一种鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性的分子检测方法与流程

本发明涉及蔬菜害虫的分子鉴定技术，特别涉及一种鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性的分子检测方法。
背景技术：
：西花蓟马frankliniellaoccidentalis(pergande)又名苜蓿蓟马，属缨翅目(thysanoptera)，蓟马科(thripidae)，世界各地均有分布。2000年在我国昆明首次被发现，此后迅速传播并成为田间作物的主要害虫之一。西花蓟马食性杂，对几乎所有开花的植物均可造成危害。目前，对其防治以农药防治为主，物理防治和生物防治为辅。而化学防治中又以多杀菌素的防治效果最为显著，但由于长期大面积的反复施用，已经导致了田间的西花蓟马对多杀菌素产生抗性。为了有效防治西花蓟马，鉴定田间西花蓟马种群对多杀菌素的抗性水平，采取的防治措施是否恰当非常重要。目前测定西花蓟马抗性水平的主要方法为生物测定，即采集至少300头西花蓟马，配制5～6个浓度梯度的多杀菌素对其进行处理，然后观察记录西花蓟马的半数致死浓度。该方法十分繁琐，需要捕捉相当大数量的西花蓟马才能进行测定，而且通常需要进行两次或多次试验才能得到结果，耗费时间长，工作量大。有研究表明西花蓟马烟碱型乙酰胆碱受体nachrs的a6亚基是多杀菌素的作用受体。nachra6亚基基因的全长序列已于2016年由本实验室的何秉青硕士克隆并且已在genbank上登陆(登陆id＝ku557780.1)。目前还尚未见到研究nachra6亚基缺失型转录本比例与西花蓟马对多杀菌素抗性之间的关系，以及如何利用nachra6亚基基因，采用分子检测方法对田间西花蓟马抗性水平进行鉴定的报道，更未见到应用nachra6亚基基因来检测西花蓟马多杀菌素抗性水平的报道。技术实现要素：根据上述领域的不足和需求，本发明提供一种鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性水平的方法，通过构建抗性倍数与nachra6亚基缺失型比例的线性模型，运用分子生物学方法鉴定西花蓟马种群对多杀菌素的抗性水平，仅仅需要20～50头待测种群西花蓟马即可完成鉴定，具有快速、便捷、准确的优点。请求保护的技术方案如下：一种鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性的方法，其特征在于，步骤如下：(1)随机捕捉20～50头待测种群的西花蓟马，提取总rna并反转录为cdna；(2)以所述cdna为模板，用西花蓟马烟碱型乙酰胆碱受体nachra6亚基全长基因的特异性引物进行pcr，得到pcr产物；(3)将所述pcr产物与克隆载体进行连接，然后转化大肠杆菌，挑选阳性克隆进行测序；(4)对测序结果进行分析，统计缺失nachra6亚基基因编码序列的阳性克隆数，以其为分子，以测序的阳性克隆数为分母，计算得到待测种群的nachra6亚基缺失型比例x；(5)获取“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”的标准曲线方程，其横坐标x为以西花蓟马已知种群为系列待测样品，按照步骤(1)－(4)的方法测得的nachra6亚基缺失型比例，纵坐标y为所述西花蓟马已知种群对多杀菌素的抗性倍数以10为底的对数；(6)将步骤(4)计算得到的待测种群的nachra6亚基缺失型比例x代入所述“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”的标准曲线方程中，计算y的值，即得到待测种群对多杀菌素的抗性倍数以10为底的对数；y的值越大，则待测种群对多杀菌素的抗性越高；所述抗性倍数是指多杀菌素对待测种群的半数致死浓度除以多杀菌素对敏感种群的半数致死浓度所得的商。优选地，所述“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”的标准曲线方程为y＝5.395x-1.1906。优选地，所述多杀菌素对敏感种群的半数致死浓度为0.072mg/l。优选地，所述西花蓟马烟碱型乙酰胆碱受体nachra6亚基全长基因的特异性引物如下：a6-cds-f1：5’-accttctccatgtcgcgtag-3’，a6-cds-r1：5’-cagtgctcgaatcactgcac-3’。