一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法与流程

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：
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高级醇类物质是白酒风味的一类重要风味物质，不但有助于白酒成香、呈味，更能增加其甜感，调节白酒口感，同时也是构成酯类的前体物质。高级醇类物质的含量过高或过低都会对白酒的风味产生不良影响，若白酒中高级醇类物质含量适宜，可使白酒的口感柔和且丰满，味道独特；但含量过高则会产生杂味异味，饮用后易上头，影响身体健康；高级醇含量不足，酒的味道将变得稀薄单调。因此控制高级醇在白酒中的含量在适量的范围内，使得醇类物质在白酒风味中发挥积极作用对改善白酒酒质显得尤为重要。

对于调节酿酒酵母中高级醇的合成，bat2基因在其中起着关键性的作用，bat2基因编码的氨基酸转氨酶控制的转氨作用是酿酒酵母支链氨基酸分解代谢合成高级醇的第一步。研究发现使用弱化bat2基因启动子的方法，可以构建降低高级醇的酿酒酵母菌株，该突变株所得的发酵最终产物中高级醇含量通过启动子工程发生改变但菌株的生长性能和发酵性能不受影响。

氨基酸转氨酶的酶活力的改变会影响酵母细胞产高级醇的能力。通过对bat2基因启动子的弱化，进而实现bat2基因的表达强度的调控，最终实现对酿酒酵母细胞最终发酵产物中高级醇含量的控制。采用融合pcr方法可以实现基因片段的精确无缝拼接，而且不受酶切位点的限制，避免基因改造带来的未知影响。该方法利用融合pcr和整合型载体质粒yiplac211介导的两步整合方法，在无外源基因残留的前提下，实现对bat2启动子3’端的部分敲除。构建的工程菌株可以安全应用到酿酒生产中，同时融合pcr介导的两步整合方法和启动子截断调控目的基因表达的方法可以广泛应运到酵母以及其他微生物的基因表达调控，促进了基因表达调控的发展。

技术实现要素：
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本发明解决的技术问题是提供一株适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了适量产高级醇的酿酒酵母菌株及其构建方法。获得适量产高级醇酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cicc32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。

所述适量产高级醇的酿酒酵母菌株在正常的生长性能和发酵性能不受影响的情况下，在30℃静止玉米浓醪发酵约84小时产生的高级醇总量相对于发菌株降低了28.3％。正丙醇、异丁醇、异戊醇的含量分别降低了29.2％，34.6％，19.9％。

所述适量产高级醇的酿酒酵母菌株具体可以通过对出发菌株酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)cicc32315的bat2基因启动子3’端进行部分敲除(截断启动子的166bp)来实现。

上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如josephsambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

用pcr方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的ura3基因突变；

用pcr方法分别扩增788bp的bat2启动子部分缺失序列，以及1000bp的bat2表达区序列，然后通过融合pcr完成两段序列的无缝融合；将该片段通过双酶切整合至酵母整合质粒yiplac211上，以获得能够进行整合敲除的质粒；

在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入到ura3缺陷型中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，利用含有5-氟乳清酸的合成培养基平板反向筛选，获得发生第二步整合重组的酵母突变株；

用二步整合重组的酵母突变株和带有正常ura3基因的α型菌株在kac培养基上进行杂交产孢，然后分出带有正常ura3基因的a型及α型酵母突变菌株，以此方法完成ura3标记基因的回复。

本发明所述酿酒酵母菌株可应用于白酒发酵生产中。

有益效果：

1、本发明提供一种适量产高级醇的酿酒酵母菌株以及构建方法，解决了启动子工程调节高级醇产量过高的问题。

2、本发明提供的适量产高级醇的酿酒酵母菌株是在保持优良发酵性能的前提下，编码氨基酸转氨酶的bat2基因的表达量有一定程度的降低，进而降低了氨基酸转氨代谢的程度，使得酵母细胞的高级醇的产量发生变化，为解决白酒生产中高级醇类物质含量过高的问题提供了解决思路，而且具有重要的市场价值。

3、本发明所用的靶序列敲除方法，避免了酵母敲除过程中筛选标记残留的问题，满足自克隆的条件，可用于工业安全生产。且本方法在基因精确修饰方面具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1为cly12aδu的表型验证

