的限制性内切酶，并于65℃酶切反应1h；c)酶切反应结束后继续进行pcr反应。优选地，步骤a中所述pcr反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles。步骤c中所述pcr反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。下面对本发明作进一步说明：利用本发明所述试剂盒检测时，pcr反应共分三步进行：①配置不含限制性内切酶tspri的pcr反应体系(25μl)，以步骤(1)获得的血浆游离dna为模板，进行pcr扩增；pcr反应的条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec(15cycles)；②在步骤①反应结束后，往pcr反应体系中加入0.8μl限制性内切酶tspri；65℃反应1小时；③在步骤②反应结束后，接着进行pcr反应；95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5min。步骤①中，每25μlpcr反应体系中的组分如下：正义引物0.4μl，反义引物0.4μl，模板dna2μl，10×pcrbuffer(含硫酸镁)2.5μl，dntp混合液(每种10mm)0.5μl，hotstartaqplusdna聚合酶0.3μl，余量为去离子水；步骤②中所使用的限制性内切酶tspri是耐高温的，在pcr反应用不会出现热失活，且其特异性识别序列为nncastgnn(n＝aortorcorg；s＝corg)，正好能识别pik3ca基因545位密码子的区域atcactgag，当pik3ca基因为野生型(atcactgag)时，tspri酶可将dna双链切断；当545位密码子出现g>a突变时，基因序列突变成atcactaag，tspri将不能识别该序列，不能将dna双链切断。本发明利用耐高温的限制性内切酶(tspri)，tspri内切酶能特异性识别pik3ca基因545位密码子的野生型序列，并将其dna双链切断；而当545位密码子出现g>a突变时，基因序列突变成atcactaag，tspri将不能识别该序列，不能将dna双链切断。通过在普通的pcr反应中，加入耐高温的限制性内切酶，可在反应过程中将野生型的dna片段破坏，使得野生型的pcr产物越来越少，而突变型的dna片段能在反应中不断的富集，提高了低丰度突变的检测灵敏性。总之，采用本发明所述检测pik3ca基因突变的试剂盒和检测方法检测pik3ca基因突变，可提高突变检测的灵敏度，减少样本使用量，有利用临床使用和推广。附图说明图1为联合一代测序可识别pik3ca基因e545k(g>a)点突变中野生型：突变型拷贝数比例达到10000:1。具体实施方式pik3ca基因e545k(g>a)点突变基因型转化(1)在样品模板中采用pcr方法扩增e545k突变位点待识别片段，引物如下：pik3ca-f：5’-aatccagaggggaaaaatatg-3’(seqidno.1)pik3ca-r：5’-attttagcacttacctgtgactc-3’(seqidno.2)。(2)限制性内切酶tspri识别位点pcr反应条件：1)pcr体系如表1：表1hotstartaqplusdna0.3μl10xpcrbuffer2.5μldntp(各10mm)0.5μl上游引物(10μm)0.4μl下游引物(10μm)0.4μldna模板2μlddh2oupto25μl反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles；2)在pcr反应体系中加入限制性内切酶tspri0.8μl,65℃1小时3)95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，15cycles，72℃终延伸5分钟。(3)pcr产物送去一代测序，测序结果与genebank中记录的序列做blast一致性分析。分析结果见图1。sequencelisting<110>郴州市第一人民医院<120>一种检测血浆游离dna中pik3ca基因突变的试剂盒及方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成<400>1aatccagaggggaaaaatatg21<210>2<211>23<212>dna<213>人工合成<400>2attttagcacttacctgtgactc23当前第1页12