本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用。
背景技术：
草莓炭疽病由真菌半知菌亚门毛盘孢属草莓炭疽菌侵染所致，草莓炭疽病的有性阶段为子囊菌亚门小丛壳属。病菌以分生孢子在发病组织或落地病残体中越冬，同时，在田间能够分生孢子借助雨水及带菌的操作工具、病叶、病果等进行传播。
草莓炭疽菌的侵染最适条件为：气温为28～32℃，相对湿度在90％以上，是典型的高温高湿型病菌。5月下旬后，当气温上升到25℃以上，草莓匍匐茎或近地面的幼嫩组织易受病菌侵染；7～9月间在高温高湿条件下，病菌传播蔓延迅速，特别是连续阴雨或阵雨2～5天或台风过后的草莓连作田、老残叶多、氮肥过量、植株幼嫩及通风透光差的苗地发病严重，可在短时间内造成草莓毁灭性的损失。近几年来，该病的发生有上升趋势，尤其是在草莓连作地，给培育壮苗带来了严重障碍。
现有草莓炭疽病的防治方法均是采用药剂进行喷洒，如嘧菌酯和嘧酰胺等。这种治疗方式不仅效果较差；同时多频次、多剂量施用后易造成草莓炭疽病菌产生较高程度的耐药性，从而导致草莓炭疽病的防治失败。因此，草莓炭疽病的防治还需尽早在幼苗期发现，避免其传播为主。
技术实现要素：
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够准确检测幼苗期草莓炭疽病的方法，有效防治草莓炭疽病的传播和蔓延，降低草莓耐药性，本发明提供了一种一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记及其应用。
技术方案：一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
表1分子标记序列
所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
优选的，所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20～50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
有益效果：(1)本发明所述分子标记能够针对幼苗期的草莓，准确检测幼苗炭疽病菌的感染情况；(2)本发明所述分子标记具有检测时间短、检测成本低和高通量的优点；(3)本发明所述分子标记特异性好、灵敏度高、结果重现性好。
附图说明
图1是实施例1～3检测结果图；
其中，m为分子量为2000bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例2
一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例3
一种用于检测草莓炭疽病菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰。
所述的分子标记在制备检测草莓炭疽病菌试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测草莓炭疽病菌的步骤包括：
(1)取样：提取草莓叶片样品的基因组dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
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