优选地，所述pcr的反应体系如下：2xgc缓冲液i10.0ul，dntps2.0ul，10um的a6-cds-f10.5ul，10um的a6-cds-r10.5ul，cdna2.0ul，lataq聚合酶0.2ul，ddh2o4.8ul。优选地，所述pcr的反应程序为：95℃5min；95℃30s，63℃30s，72℃130s，35个循环；72℃10min。为获取“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”的标准曲线方程，采用对多杀菌素具有不同抗性的西花蓟马已知种群，优选对多杀菌素的抗性呈梯度增长的种群，利用生物测定方法(例如，叶管药膜法，或其它本领域公知的方法)检测每个已知种群对多杀菌素的抗性，得到多杀菌素对每个已知种群的半数致死浓度，然后除以多杀菌素对敏感种群的半数致死浓度，所得的商即为抗性倍数。所述nachra6亚基缺失型比例＝nachra6亚基缺失型克隆数量/总的阳性克隆数量，其中nachra6亚基缺失型克隆数量指缺失部分(例如，缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个碱基，缺失一段或更多段核苷酸序列)或全部nachra6亚基基因编码序列的阳性克隆数。本发明以本实验室饲养和筛选的5个不同抗性水平的西花蓟马室内种群(敏感种群、低抗种群、中抗种群、高抗种群和极高抗性种群)为研究对象，采用生物测定方法检测了每个种群对多杀菌素的抗性水平，其中多杀菌素对敏感种群的半数致死浓度为0.072mg/l，将其抗性倍数设为1，然后用其它种群的半数致死浓度分别除以0.072mg/l，得到低抗种群、中抗种群、高抗种群和极高抗性种群的抗性倍数。并根据nachra6亚基的基因序列(genbankid＝ku557780.1)，设计了nachra6亚基全长基因的特异性引物a6-cds-f1/a6-cds-r1，利用该全长引物对5个种群的cdna进行pcr反应，得到pcr产物，经连接、转化和测序后，统计每个种群的测序结果中缺失nachra6亚基基因编码序列的阳性克隆数，除以测序的阳性克隆数，得到nachra6亚基缺失型比例。结果发现nachra6亚基缺失型比例与西花蓟马对多杀菌素的抗性呈正相关，基于此建立了“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”线性模型，获得了回归直线方程式y＝5.395x-1.1906,相关系数r2＝0.9804，其中y表示以10为底抗性倍数的对数值，x表示nachra6亚基缺失型比例。发明人利用田间种群的试验对该线性模型进行了验证，如图2所示，田间种群的数据与线性模型基本符合。对田间数据的拟合度进行卡方检验，结果表明田间种群数据与模型预测数据之间无显著差异，说明该“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”线性模型适用于田间情况。本发明提供的鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性的方法，结合rt-pcr技术及统计学方法，建立了一种快速高效的鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性水平的分子鉴定方法。由于本发明方法的核心是采用分子生物学方法进行检测和统计，因此，在检测一个地区或一定区域的田间西花蓟马的抗性水平时，只需要捕捉20～50头西花蓟马作为检测样品，获得cdna用作pcr的模板，不需要捕捉大量的西花蓟马用于生物测定以判定其多杀菌素抗性水平，大大减少了抗性测定所需的工作量，节约了时间。通过检测田间西花蓟马的nachra6亚基缺失型比例，即可参照该线性模型计算得到对应的抗性倍数，判断该西花蓟马种群的抗性水平，具有简便、快速、可靠的优点，为进一步制定防治手段和用药策略提供指导和依据。附图说明图1.西花蓟马敏感种群总rna电泳图。图2.西花蓟马nachra6亚基缺失型比例与抗性倍数的线性回归关系图，其中，横坐标为nachra6亚基缺失型比例，纵坐标为log10(抗性倍数)。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。生物材料西花蓟马的敏感种群(ivf03)、低抗种群(spin-low)、中抗种群(spin-mid)、高抗种群(spin-high)和极高抗种群(spin-r)，均为本实验室饲养的西花蓟马种群。其中，敏感种群于2003年采自北京海淀田间，此后一直以无药的豆角饲喂10年以上而得。