本申请涉及肿瘤靶向治疗
技术领域：
：。具体来说，本申请涉及细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其在治疗肿瘤中的应用。
背景技术：
：：近年来，细菌致病机理研究领域的一个重要进展是发现了细菌分泌系统。在革兰氏阴性菌中已经报道了6种分泌系统，细菌的很多分泌蛋白通过不同的机理被输送到细菌外，并与宿主细胞发生直接作用以发挥致病性。许多革兰氏阴性病原菌在感染其宿主(人类)的过程中往往通过三型分泌系统(typeⅲsecretionsystem,t3ss)将一些毒力因子注入宿主细胞内。这些毒力因子又称为效应蛋白(effectorprotein)，能够以十分有效的方式干扰宿主细胞的重要信号转导通路如mapk、nf-κb和泛素化修饰通路等，使其功能紊乱。最先被发现是一种细胞周期抑制因子(cycleinhibitingfactor,cif)。其中比较重要的一种是革兰氏阴性菌中的三型分泌系统(typeiiisecretionsystem，t3ss)。t3ss在沙门氏菌(salmonella)、霍乱弧菌、大肠杆菌等细菌中都有发现，并与多种细菌病害有关，例如痢疾、鼠疫等等。相关的效应蛋白可以通过t3ss途径从细菌胞质直接进入宿主细胞发挥作用。并且，在医药研究中，通过把相关效应蛋白的信号肽连接到相应疫苗或药物上，也可以直接进行细胞水平的药物治疗。细菌效应蛋白cif(cycleinhibitingfactor)是活性很强的谷氨酰胺脱氨酶。进入宿主细胞后，cif可以与nedd8分子结合，把nedd8的40位谷氨酰胺脱氨变成谷氨酸，生成nedd8-q40e蛋白，造成细胞分裂周期的紊乱和细胞毒性。cif脱氨酶活性中重要的氨基酸是第109位半胱氨酸(c)。当把野生型的第109位半胱氨酸(c)变成丙氨酸(a)，即cifc/a突变时，该突变能够消除效应蛋白的脱氨酶活性，使得cif不能再把nedd8变成nedd8-q40e。nedd8是类泛素蛋白(ulp)，由81个氨基酸组成，通过类泛素化修饰(neddylation)来降解蛋白。类泛素化修饰需要e1激活酶、e2结合酶、e3连接酶和去nedd化酶等。类泛素化修饰的典型底物是cullins，cullins是cullin-ringe3泛素连接酶复合物的组成蛋白。类泛素化修饰的第一步是nedd8激活酶(nedd8activatingenzyme，nae)激活nedd8；然后活化的nedd8转移到e2(nedd8结合酶ubc12)上；第三步，e3(nedd8连接酶)与e2作用，将nedd8转移到底物上，然后e3与e2分离，再进行下一个蛋白的降解。类泛素化中有一个e1，即nae；有两个e2，即ubc12和ube2f；有多种e3。小分子mln4924可以抑制nae，cif效应蛋白会把nedd8变成nedd8-q40e，都会抑制类泛素化介导的蛋白降解，对细胞造成毒性。但是当把cif效应蛋白用于肿瘤细胞时，抑制类泛素化降解，会造成细胞内大量蛋白(例如p21、p27、cdt1或iκbα)的积聚，造成细胞衰老和凋亡，起到抑制肿瘤增长的左右。最近报道了致病性大肠杆菌来源的cif效应蛋白能够特异抑制宿主细胞crl泛素连接酶的活性研究发现，cif效应蛋白在结构上具有与木瓜蛋白酶相似的折叠模式和保守的催化位点三联体(cys-his-gln)，能够特异对nedd8分子的第40位谷氨酰氨脱氨修饰，使之变成谷氨酸，受到脱氨化nedd8分子修饰的crl泛素连接酶的活性完全受到抑制，因而可导致胞内crl泛素连接酶底物蛋白(如p27、p21、cdt1、wee1、roha和iκbα等)因降解受阻而积聚，诱发一系列细胞病变如应力纤维形成、细胞周期捕获以及细胞凋亡等(cuij等，glutaminedeamidationanddysfunctionofubiquitin/nedd8inducedbyabacterialeffectorfamily.science.2010；329(5996):1215-121；jubeling等，pathogenicbacteriatargetnedd8-conjugatedcullinstohijackhost-cellsignalingpathways.plospathog.2010；6(9):e1001128；morikawah等，thebacterialeffectorcifinterfereswithscfubiquitinligasefunctionbyinhibitingdeneddylationofcullin1.biochembiophysrescommun.2010；401(2):268-274.)；yaoq等，abacterialtypeiiieffectorfamilyusesthepapain-likehydrolyticactivitytoarrestthehostcellcycle.procnatlacadsciusa.2009；106(10):3716-3721；和samba-louakaa等，theenteropathogenicescherichiacolieffectorcifinducesdelayedapoptosisinepithelialcells.infectimmun.2009；77(12):5471-5477.)利用减毒细菌菌株的肿瘤靶向性定向释放治疗基因已成为肿瘤基因治疗领域的新亮点。鼠伤寒沙门氏菌vnp20009株是这些菌株中的一个典型代表。vnp20009株的毒性显著减弱。它在小鼠、灵长类动物以及人体i期临床试验中均表现出高度的安全性(lowkb等，lipidamutantsalmonellawithsuppressedvirulenceandtnfalphainductionretaintumor-targetinginvivo.natbiotechnol.1999；17(1):37-41和lowkb等，constructionofvnp20009:anovel,geneticallystableantibiotic-sensitivestrainoftumor-targetingsalmonellaforparenteraladministrationinhumans.methodsmolmed.2004；90:47-60)。沙门氏菌有两个t3ss，spi1主要在细菌被宿主细胞内吞前发挥作用，spi2在细菌的胞内寄生过程中发挥作用。鸟苷酸交换因子可以帮助活化ras蛋白。sope2是鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)的鸟苷酸交换因子。但据发明人所知，目前还没有通过鼠伤寒沙门氏菌将治疗性蛋白靶向地递送到肿瘤细胞内的报道。为此，本领域迫切需要提供一种利用细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其应用。