图2为质粒构建示意图以及bat2启动子截断策略；

图3为融合pcr构建质粒以及两步同源重组的构建流程示意图；

图4为重组质粒的pcr验证图；融合pcr电泳图；泳道m为5000dnamaker；

图5为第一步整合重组的菌株的电泳验证图；泳道m为5000dnamaker；

图6为发生第二步整合重组的菌株的电泳验证图；泳道m为5000dnamaker；

图7为杂交产孢回复ura3基因；a-b分别为cly12aδu、cly12a-δp与cly12α杂交的二倍体。a-b分别为杂交二倍体产孢。

图8为亲本菌株和酵母重组菌株的生长曲线；

图9为亲本菌株和酵母重组菌株的风味物质含量的实验结果图。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：bat2启动子部分缺失的酿酒酵母菌株的构建

本实例所用的出发菌株cicc32315。所述大肠杆菌dh5a购自takara公司。所述ypd培养基为通用的完全培养基，固体培养基含2％进口琼脂粉。

根据genebank中的酵母基因组数据和yiplac211质粒基因序列，设计了下述引物。

表1本实施例中所用到的引物

注：小写字母表示酶切位点，下划线表示融合pcr所用引物的重叠序列。

(1)带有缺陷ura3基因的酿酒酵母cly12aδu的构建

使用solarbio公司的酵母基因组提取试剂盒，提取实验室菌株w303-1a的基因组。利用引物对ura3-f和ura3-r，以w303-1a的基因组为模板，pcr扩增菌株w303-1a突变ura3片段。经过试剂盒回收以后，将片段通过醋酸锂化学转化法导入到亲本菌株cicc32315中，通过突变ura3与正常ura3之间的同源重组，实现标准菌株的ura3基因突变。转化后的菌悬液，涂布于补加了5-氟乳清酸(5-foa)和尿嘧啶(uracil)酵母合成培养基(sd)平板上，30℃培养48h，获得带有缺陷ura3基因的酿酒酵母cly12aδu。获得的突变株经过表型验证确定正确，如图1所示cly12aδu在酵母合成培养基上不长，在ypd平板上生长良好。

(2)整合敲除质粒yiplac211-δpd的构建

首先，以亲本菌株cicc32315的基因组为模板，使用引物pb2-u和pb2-d通过pcr获得788bp的bat2启动子部分缺失的基因序列，pcr反应条件：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃48s，35个循环；72℃10min，命名为δp。同时使用引物rb2-u和rb2-d通过pcr获得1000bp的bat2基因表达区序列，pcr反应条件：95℃5min；98℃10s，55℃5s，72℃60s，35个循环；72℃10min，命名为d。

分别进切胶回收(试剂盒)后，然后以δp和d的混合物为模板，加入引物pb2-u和rb2-d进行融合pcr，获得无缝融合片段δpd。进切胶回收(试剂盒)后，分别用bamhi和ecori限制性内切酶对整合质粒及融合片段进行双酶切后，再进行连接，构建重组质粒yiplac211-δpd成功。融合pcr策略和启动子截断如图2所示，质粒构建流程图如图3所示。图4为重组质粒的pcr验证图。

上述融合pcr法为本领域公知的采用具有互补末端的引物，形成具有重叠序列pcr产物，通过pcr产物重叠序列延伸，从而将任意dna片段连接起来的方法，此技术不需要内切酶的消化和连接酶的处理，就可实现dna片段的体外连接，这使得整合质粒经过两步整合重组后，酵母基因组不会残留外源酶切位点。

(3)bat2启动子部分缺失的酿酒酵母突变株的构建

在下同源臂序列片段d中选取spei酶切重组质粒yiplac211-δpd；用醋酸锂化学转化法将线性化的重组质粒yiplac211-δpd导入缺陷型酵母菌株cly12aδu中，经过两步整合重组后，得到bat2基因启动子3’端部分缺失的酿酒酵母，两步整合重组过程如图3。

