本发明属于生物医药领域，涉及一种男性骨质疏松症诊断试剂盒以及psmg4基因在制备男性骨质疏松症诊断试剂盒中的用途。
背景技术：
骨质疏松症是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。
世界卫生组织已将骨质疏松列为仅次于心血管疾病的第二大危害人类健康的疾病。据中国健康促进基金会最新发布的《2013中国骨质疏松骨折防治蓝皮书》显示，骨质疏松骨折是一种脆性骨折，即在受到轻微创伤或日常活动中遭受低能量外伤即可发生的骨折。骨质疏松骨折的常见部位是脊椎、髋骨和前臂远端。我国50岁以上人群约6944万人患有骨质疏松症，约2.1亿人骨量偏低。
在我国，针对老年男性骨质疏松症的关注程度以及研究深度远远不够。但老年男性骨质疏松症的危害并不亚于女性，男性髋部骨折的患病率和病死率明显高于女性。
国内外研究表明，男性骨质疏松症的危险因素包括：
(1)年龄年龄增长是男性骨质疏松症的一项独立危险因素。年龄对于骨代谢的影响可能包括对骨吸收相对活跃，而成骨作用受到抑制，导致骨吸收大于骨形成。与此同时，随着年龄增长，肾lα羟化酶活性下降，活性1,25(oh)2d3减少，肠道钙吸收下降，血钙减少，引起继发性甲状旁腺功能亢进，导致骨质丢失。
(2)体重指数(bodymassindex，bmi)bmi是影响老年男性骨质疏松症患病率的一个重要指标。男性骨质疏松症患病率的一个重要指标。研究显示，bmi小于20-25kg/m2的人群患骨质疏松症可能性会增大，而且与bmi大于25kg/m2的人群比较，bmi为15-20kg/m2的患者髓部骨折的可能性会增加。另外有研究发现，bmi每增加1kg/m2测得股骨颈、髓部和腰椎的bmd分别增加0.1sd，0.11sd以及0.09sd。bmi增加可引起骨骼的机械负荷增大，刺激骨形成并减少骨吸收。
(3)内分泌激素的影响雄激素水平降低是老年男性骨质疏松症的一个重要危险因素。骨细胞上存在雄激素受体，雄激素直接作用于这些受体以促进成骨细胞强化骨骼。老年男性下丘脑一垂体一性腺轴功能减低，睾丸功能减退，睾酮水平下降，而性激素结合球蛋白水平升高，引起成骨细胞的成骨作用减弱，导致骨密度下降。
(4)遗传因素遗传因素在男性骨质疏松症的发病占有重要地位。目前骨质疏松症遗传研究主要包括群体遗传学和分子遗传学两大方面，分别针对人种、家系和基因多态性进行研究。峰值骨量最显著的决定因素是遗传因素，影响可能占60％-80％。
(5)营养水平患者长期饮食习惯和食物的构成配比尤其是食物中钙剂和维生素d的含量对骨质疏松症的发病也起到了一定作用。meta分析表明补充钙和维生素d3的人群，bmd有所增高，发生骨折的风险降低。钙剂可以减少骨量流失，预防椎体骨折，并且对预防非椎体骨折也可能有帮助。
另外，生活习惯包括运动、吸烟、大量饮酒也是男性骨质疏松症的重要危险因素。
诊断骨质疏松症，首先必须进行骨密度的测定。骨密度实际上就是表示骨的健康程度，或是反过来说表示骨的老化程度。常用的检测手段包括：
x线摄片法：使用历史最早，但由于有放射性，其测验结果不能量化，已逐渐被取代。
单光子测定仪：费用低、方便、辐射量小而安全。但因不能测躯干骨以及不能区别皮质骨、松质骨、软组织等而受限制，已逐渐被取代。
定量超声法：低廉、方便、又无放射性损伤。适合各年龄段人群的骨状态普查工作。不仅能检测骨密度，还能了解骨的质量即可反应骨的微结构及弹性。但目前只用于跟骨、胫骨和指骨，不能进行全身骨骼的检测。
双能x线吸收法：是目前最理想的测定法，是诊断骨质疏松症的金标准，国内外通用，可测全身各部位骨骼，也能测软组织厚度，但该设备数量较少且价格昂贵，因此对于骨质疏松症患者的诊断来说经济负担大。为此寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断骨质疏松症的方法是亟待解决的问题。
近年来，遗传因素已经成为了骨生物学中最活跃的研究领域之一，已有研究表明维生素d受体基因(vdr)和维生素d结合蛋白(dbp)是较早发现的骨质疏松症的候选基因，另外还发现esr1基因、esr2基因、cyp19a1基因、cyp17a1基因、esrra基因和esrrg基因与骨质疏松症的发病具有相关性。此外，已经有相当数量的专利申请涉及骨质疏松症的基因诊断，如申请号为：201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的专利。可见利用基因来诊断骨质疏松症成为了今后骨质疏松症早期诊断的发展趋势。
技术实现要素：
本发明利用高通量测序技术发现psmg4(proteasomeassemblychaperone4，蛋白酶体组装伴侣4)基因在男性骨质疏松症患者血液中的表达较正常男性存在差异，与正常男性相比，psmg4基因在男性骨质疏松症患者血液中表达下调，通过检测psmg4基因转录水平的表达情况，可以判断男性受试者是否患有骨质疏松症、或判断该受试者患有骨质疏松症的风险高低、或判断男性骨质疏松症患者预后复发与否。
本发明的目的在于提供psmg4基因在制备诊断男性骨质疏松症的试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含sybrgreen聚合酶链式反应体系、用于扩增psmg4基因和管家基因的引物对。所述sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。
上述技术方案中，所述pcr缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述pcr缓冲液包含：25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4。
所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；管家基因优选gapdh，扩增该基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含m-mlv逆转录体系，该逆转录体系包含：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。
优选逆转录反应液包含：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2、50mmdtt。
rna酶抑制剂可选用本领域常用的rna酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含rna提取试剂，rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的另一目的在于提供一种诊断男性骨质疏松症的试剂盒。所述诊断试剂盒包含sybrgreen聚合酶链式反应体系、用于扩增psmg4基因和管家基因gapdh的引物对。所述sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。
上述技术方案中，所述pcr缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述pcr缓冲液包含：25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4。
所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；管家基因优选gapdh，扩增该基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含m-mlv逆转录体系，该逆转录体系包含：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。
优选逆转录反应液包含：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2、50mmdtt。
rna酶抑制剂可选用本领域常用的rna酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含rna提取试剂，rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明还提供了利用上述诊断试剂盒诊断男性骨质疏松症的方法，所述方法包括：
(1)提取来自男性受试者血液样本rna；
(2)将步骤(1)获得的rna逆转录成cdna；
(3)在荧光实时定量pcr仪上将psmg4基因和管家基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量；
(5)与正常男性对照相比，psmg4基因表达下调，诊断该男性研究对象患有骨质疏松症或者患有骨质疏松症的风险高，或诊断男性骨质疏松症患者预后复发。
步骤(1)的具体实施方法为：使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取，详细步骤参照产品说明书进行。
步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligo(dt)，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*42个循环。以sybr
green作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。
本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次证明了psmg4基因与男性骨质疏松症相关，因此psmg4基因成为了诊断男性骨质疏松症的分子标志物，同时为研究骨质疏松症的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断骨质疏松症较现有技术中的使用方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。