技术实现要素：针对现有技术中的缺点，本申请采用具有高度肿瘤靶向性和安全性的减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009株为载体，通过乙醇脱氢酶厌氧型启动子调控spi-1三型分泌系统效应蛋白分泌信号肽与cif效应蛋白的融合表达,以实现cif效应蛋白从胞外到胞内的定向递送。为了解决上述技术问题，本发明提供下述技术方案。根据本申请的一个方面，本申请提供了一种利用细菌靶向投递蛋白的系统，所述系统包括启动子、蛋白分泌信号肽、编码蛋白的核酸，所述系统在细菌中表达所述蛋白，所述蛋白分泌信号肽时介导所述蛋白进入细胞的信号肽。根据本申请的某些实施方式，所述系统是四环素诱导表达系统。根据本申请的某些实施方式，所述细菌是革兰氏阴性菌。根据本申请的某些实施方式，所述革兰氏阴性菌是沙门氏菌，根据本申请的某些实施方式，所述沙门氏菌是沙门氏菌vnp20009株。根据本申请的某些实施方式，所述核酸编码细菌效应蛋白cif。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子(psope)或乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)。根据本申请的某些实施方式，所述蛋白分泌信号肽是sope蛋白分泌信号肽。根据本申请的一个方面，本申请提供了所述系统在治疗肿瘤中的用途。根据本申请的某些实施方式，所述肿瘤是结肠癌。附图说明图1是治疗性蛋白胞内递送载体的构建，该构建分别由沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子(psope)和乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)驱动sope蛋白分泌信号肽与gsk-3β和ha双标签融合(sope-ha-gsk)表达的重组载体p-psope-sope-ha-gsk(sepidno.:6)和p-padhe-sope-ha-gsk。本发明拟以融合蛋白sope-ha-gsk为模型，用沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子作为阳性对照，研究由减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009株、乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)和sope蛋白分泌信号肽组成的厌氧表达体系在肿瘤组织内胞内定向递送治疗性蛋白的能力；ha为检测标签，gsk为检测磷酸化的标签，在细菌中，蛋白无法被磷酸化，在细胞中，蛋白可以被磷酸化；图2是蛋白质组学技术发现了乙醇脱氢酶(adhe)在厌氧培养条件下高量表达,从而实现沙门氏菌厌氧型启动子的筛选；图3是对沙门氏菌厌氧型启动子进一步分析，发现其中包含有经典的启动子活性区以及相关的调控区；图4是四环素诱导表达系统(tet-on系统)的构建，该构建可分别诱导野生型cif效应蛋白(ha-cifwt)和cif效应蛋白突变体(ha-cifc/a)表达的重组载体，以及用作阴性对照的空载体pgl3(pgl3-basic,无sv40增强子)；图5是把图4构建的质粒使用lipo2000转染293t细胞；然后用dox诱导，再使用western印记方法来检测蛋白的表达，moi指感染时沙门氏菌与细胞数量的比值；图6是效应蛋白sope分泌肽介导的治疗性蛋白从胞外到胞内的定性递送；携带重组质粒p-psope-sope-ha-gsk(ha-gsk)的重组减毒沙门氏菌(vnp-ha-gsk)不表达磷酸化的sope-ha-gsk融合蛋白；只有当感染肿瘤细胞过程中能够将sope-ha-gsk融合蛋白注入到肿瘤细胞内，并且当sope-ha-gsk融合蛋白进入肿瘤细胞之后，才能被磷酸化，vnp为未携带任何重组质粒的vnp20009菌株。图7是利用四环素诱导表达系统(tet-on系统)构建可分别诱导效应蛋白表达的重组载体；选用对mln4924敏感的人结肠癌细胞株hct116位模型，建立由tet-on系统分别调控ha表达的肿瘤细胞稳定株；同时建立空载体稳定株作为空白对照组，用westernblot鉴定cif效应蛋白的表达,可见在细胞内能检测到磷酸化的gsk标签蛋白，提示重组载体被导入细胞内，在细菌内只检测到ha标签蛋白，提示载体电转入沙门氏菌体内；图8是质粒pspax2的图谱；图9是质粒pmd的图谱；图10是使用含有cif-wt和cif-c/a质粒的慢病毒分别处理人结肠癌细胞hct116和sw480，使用仅含有gfp的质粒的慢病毒作为对照，再使用dox诱导蛋白的表达，平行试验三次，moi是25；图11左侧图是在不加入dox诱导的情况下，当使用cif-wt处理hct116细胞中时，p21和p27蛋白的积聚，而对于gfp阴性对照和cif-c/a突变处理的细胞，p21和p27的含量比较低；图11右侧图的结果显示使用慢病毒处理hct116细胞后，cif-wt和mln处理可以抑制类泛素化降解，造成gfp-dgn的积累，而mock对照和cif-c/a突变则不能抑制类泛素化，gfp-dgn含量仍然比较低；图12是使用cif-wt处理细胞之后，使用对照组sirna(si-ctrl)处理，会造成p21和p27的积聚；使用cif-wt处理细胞之后，再使用p21的sirna处理降低p21的积聚，p27的sirna处理降低p27的积聚；图13表明cif-wt处理细胞之后，使用对照组sirna(si-ctrl)处理，造成细胞的大量死亡；而cif-wt处理细胞之后，使用p21的sirna和p27的sirna处理细胞可以提高细胞的存活。具体实施方式术语定义细菌分泌系统是近年来，细菌致病机理研究领域的一个重要进展。在革兰氏阴性菌中已经报道了6种分泌系统，细菌的很多分泌蛋白通过不同的机理被输送到细菌外，并与宿主细胞发生直接作用以发挥致病性。其中比较重要的一种是革兰氏阴性菌中的三型分泌系统(typeiiisecretionsystem，t3ss)。t3ss在沙门氏菌(salmonella)、霍乱弧菌、大肠杆菌等细菌中都有发现，并与多种细菌病害有关，例如痢疾、鼠疫等等。相关的效应蛋白可以通过t3ss途径从细菌胞质直接进入宿主细胞发挥作用。并且，在医药研究中，通过把相关效应蛋白的信号肽连接到相应疫苗或药物上，也可以直接进行细胞水平的药物治疗。术语“细菌效应蛋白cif(cycleinhibitingfactor)”是活性很强的谷氨酰胺脱氨酶。进入宿主细胞后，cif可以与nedd8分子结合，把nedd8的40位谷氨酰胺脱氨变成谷氨酸，生成nedd8-q40e蛋白，造成细胞分裂周期的紊乱和细胞毒性。cif脱氨酶活性中重要的氨基酸是第109位半胱氨酸(c)。当把野生型的第109位半胱氨酸(c)变成丙氨酸(a)，即cifc/a突变时，该突变能够消除效应蛋白的脱氨酶活性，使得cif不能再把nedd8变成nedd8-q40e。