第一步整合重组的发生，是由于导入的线性化质粒与酵母基因组的同源部分发生整合，从而将整个质粒带入基因组。转化后的菌悬液，涂布于不含尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48h，获得发生第一步整合重组的酵母菌株，命名为cly12aδu-yb。采用byip-1u、byip-1d、byip-2u和byip-2d为验证引物，进行pcr验证筛选。当使用引物对byip-1u和byip-1d进行pcr验证时，因为下游引物byip-1d的序列在yiplac211载体质粒上，所以酵母菌株cly12aδu无特异性条带，而一步整合重组菌株cly12aδu-yb应有一条大小为2000bp左右的条带；当使用引物对byip-2u和byip-2d进行pcr验证时，因为上游引物byip-2u的退火序列在yiplac211载体质粒上，所以酵母菌株cly12aδu无特异性条带，而一步整合重组菌株cly12aδu-yb应有一条大小为1330bp左右条带。pcr产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳结果见图5。转化子与对照比较结果显示，线性化的质粒整合到目的位点。

经过筛选和鉴定的一步整合重组酵母菌株cly12aδu-yb，取一环接到5ml液体ypd培养基中，30℃下200rpm振荡12h后，稀释10倍涂布于含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的酵母合成培养基平板上，30℃培养48h，获得发生第二步整合重组的酵母菌株，第二步整合重组后，出现两种结果：一，如果下游同源序列(d)形成的重复序列之间整合，则酵母回复成出发菌株cly12aδu；二，如果上游同源序列(p)形成的重复序列之间发生整合，则酵母成功整合部分缺失bat2启动子的整合重组菌株；实现启动子的部分敲除，同时靶位置上不引入任何外源基因。挑选所得到的单菌落，采用引物对byip-1u和byip-1d、byip-2u和byip-2d以及bat2-u和bat2-d分别进行pcr验证。筛选出启动子靶序列部分得到精确敲除的转化子，命名为cly12aδu-p。pcr产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳结果见图6。转化子与对照比较结果显示，bat2启动子成功被部分敲除。

(4)二步重组酿酒酵母菌株突变ura3基因的回复

同本实例中(1)所述的方法，二步重组酿酒酵母菌株均为a型单倍体菌株，将其分别于ura3基因正常的α型菌株cly12α进行杂交，在28℃，kac培养基培养3-4天镜检观察是否生孢，待生孢时将其分别取适量和500μl的生理盐水混匀并加入蜗牛酶进行破壁，30℃反应3-6h，然后在50℃水浴10min杀死营养体，涂布于yepd培养基中挑取较小菌落分别用mat-f，mat-α和mat-a三个引物进行验证，条带大于500以上为a型，然后用pb2-u和pb2-d，rb2-u和rb2-d，bat2-u和bat2-u分别再次进行pcr验证。得到的酵母菌株即为ura3基因回复的菌株，命名为cly12a-δp。杂交产孢结果见图7。

实施案例2：bat2启动子部分缺失的酿酒酵母菌株生长性能测定实验

测定亲本菌株cicc32315及其转化子在30℃条件下的生长性能，结果如图8。结果显示，bat2启动子的部分缺失并没有影响酵母的生长性能。

实施案例3：出发菌株以及四株改造菌株的玉米原料浓醪发酵实验

(1)cly12a-δp与亲本菌株的玉米原料浓醪发酵实验

将亲本菌株cicc32315及转化子cly12a-δp分别同时进行玉米浓醪发酵实验，发酵工艺路线：玉米粉→浸泡→液化→糖化→冷却→接菌→发酵→蒸酒→测定指标；

工艺条件：

浸泡条件：60～70℃，浸渍20min；液化条件：85～90℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化90min；糖化条件：55～60℃，加入糖化酶，糖化20min，加入营养盐和酸性蛋白酶，30℃反应20min；

配料：玉米粉60g，水180ml，耐高温α-淀粉酶2×10⁵u/ml，30μl，糖化酶200u/ml，90μl，2.5×10³u/ml酸性蛋白酶1.2ml；营养盐1ml(mgso4150g/l、kh2po475g/l、尿素81g/l，过滤，4℃保存)；接种量：7.5％，30℃放置12h，再放入30℃，发酵84h，发酵结束后测定各菌株的发酵性能(co2失重、乙醇体积分数、残糖等)；结果见表2。

表2菌株发酵主要性能比较