附图说明
图1显示利用qpcr检测psmg4基因在男性骨质疏松症患者和正常男性中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选男性骨质疏松症患者和正常男性的差异表达基因
1、研究对象：
检测骨密度，选择骨质疏松症男性患者3例，年龄分别为60岁、82岁、68岁；正常对照组男性2例，年龄分别为71岁、69岁。
骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。
排除标准：糖尿病、严重肝肾疾病、甲状腺疾病、内分泌疾病引起疾病的老年男性；服用过治疗骨质疏松症药的老年男性，如阿伦磷酸钠等(间断性服用小剂量钙剂除外)。
2、血液总rna提取
使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行外周血总rna的提取。
基本步骤：
(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；
(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；
(3)异丙醇沉淀rna；
(4)漂洗rna沉淀；
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。
3、rna样品的质量分析
利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。
4、片段化rna
illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cdna
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。
6、连接adaptor
双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。
7、ung酶消化cdna二链
在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。
8、illuminax-ten上机测序
illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；
(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；
(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因3296个，其中表达上调的基因1428个，表达下调的基因有1868个。
实施例2qpcr验证候选基因与骨质疏松症的关系
基于前期高通量测序的结果，根据pvalue的大小，我们选择psmg4基因(其表达在男性骨质疏松症患者中下调)进行验证。
1、研究对象：
测骨密度，选择骨质疏松症男性患者30例，年龄为60-82岁；正常骨密度对照组男性30例，年龄为60-82岁。
骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。
排除标准：糖尿病、严重肝肾疾病、甲状腺疾病、内分泌疾病引起疾病的老年男性；服用过治疗骨质疏松症药的老年男性，如阿伦磷酸钠等(间断性服用小剂量钙剂除外)。
2、采用荧光实时定量pcr进行经典的分子生物学实验验证(qrt-pcr)，具体操作步骤如下所示：
(1)血液rna提取
使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行外周血总rna的提取。
基本步骤：
(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；
(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；
(3)异丙醇沉淀rna；
(4)漂洗rna沉淀；
(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。
(2)逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
(3)qpcr扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl；扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；管家基因优选gapdh，扩增该基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*42个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量，结果如图1所示，与正常男性相比，psmg4基因在男性骨质疏松症患者血液中下调，差异具有统计学意义(*p<0.05)。
实施例3男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备
根据psmg4基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测psmg4基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症是否发生，据此本发明提供了一种基于检测psmg4基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系；扩增psmg4基因和gapdh基因的引物对。扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液成分为：25mmkcl，2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。
实施例4男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备
根据psmg4基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测psmg4基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症是否发生，据此本发明提供了一种基于检测psmg4基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系、扩增psmg4基因和gapdh基因的引物对、m-mlv逆转录体系。扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液组分为：25mmkcl、2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。m-mlv逆转录体系组分为：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。逆转录反应液组分为：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2、50mm的dtt。rna酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。
实施例5男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备
根据psmg4基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测psmg4基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症是否发生，据此本发明提供了一种基于检测psmg4基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系、扩增psmg4基因和gapdh基因的引物对、rna提取试剂。扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液组分为：25mmkcl、2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
实施例6男性骨质疏松症诊断试剂盒的制备
根据psmg4基因与男性骨质疏松症的相关性，可以通过检测psmg4基因的表达情况来诊断男性骨质疏松症是否发生，据此本发明提供了一种基于检测psmg4基因表达来诊断男性骨质疏松症的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系、扩增psmg4基因和gapdh基因的引物对、m-mlv逆转录体系、rna提取试剂。扩增psmg4基因的正向序列5’-gctataaccttcagaacacaga-3’，反向序列5’-aagcctccatctcttcctt-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液组分为：25mmkcl、2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。m-mlv逆转录体系组分为：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。逆转录反应液组分为：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2，50mmdtt。rna酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
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<110>首都医科大学附属北京友谊医院
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