nedd8是类泛素蛋白(ulp)，由81个氨基酸组成，通过类泛素化修饰(neddylation)来降解蛋白。类泛素化修饰需要e1激活酶、e2结合酶、e3连接酶和去nedd化酶等。类泛素化修饰的典型底物是cullins，cullins是cullin-ringe3泛素连接酶复合物的组成蛋白。类泛素化修饰的第一步是nedd8激活酶(nedd8activatingenzyme，nae)激活nedd8；然后活化的nedd8转移到e2(nedd8结合酶ubc12)上；第三步，e3(nedd8连接酶)与e2作用，将nedd8转移到底物上，然后e3与e2分离，再进行下一个蛋白的降解。类泛素化中有一个e1，即nae；有两个e2，即ubc12和ube2f；有多种e3。小分子mln4924可以抑制nae，cif效应蛋白会把nedd8变成nedd8-q40e，都会抑制类泛素化介导的蛋白降解，对细胞造成毒性。但是当把cif效应蛋白用于肿瘤细胞时，抑制类泛素化降解，会造成细胞内大量蛋白(例如p21、p27、cdt1或iκbα)的积聚，造成细胞衰老和凋亡，起到抑制肿瘤增长的左右。沙门氏菌三型分泌系统分为spi-1和spi-2两种类型：前者在细菌感染早期阶段负责把一批效应蛋白分泌并转导到宿主细胞内，以帮助细菌侵入；后者则在宿主细胞内行使功能，通过分泌效应蛋白促进细菌在胞内生存和复制。基于三型分泌系统在沙门氏菌感染过程中的作用以及其分泌和转导蛋白的能力，沙门氏菌及其三型分泌系统已被广泛用作疫苗抗原(包括肿瘤抗原)的胞内投递系统。此外也发现，利用沙门氏菌直接感染肿瘤组织或肿瘤细胞，细菌能够把所表达的外源蛋白通过三型分泌系统直接注入肿瘤细胞内。鸟苷酸交换因子可以帮助活化ras蛋白。sope2是鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)的鸟苷酸交换因子。实施例实施例1：配置相关的培养基相关培养基的配方如下文表1到表3所示：表1.普通细菌lb配制表2.沙门氏菌lb配制表3.电转化vnp诱导表达sope2蛋白的lb配制培养基按照如下方法配置：1.称量：按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、nacl放入烧杯中。2.溶化：在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，需不断搅拌，最后补足所失的水分。3.调ph：在未调ph前，先用精密ph试纸测量培养基的原始ph值，如果ph偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/lnaoh，边加边搅拌，并随时用ph试纸测其ph值，直至ph达7.6。反之，则用1mol/lhcl进行调节。注意ph值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。于有些要求ph值较精确的微生物，其ph的调节可用酸度计进行(使用方法，可参考有关说明书)。4.分装：将配制的培养基分装入三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。5.加塞：培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6.包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7.灭菌：将上述培养基以1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。8.无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。在后续实施例中使用无菌的培养基。实施例2：沙门氏菌胞内投递治疗性蛋白系统的建立治疗性蛋白胞内递送载体的构建如图1所示，该构建分别由沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子(psope)和乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)驱动sope蛋白分泌信号肽与gsk-3β和ha双标签融合(sope-ha-gsk)表达的重组载体p-psope-sope-ha-gsk和p-padhe-sope-ha-gsk。本发明拟以融合蛋白sope-ha-gsk为模型，用沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子作为阳性对照，研究由减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009株、乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)和sope蛋白分泌信号肽组成的厌氧表达体系在肿瘤组织内胞内定向递送治疗性蛋白的能力；ha为检测标签，gsk为检测磷酸化的标签，在细菌中，蛋白无法被磷酸化，在细胞中，蛋白可以被磷酸化。体外细胞投递蛋白：1.制备spi-1培养基：lb内含0.3mnacl，高压后再分管(12ml/管)，室温放置待用；2.用无nacllb过夜培养沙门氏菌vnp-wt和vnp-sope2-ha-gsk；3.spi-1效应蛋白的诱导：按1:50加入过夜培养的细菌，将培养管密封后置37c静止培养过夜(约12小时)；4.提前准备hct116或hela细胞，密度约为80-90％。5.测定细菌od600:按1:50感染细胞1h(注：需用无任何抗生素培养基)，然后用pbs充分润洗干净，加入含庆大霉素的培养基，继续培养2h后收获细胞制备蛋白；6.wb分析p-gsk和ha水平。7.ifa进行目的蛋白的胞内定位。注意：1)细胞培养基需要预热使用；2)细胞裂解液需要加入磷酸酶抑制剂pi肿瘤组织内投递蛋白：1.用c57bl6小鼠建立llc移植瘤模型(15只小鼠)2.用vnp-wt和vnp-sope2-ha-gsk感染小鼠(ip注射106cfu/只)，分别在感染后24和48小时收获肿瘤组织制备蛋白和福尔马林固定，供wb和ihc检测。结果如图2和图3所示，图2是按照文献进行沙门氏菌厌氧型启动子的筛选(molcellproteomics.2011；10(6):m111.009399.)，其中蛋白质组学技术发现了乙醇脱氢酶(adhe)在厌氧培养条件下高量表达。图3是对其启动子区域进一步分析，发现其中包含有经典的启动子活性区以及相关的调控区。实施例3：构建相关的引物pbr322载体如图所示。pbr322载体具有sope2启动子，sope2启信号肽，ha标签和gsk标签。pbr322载体可以由沙门氏菌运送进入肿瘤细胞，gsk标签会在细胞内被磷酸化，因而通过检测gsk的磷酸化来鉴定治疗性蛋白从胞外到胞内的靶向投递。