低抗种群(spin-low)、中抗种群(spin-mid)、高抗种群(spin-high)和极高抗种群(spin-r)是以实验室饲养的西花蓟马敏感种群(ivf03)为原始种群，用多杀菌素持续汰选多代而得。汰选方法参照侯文杰，李飞，吴青君，等.(2013).西花蓟马对多杀菌素的抗性生化机制研究.应用昆虫学报，50，1042-1048。以上生物材料本实验室亦有保存，申请人声明，可自申请日起二十年内向公众免费发放用于必要的验证实验。石家庄种群(sjz)：石家庄种群西花蓟马为从石家庄田间采集而得。北京延庆种群(yq)：北京延庆种群西花蓟马为从北京延庆田间采集而得。西藏种群(xz)：西藏种群西花蓟马为从西藏拉萨田间采集而得。贵州种群(gz)：贵州种群西花蓟马为从贵州贵阳田间采集而得。北京海淀种群(hd)：北京海淀种群西花蓟马为从北京海淀田间采集而得。主要试剂2xgcbufferi(缓冲液)，购买自takara公司；lataqpolymerase(聚合酶)，购买自takara公司；peasy-t1cloningvector(克隆载体)，购买自全式金公司；以下实施例中，未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可；未特别说明的实验方法均为本领域常规方法，可按照本领域常规实验方法的体系和步骤进行。实施例1.室内实验种群对多杀菌素的抗性的生物测定对西花蓟马的室内毒力测定采用叶管药膜法，具体方法如下：配药浸管：用0.01％曲拉通溶液作为空白对照，0.01％的曲拉通溶液将药剂梯度稀释成5～6个浓度梯度。取用塑料吸管吸取药剂溶液，注满该浓度对应的1.5ml离心管，每个浓度设置4个重复。盖好盖子后将离心管水平放置于避光处，4小时后倒掉药液，用剪刀在离心管底部剪直径约5mm的小孔，然后置于通风橱中吹干待用。浸叶装管：摘取新鲜的甘蓝叶片，用蒸馏水浸湿的脱脂棉擦净叶表面。取直径1.5cm的打孔器，将叶片打成圆形小叶片，每个浓度药液中浸4片，每片浸10s，取出后置于干净的滤纸上晾干表面液体。用剪刀将干净的吸水纸剪成1cmx1cm的小纸片。用镊子将滤纸片和浸药晾干后的叶片加入对应的带药离心管中，使其水平放置于离心管中部。接虫：使用橡胶吸虫管接虫。把离心管套在吸虫管的一头，从养虫罐中吸取健壮的西花蓟马雌成虫，每次15-20头，接入离心管中。用封口膜将离心管底的小孔封住后，取下离心管并盖上盖子，水平放置。接虫后将所有的离心管水平置于托盘中，放置在25℃，光照比16：8的培养箱中。48h后取出，统计各浓度下的西花蓟马死亡率。判断西花蓟马是否死亡的标准为：用毛笔尖轻轻碰触蓟马虫体，不能爬出一个虫体长度的试虫视作已死亡。使用poloplus软件统计并分析生测数据，得到西花蓟马对该药剂的lc50值(半数致死浓度)，95％置信区间和斜率等数据。结果如表1所示，四个抗性种群(spin-low、spin-mid、spin-high、spin-r)相对于敏感种群(ivf03)的抗性倍数分别为十倍级、百倍级、千倍级和万倍级，呈阶梯式增长。表1西花蓟马室内种群对多杀菌素的敏感性测定实施例2.鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性的方法建立1、引物设计根据已知的西花蓟马烟碱型乙酰胆碱受体nachra6亚基基因序列(genbank登陆id为ku557780.1)设计特异全长引物，引物序列如下：a6-cds-f1：5’-accttctccatgtcgcgtag-3’，a6-cds-r1：5’-cagtgctcgaatcactgcac-3’。2、cdna的获得以5个室内西花蓟马种群(敏感种群、低抗种群、中抗种群、高抗种群和极高抗性种群)为研究对象，每个种群随机选取20～50头，分别提取每个种群的总rna，反转录为cdna。电泳结果表明，所提取的西花蓟马总rna包含18s和28srrna清晰条带(图1显示了西花蓟马敏感种群总rna提取效果)，说明提取的rna质量较高，其反转录的cdna可以作为下一步pcr反应的模板dna。3、nachra6亚基的基因克隆和测序以5个室内西花蓟马种群的cdna为模板，以a6-cds-f1/a6-cds-r1为引物，用takara的2xgcbufferi(缓冲液)和lataqpolymerase(聚合酶)，按照如下体系和程序进行pcr。