pbr322-sope2pro::sope2-ha-gsk(sepidno.:1)载体的构建pbr322-nirbpro::sope2-ha-gsk(sepidno.:2)载体的构建pbr322-sope2pro::sope2-ha-gsk-cif(sepidno.:3)载体的构建pbr322-nirbpro::sope2-ha-gsk-cif(sepidno.:4)载体的构建腺病毒载体phbad-mcmv-ha-cif-cmv-gfp(sepidno.:5)的构建实施例4：cif效应蛋白表达载体的构建本实施例构建cif效应蛋白表达载体。该载体是利用四环素诱导表达系统(tet-on系统)构建可分别诱导野生型cif效应蛋白(ha-cifwt)和cif效应蛋白突变体(ha-cifc/a)表达的重组载体。ha为检测标签；ha-cifc/a中的突变点指由野生型的第109位半胱氨酸(c)变成丙氨酸(a)，该突变能够消除效应蛋白的脱氨酶活性。pcr目的基因是cif-wtcif-c/a，载体构建详细步骤如下：1.稀释cif引物1000pmol/μl为100pmol/μl，取5μl原装引物加ddh2o45μl。2.按照如下pcr体系配置pcr混合液cif-r21.5ulcif-f21.5ul酶5ul底物1ul10x缓冲液5ulh2o41ul体系50ul反应条件：将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上，执行扩增。一般：在95℃预变性2min，进入循环扩增阶段：95℃15s→58℃30s→68℃90s，循环32次，最后在68℃保温7min。结束反应，pcr产物放置于4℃待电泳检测。3.酶切后，dna电泳鉴定pcr反应产物分子量大小4.然后回收胶。按dna胶回收试剂盒说明操作。5.进行连接反应。6.细胞转化大肠杆菌，涂板。7.挑菌落进行pcr反应鉴定。8.摇菌，扩增，小提质粒。9.大提质粒。10.dna测序。四环素诱导表达系统(tet-on系统)构建可分别诱导野生型cif效应蛋白(ha-cifwt)和cif效应蛋白突变体(ha-cifc/a)表达的重组载体，以及空载体pgl3(pgl3-basic,无sv40增强子)用作阴性对照。质粒如图4所示。把这些质粒使用lipo2000转染293t细胞。转染后24h加入dox诱导，再24h后收集细胞，并使用western印记检测，用肌动蛋白作为蛋白加样的对照。western结果如图5显示，moi指含义是感染时沙门氏菌与细胞数量的比值。由图5可以看出，没有加入dox诱导时，没有ha-cifwt和ha-cifc/a蛋白的表达；加入dox诱导之后，有ha-cifwt和ha-cifc/a蛋白的表达。结果表明cif效应蛋白表达载体可以在dox的诱导之下表达ha-cifwt和ha-cifc/a蛋白。实施例5：治疗性蛋白胞内递送载体的构建本实施例构建治疗性蛋白胞内递送载体。构建分别由沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子(psope)和乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)驱动sope蛋白分泌信号肽与gsk-3β和ha双标签融合(sope-ha-gsk)表达的重组载体p-psope-sope-ha-gsk和p-padhe-sope-ha-gsk。本实验拟以融合蛋白sope-ha-gsk为模型，用沙门氏菌三型分泌效应蛋白sope启动子作为阳性对照，研究由减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009株、乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)和sope蛋白分泌信号肽组成的厌氧表达体系在肝脏肿瘤组织内胞内定向递送治疗性蛋白的能力。pcr目的基因是cif-wt和cif-c/a，载体构建的详细步骤如下：1.稀释cif引物1000pmol/μl为100pmol/μl，取5μl原装引物加ddh2o45μl。2.按照如下pcr体系配置pcr混合液cif-r21.5ulcif-f21.5ul酶5ul底物1ul10x缓冲液5ulh2o41ul体系50ul反应条件：将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上，执行扩增。一般：在95℃预变性2min，进入循环扩增阶段：95℃15s→58℃30s→68℃90s，循环32次，最后在68℃保温7min。结束反应，pcr产物放置于4℃待电泳检测。3.酶切后，dna电泳鉴定pcr反应产物分子量大小4.然后回收胶。按dna胶回收试剂盒说明操作。5.进行连接反应。6.细胞转化大肠杆菌，涂板。7.挑菌落进行pcr反应鉴定。8.摇菌，扩增，小提质粒。9.大提质粒。10.dna测序。验证重组质粒成功。实施例6：重组沙门氏菌的制备把质粒p-psope-sope-ha-gsk和p-padhe-sope-ha-gsk分别电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009株，筛选重组细菌rvnp20009(p-psope-sope-ha-gsk)和rvnp20009(p-padhesope-ha-gsk)；利用sds-page和western印记确认融合蛋白分别在普通培养条件和厌氧培养条件下的表达。制备沙门氏菌母液、lb沙门氏菌板、氨苄抗生素、庆大霉素和蛋白磷酸化酶抑制剂。1)：电转化沙门氏菌的制备1)将-80℃中30％甘油保存的vnp20009菌株，采用无菌枪头挑取少许置于加入3ml沙门氏菌lb培养液15ml离心管中，置于37℃摇床下过夜培养，第二天取出置于4℃冷柜中保存，以此做为沙门氏菌母液，以留备用2)另取一15ml离心管，加入3ml沙门氏菌lb培养液/每一转化质粒，另加入母液100μl，置于37℃摇床下培养3h—4h，待检测od值为0.6—1.0时上，以此作为沙门氏菌子液，以留备用。3)取od＝0.6的沙门氏菌子液，分到高压灭菌的ep管中，5000rpm离心2min。倒掉上清液，高压后的ddh2o洗两遍，5000rpm再次离心2min4)取配好的10％甘油250μl，分别加入ep管中，悬浮沙门氏菌至最终体积为250μl，此为感受态的沙门氏菌5)取出感受态的沙门氏菌250μl，加入10μlpbr-sope-ha-gsk重组质粒，置于冰水浴中5min。6)将步骤6中感受态的沙门氏菌和重组质粒混合液加入电转杯中，放入电转移，设置好如下程序，pulse进行电转。7)电转后的混合液中加入900μl沙门氏菌lb培养液，于无菌操作台上转移到ep管中，置于冰上。8)取出100μl混合液涂含有氨苄抗性的沙门氏菌琼脂糖固体培养基，剩余混合液6000rpm离心2min，倒掉上清液，剩余液体混匀全部涂第二块板。倒置于37℃温箱中培养过夜。2)：电转化的沙门氏菌鉴定1)观察菌落生长情况，取灰白色沙门氏菌独立生长的菌斑为靶点，挑菌加入含3ml沙门氏菌lb培养液的15ml离心管中，置于37℃摇床下培养6h—8h,。2)进行pcr鉴定，鉴定产物dna电泳分离，观察分子量大小。3)pcr产物鉴定体系按照如下配方和程序设置反应体系：sope2-r21ulsope2-f1uldntp5ul缓冲液4ultaq酶0.3ulh2o39ul体系50ul反应条件：将上述混合液稍加离心，立即置pcr仪上，执行扩增。一般：在95℃预变性2min，进入循环扩增阶段：95℃15s→58℃30s→68℃90s，循环32次，最后在68℃保温7min。结束反应，pcr产物放置于4℃待电泳检测。4)取两支含3ml沙门氏菌lb培养液的15ml离心管，加入步骤一中剩余菌液100μl，另取阴性对照组vnp于含3ml沙门氏菌lb培养液的15ml离心管置于37℃摇床下培养过夜。3)：电转化的沙门氏菌感染hct116细胞1)-80℃冰箱取出已经电转化的沙门氏菌和阴性对照的沙门氏菌少许，加入含相应3ml沙门氏菌lb培养液的15ml离心管中，置于37℃摇床下培养过夜。2)取出步骤一中培养过夜的已经电转化的菌液和阴性对照的沙门氏菌液各100μl，加入含相应15ml沙门氏菌lb(含有氯化钠)培养液的15ml离心管中，置于37℃摇床下摇3-4h。3)于分光光度仪定时监控转化沙门氏菌和未转化沙门氏菌od600值(培养2小时后每半小时测定一次)，同时以lb+0.3mm氯化钠培养基各1ml为对照，直到od＝0.7，取出菌液放于冰上。4)计算细菌数量：y＝3.7011x+0.0156按照moi＝100(100个细菌感染1个细胞的比例)感染细胞。5)根据公式算出y值为2.6*108个细菌/ml，每个培养皿计数细胞约有hct116细胞250万，拟需要2.6*108个细菌，即每个培养皿需要加入菌液1ml。6)取出菌液实验组和阴性对照组，各取出1ml放于6个ep管中，标记1h、2h、4h、nc1h、nc2h、nc4h，12000rpm离心2min，7)取6只15ml离心管，加入含10％fbs，不含ps的8ml的dmem培养基，悬浮混匀离心后的细菌。8)取出4培养皿结肠癌细胞，pbs洗两次。9)将步骤6中的dmem加入并标记实验组1h、2h、4h和nc1h、nc2h、nc4h组的培养皿中，37℃培养相应时间点收集细胞。10)剩余菌液待离心收集于1.5mlep管中，ddh2o悬浮后离心，-80℃保存，待进行细菌裂解。感染1h后，pbs洗两遍，1：1000加入含有庆大霉素的dmem8ml继续于培养箱中培养1h时分别收集1h实验组和对照组，用细胞刷收集细胞在1100rpm下离心5分钟，弃上清液，用1ml灭菌的1xpbs重新悬浮细胞沉淀，转移到1.5mlep管中，在4℃下2400rpm下离心5分钟，弃上清液并吸干净，收集好的细胞沉淀-80℃保存。11)按照上面步骤重复收集2h、4h实验组和对照组细胞，小心弃去上清液，保存于-80℃冰箱中，准备进行裂解。效应蛋白sope分泌肽能够介导治疗性蛋白从胞外到胞内的定性递送。实施例7：细胞水平评价重组沙门氏菌胞内递送治疗性蛋白的效力重组细菌rvnp20009(p-psope-sope-ha-gsk)和rvnp20009(p-padhesope-ha-gsk)分别在普通条件和厌氧条件下培养诱导融合蛋白sope-ha-gsk的表达,然后感染肠癌细胞系约3小时。收获细胞供western印记分析或者固定细胞供免疫荧光染色分析:①western印记分析:经细菌表达的融合蛋白sope-ha-gsk只有进入真核细胞内,gsk-3β标签才被磷酸化修饰。因此,利用gsk-3β标签的磷酸化特异抗体检测肝脏肿瘤细胞内融合蛋白sope-ha-gsk的磷酸化水平(内源性gsk-3β大小为46kd；sope-ha-gsk大小约为13kd)，可以鉴定融合蛋白sope-ha-gsk是否已被细菌注入肿瘤细胞；②免疫荧光分析:利用ha和沙门氏菌特异抗体免疫荧光染色，用phalloidin特异染料标记细胞，供激光共聚焦显微镜分析。通过荧光染色差异鉴定融合蛋白sope-ha-gsk的胞内定位结果如图7所示，该结果是利用四环素诱导表达系统(tet-on系统)构建可分别诱导效应蛋白表达的重组载体；选用对mln4924敏感的人结肠癌细胞株hct116位模型，建立由tet-on系统分别调控ha表达的肿瘤细胞稳定株；同时建立空载体稳定株作为空白对照组，用westernblot鉴定cif效应蛋白的表达,可见在细胞内能检测到磷酸化的gsk标签蛋白，提示重组载体被导入细胞内，在细菌内只检测到ha标签蛋白，表明载体电转入沙门氏菌体内。实施例8：病毒包装、滴度测定以及感染细胞该实施例建立一个稳定的肿瘤细胞模型，然后把治疗性蛋白靶向地投递到该细胞中。本实施例使用慢病毒来包装质粒，进行滴度测定，并且使用慢病毒来感染细胞。1.制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293t细胞。转染后6-8h更换为完全培养基，培养48h。2.收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心纯化成不同浓度的浓缩病毒。3.其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。a.慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱该病毒包装系统为三质粒系统，组成为plko.1-sh，pspax2，pmd。pspax2，pmd含有病毒包装所必须的元件.1)表达载体：(前文已述)2)pspax2，见图8。3)pmd，见图9。b.慢病毒生产实验步骤1)慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，细胞密度为0.5×109/l时；重新接种于25ml的10cm2细胞培养皿，37℃，5％co2培养箱内培养；2)当细胞融合度达90％～95％时转染。先吸去培养基，然后用无菌的pbs洗一次，然后加入5ml无血清培养基。3)制备慢病毒包装系统中三种质粒dna溶液；plko.1-sh8μg，pspax26μg，pmd2μg,4)加入opti-mem至500μl,室温放置5min；另外取一无菌ep管，加入450μlopti-mem，然后加入50μllip2000，室温放置5min。然后将脂质体缓慢的加入质粒dna中，混匀，室温放置20min。5)将dna和脂质体混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养4-6h后弃去含有转染混和物的培养液，加入pbs15ml，轻摇后弃去，重复该步骤3次；6)每瓶细胞中加入含10％胎牛血清的细胞培养液15ml，继续培养；7)当细胞培养基变黄时，收集转染的293t细胞上清液；重新加入新鲜含10％胎牛血清的细胞培养液，继续收集病毒。