pcr反应体系：组分用量2xgcbufferi10.0uldntps2.0ula6-cds-f1(10um)0.5ula6-cds-r1(10um)0.5ulcdna2.0ullataqpolymerase0.2ulh2o4.8ul总体积20.0ulpcr反应程序：阶段温度时间步骤195℃5min步骤295℃30s步骤363℃30s步骤472℃130s步骤5回到步骤235个循环步骤672℃10min步骤74℃不限对pcr产物进行纯化，得到目的片段。将目的片段连接到peasy-t1克隆载体中，得到连接产物。按照《分子克隆实验指南》中的热激转化法，用连接产物转化大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞，然后按照上述pcr反应体系和程序进行菌液pcr，挑选出阳性克隆进行测序。4、序列分析对测序结果进行分析和统计，获得nachra6亚基缺失型转录本数量(即，缺失nachra6亚基基因编码序列的阳性克隆数，所述缺失nachra6亚基基因编码序列指缺失部分或全部nachra6亚基基因编码序列)。通过公式“nachra6亚基缺失型转录本比例＝nachra6亚基缺失型转录本数量/总的测序的阳性克隆数量”获得各室内种群的nachra6亚基缺失型转录本比例。结果如表2所示，西花蓟马的多杀菌素抗性水平与nachra6亚基缺失型转录本比例具有正相关关系。表2西花蓟马室内种群nachra6亚基缺失型转录本比例种群缺失型转录本比例log10(抗性倍数)ivf0321.7％0spin-low42.3％0.987spin-mid57.1％2.000spin-high100％3.833spin-r100％4.556用sigmaplot软件对表2的数据进行分析并建立线性回归模型，得到如图2所示的“nachra6亚基缺失型比例-抗性倍数”线性模型。回归直线方程为y＝5.395x-1.1906，相关系数r2＝0.9804，其中y表示以10为底抗性倍数的对数值，x表示nachra6亚基缺失型转录本比例。实施例3、“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”线性模型的验证为了验证实施例2中所建立的“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”线性模型是否适用于田间情况，我们采集了石家庄、北京延庆、西藏、贵州和北京海淀五个地区的田间西花蓟马种群，对这5个田间种群的多杀菌素抗性分别进行生物测定和实施例2中的分子生物学测定。按照实施例1的方法对5个田间种群的多杀菌素抗性分别进行生物测定，得到各西花蓟马田间种群对多杀菌素的抗性倍数(如表3所示)。分子生物学测定：按照实施例2中的方法进行，提取5个田间种群的总rna并进行rt-pcr，纯化pcr产物，与peasy-t1克隆载体连接后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行测序，对测序结果进行统计分析，得到各田间种群的nachra6亚基缺失型转录本比例(如表4所示)。5个西花蓟马田间种群的生物测定结果和nachra6亚基缺失型转录本比例分别如表3、表4所示。表3西花蓟马田间种群对多杀菌素的敏感性测定表4西花蓟马田间种群nachra6亚基缺失型转录本比例将表4的数据代入实施例2中获得的“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”线性模型，结果如图2所示，可以看出田间种群的数据与线性模型基本符合。用卡方检验对田间数据的拟合度进行检验，所得卡方值为0.048(p＞0.05)，表明田间种群数据与模型预测数据之间无显著差异，说明本发明的“nachra6亚基缺失型比例－抗性倍数”线性模型同样适用于田间情况。sequencelisting<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所<120>一种鉴定西花蓟马对多杀菌素抗性的分子检测方法<130>p170125/sch<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>用于扩增西花蓟马nachra6亚基基因片段的上游引物a6-cds-f1<400>1accttctccatgtcgcgtag20<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>用于扩增西花蓟马nachra6亚基基因片段的下游引物a6-cds-r1<400>2cagtgctcgaatcactgcac20当前第1页12