个人一般收集2次。8)将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，收集上清液；9)将上清液以0.45μm滤器过滤，分装于2ml的ep管备用。c.慢病毒感染细胞1)接种目的细胞于6cm培养皿中，当细胞融合度达到30-45％左右时，加入3ml的病毒上清，2)同时加入2ml含10％胎牛血清的细胞培养液，加入polybrene至终浓度4-8ug/ml，24小时后更换为正常培养基。3)48小时使用3ug/ml的puro进行稳转筛选。结果如图6所示，这个结果表明效应蛋白sope分泌肽能够介导治疗性蛋白从胞外到胞内的定性递送。携带重组质粒p-psope-sope-ha-gsk(ha-gsk)的重组减毒沙门氏菌(vnp-ha-gsk)不表达磷酸化的sope-ha-gsk融合蛋白；而只有感染肿瘤细胞过程中能够将sope-ha-gsk融合蛋白注入到肿瘤细胞内(只有进入到哺乳动物细胞内才被磷酸化)。vnp为未携带任何重组质粒的vnp20009菌株。实施例9：cif抑制结肠癌细胞的体外生长本实施例表明cif蛋白可以抑制结肠癌细胞的体外生长。实施例中使用人结肠癌细胞hct116和sw480。使用含有cif-wt和cif-c/a质粒的慢病毒分别处理人结肠癌细胞hct116和sw480，仅含有gfp的质粒的慢病毒作为对照。使用dox诱导蛋白的表达。48小时后，观察细胞的数量。平行试验三次，感染复数moi是25，结果如图10所示。1.表达cif效应蛋白的重组细菌沙门氏菌的构建与鉴定构建由乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)和sope蛋白分泌信号肽分别调控野生型cif效应蛋白(ha-cifwt)和cif效应蛋白突变体(ha-cifc/a)分泌表达的重组载体:p-psope-sope-ha-cifwt和p-padhe-sope-ha-cifc/a；利用重组载体电转化vnp20009,筛选分别携带p-psope-sope-ha-cifwt和p-padhe-sope-ha-cifc/a的重组细菌rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifwt)和rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifc/a)；利用sds-page和westernblot鉴定cif效应蛋白在厌氧培养条件下的表达。2.细胞水平鉴定重组沙门氏菌胞内递送cif效应蛋白的效力重组细菌rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifwt)、rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifc/a)和vnp20009首先在厌氧条件下培养诱导cif效应蛋白的表达,然后感染结肠癌细胞株hct116约2小时，固定细胞。利用ha抗体、沙门氏菌抗体免疫荧光染色；用phalloidin特异染料标记细胞,样品供激光共聚焦显微镜分析，确认融合蛋白sope-ha-cifwt和sope-ha-cifc/a的胞内定位。3.减毒沙门氏菌胞内递送cif效应蛋白进行实体瘤靶向性治疗利用结肠癌肿瘤细胞hct116建立裸鼠移植瘤模型,利用vnp20009、rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifwt)和rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifc/a)感染荷瘤小鼠，然后通过以下方法研究vnp20009胞内递送cif效应蛋白进行实体肿瘤治疗的效果以及作用机制。1)cif效应蛋白在肿瘤组织的表达鉴定：首先分析cif效应蛋白在肿瘤组织的表达及胞内投递；然后分析肿瘤组织内关键crl连接酶底物蛋白的积聚情况，以验证肿瘤细胞对cif效应蛋白表达的药理反应和cif效应蛋白诱导抗肿瘤效果的分子机制；2)cif效应蛋白的抑瘤效果评价：通过肿瘤体积的变化判定cif效应蛋白的抑瘤效果。从图10的结果可以看出，含有cif-wt沙门氏菌处理的细胞数量明显减少，表明野生型cif蛋白可以抑制肿瘤细胞的生长。但是含有gfp的对照以及含有cif-c/a质粒的重组沙门氏菌处理的细胞生长没有影响。可见cif抑制肿瘤细胞的生长是由于脱氨酶活性，把nedd8变成nedd8-q40e蛋白。实施例10：cif-wt造成p21和p27蛋白的积聚本实施例表明cif蛋白可以造成p21和p27蛋白在细胞中的积聚。本实施例中细胞时hct116细胞。使用含有cif-wt和cif-c/a质粒的慢病毒处理人结肠癌细胞hct116细胞。仅含有gfp的质粒的慢病毒作为阴性对照，100nm的nae抑制剂mln4924(图11中写为mln)处理细胞作为阳性对照。感染复数moi是25。1.表达cif效应蛋白的重组细菌沙门氏菌的构建与鉴定构建由乙醇脱氢酶厌氧型启动子(padhe)和sope蛋白分泌信号肽分别调控野生型cif效应蛋白(ha-cifwt)和cif效应蛋白突变体(ha-cifc/a)分泌表达的重组载体:p-psope-sope-ha-cifwt和p-padhe-sope-ha-cifc/a；利用重组载体电转化vnp20009,筛选分别携带p-psope-sope-ha-cifwt和p-padhe-sope-ha-cifc/a的重组细菌rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifwt)和rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifc/a)；利用sds-page和westernblot鉴定cif效应蛋白在厌氧培养条件下的表达。2.细胞水平鉴定重组沙门氏菌胞内递送cif效应蛋白的效力重组细菌rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifwt)、rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifc/a)和vnp20009首先在厌氧条件下培养诱导cif效应蛋白的表达,然后感染结肠癌细胞株hct116约2小时，固定细胞。利用ha抗体、沙门氏菌抗体免疫荧光染色；用phalloidin特异染料标记细胞,样品供激光共聚焦显微镜分析，确认融合蛋白sope-ha-cifwt和sope-ha-cifc/a的胞内定位。3.减毒沙门氏菌胞内递送cif效应蛋白进行实体瘤靶向性治疗利用结肠癌肿瘤细胞hct116建立裸鼠移植瘤模型,利用vnp20009、rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifwt)和rvnp20009(p-padhe-sope-ha-cifc/a)感染荷瘤小鼠，然后通过以下方法研究vnp20009胞内递送cif效应蛋白进行实体肿瘤治疗的效果以及作用机制。1)cif效应蛋白在肿瘤组织的表达鉴定：首先分析cif效应蛋白在肿瘤组织的表达及胞内投递；然后分析肿瘤组织内关键crl连接酶底物蛋白的积聚情况，以验证肿瘤细胞对cif效应蛋白表达的药理反应和cif效应蛋白诱导抗肿瘤效果的分子机制；2)cif效应蛋白的抑瘤效果评价：通过肿瘤体积的变化判定cif效应蛋白的抑瘤效果。图11左侧图的结果表明，在不加入dox诱导的情况下，当使用cif-wt处理hct116细胞中时，p21和p27蛋白都有明显的积聚，而对于gfp阴性对照和cif-c/a突变处理的细胞，p21和p27的含量比较低。着表明cif-wt可以抑制nedd8的作用，造成底物p21和p27蛋白降解的抑制。阳性对照mln处理细胞，抑制nae，也能造成底物p21和p27蛋白降解的抑制。gfpdgn蛋白是由酵母来源的泛素化共有信号肽cl1与gfp绿色荧光蛋白羧基末端相融合的杂合蛋白。在普通条件下,gfpdgn蛋白被胞内蛋白酶体识别和降解；当蛋白泛素化或降解功能受到抑制后,gfpdgn蛋白因未被降解而稳定存在。基于gfpdgn蛋白的ups报告系统已成功用于蛋白酶体或crl泛素连接酶活性的检测(jclininvest.2011；121(9):3689–3700；circulation.2011；124(19):2117-28.),本实施例利用gfpdgn蛋白作为指示系统,通过westernblot分析gfpdgn蛋白的表达水平，以判断cif效应蛋白抑制肿瘤细胞内crl泛素连接酶活性的效果。图11右侧图的结果显示使用慢病毒处理hct116细胞后，cif-wt和mln处理可以抑制类泛素化降解，造成gfp-dgn的积累，而mock对照和cif-c/a突变则不能抑制类泛素化，gfp-dgn含量仍然比较低。实施例11：降低p21和p27表达可以减少细胞死亡本实施例表明使用sirna降低p21和p27的表达可以减少由于cif诱导的细胞死亡。为了表明cif诱导的细胞死亡是由于p21和p27蛋白的积累造成，使用针对p21和p27的sirna降低p21和p27蛋白的表达。图12表明使用cif-wt处理细胞之后，使用对照组sirna(si-ctrl)处理，会造成p21和p27的积聚。但是使用cif-wt处理细胞之后，再使用p21的sirna处理降低p21的积聚，p27的sirna处理降低p27的积聚图13表明cif-wt处理细胞之后，使用对照组sirna(si-ctrl)处理，造成细胞的大量死亡。而cif-wt处理细胞之后，使用p21的sirna和p27的sirna处理细胞可以提高细胞的存活，说明cif-wt抑制类泛素化，造成p21和p27蛋白的积聚是造成细胞死亡的原因。上述对实施例的描述是为了便于本
技术领域：
：的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其它实施例中而不必付出创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明披露的内容，在不脱离本发明范围和精神的情况下做出的改进和修改都本发明的范围之内。sequencelisting<110>复旦大学附属肿瘤医院<120>一种利用细菌靶向投递治疗性蛋白的系统及其应用<130>1-6<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>1181<212>dna<213>artificialsequence<220><221>cds<223>pbr322-sope2pro::sope2-ha-gskvector<400>1aacaaaatagatgtaataagcgatattattatattccagatcgattagaaatgcgttgaa60atttgcatcctttctgacgcgctcgaaaaagtggttaagcataagctgtaattccatttg120ttaacctattgtaagttataatgttatatgttgtgttagagtattgttgcttaaaagcag180ccatacagatatgttacctaaaagcaataataatcacctggtatcatatagtttacgtta240tgattggaatagtgttgcaattgttactgattatttctcgtagcgcgtttttttgaccac300taatagatgcgtcaatccatttcatttgtagtttttctgaacgtcatgaaaagtcataat360atataaaaatcagttaattaattgatgtttagataaggattacagtgacggagaggtttg420gcgtggcgactttataggttttgaaaaagcggctaactcgctggcaggataattggtagc480cagcctgcgaatgggggcaaaatcgtaacaacatcagcataaataataatattcatgaat540gttttatgtgacgcagtagttgaattgaagtgatgttttacctgttcaggattgtcccga600taaaaatgttcctcgataaaagtcgatcaccttgcgccgaaaaaaaacaggctaagtgac660agaagaacaaaatccatcaggaaaataaaatttataaatatcaatgagtaaaaatggttg720tggagaaggtggctattttttgaaagcaagaaatataaacaaagtgtagctatgcatagt780tatctaaaaggagaactaccgtgactaacataacactatccacccagcactacagaatcc840atagaagtgacgttgaaccagtaaaagaaaaaacaacggagaaggacatttttgcaaaaa900gtattactgccgttagaaatagctttatcagcctgtcgacgagtctgtcagatcgtttta960gcctgcatcaacaaacagacataccgactacccattttcatcgtgggaacgcttctgagg1020gtagggcggtattaaccagtaaaactgttaaagattttatgctgcaaaagctcaatagtc1080tggatatcaaaggtaatgcgagtaaagatccgtatccatatgacgttccagattacgcta1140tgagtggtcgccctcgcactactagtttcgctgaaagttga1181<210>2<211>821<212>dna<213>artificialsequence<220><221>cds<223>pbr322-nirbpro::sope2-ha-gskvector<400>2cctgcggaaccatcggtactatgttgacctttgtggttaccggcccgatcgttgaacata60gcggtccgcaggcggcactgcttacagcaaacggtctgtacgctgtcgtctttgtgatgt120gcttcctgttaggtttcgtcagccgtcaccgtcagcataacaccctgacctctcattaat180tgctcatgccggacggcactatcgtcgtccggccttttcctctcttcccccgctacgtgc240atctatttctataaacccgctcattttgtctattttttgcacaaacatgaaatatcagac300aattccgtgacttaagaaaatttatacaaatcagcaatatacccattaaggagtatataa360aggtgaatttgatttacatcaataagcggggttgctgaatcgttaaggtaggcggtaata420gaaaagaaatcgaggcaaaagtgactaacataacactatccacccagcactacagaatcc480atagaagtgacgttgaaccagtaaaagaaaaaacaacggagaaggacatttttgcaaaaa540gtattactgccgttagaaatagctttatcagcctgtcgacgagtctgtcagatcgtttta600gcctgcatcaacaaacagacataccgactacccattttcatcgtgggaacgcttctgagg660gtagggcggtattaaccagtaaaactgttaaagattttatgctgcaaaagctcaatagtc720tggatatcaaaggtaatgcgagtaaagatccgtatccatatgacgttccagattacgcta780tgagtggtcgccctcgcactactagtttcgctgaaagttga821<210>3<211>1933<212>dna<213>artificialsequence<220><221>cds<223>pbr322-sope2pro::sope2-ha-gsk-cifvector<400>3tccagatcgattagaaatgcgttgaaatttgcatcctttctgacgcgctcgaaaaagtgg60ttaagcataagctgtaattccatttgttaacctattgtaagttataatgttatatgttgt120gttagagtattgttgcttaaaagcagccatacagatatgttacctaaaagcaataataat180cacctggtatcatatagtttacgttatgattggaatagtgttgcaattgttactgattat240ttctcgtagcgcgtttttttgaccactaatagatgcgtcaatccatttcatttgtagttt300ttctgaacgtcatgaaaagtcataatatataaaaatcagttaattaattgatgtttagat360aaggattacagtgacggagaggtttggcgtggcgactttataggttttgaaaaagcggct420aactcgctggcaggataattggtagccagcctgcgaatgggggcaaaatcgtaacaacat480cagcataaataataatattcatgaatgttttatgtgacgcagtagttgaattgaagtgat540gttttacctgttcaggattgtcccgataaaaatgttcctcgataaaagtcgatcaccttg600cgccgaaaaaaaacaggctaagtgacagaagaacaaaatccatcaggaaaataaaattta660taaatatcaatgagtaaaaatggttgtggagaaggtggctattttttgaaagcaagaaat720ataaacaaagtgtagctatgcatagttatctaaaaggagaactaccgtgactaacataac780actatccacccagcactacagaatccatagaagtgacgttgaaccagtaaaagaaaaaac840aacggagaaggacatttttgcaaaaagtattactgccgttagaaatagctttatcagcct900gtcgacgagtctgtcagatcgttttagcctgcatcaacaaacagacataccgactaccca960ttttcatcgtgggaacgcttctgagggtagggcggtattaaccagtaaaactgttaaaga1020ttttatgctgcaaaagctcaatagtctggatatcaaaggtaatgcgagtaaagatccgta1080tccatatgacgttccagattacgctatgagtggtcgccctcgcactactagtttcgctga1140aagtgtaaatactgaagctgtattatctcccatgcaacacacttcagccttacatgtaag1200agattttgcttccctgtgctcacagaacctcaaagctaatgtattgctaaatagtgatga1260ccacgaagtacctatacatcagaaaaatcctgctgcaataatgcaaaatatcgactctaa1320catcaaacagatggcaacagactgggggatgtcgattgaggaggttgaggttattatagg1380gcgagagaaaggcattgtggaaccctcctgcggagttaccgctaatgctattatgaaact1440atttctggacaaggatggcttcagttactgctttgaaaatgaacagacactatcgctcga1500gcagcttcaggaacgcctgtcctgtatgcctgaatgtaagagctttgtattacgtgttaa1560tgatggtgcgcttggtcatgcttacattgtcgatattcccaaaggagaaaactcttgtcg1620tcctgcattcttgtatcagtcagatttaggagagggcgtcaccagaaagttaagatttga1680ggactggatgacgcataaagcattgactccgattttgctggatgatatttgtaattactt1740ctcctgcatgtctcaaaataagacagatttggagcagattgcaacgttatttgatattga1800tgggaatgttaaaatgttacgaaaggaaaatattcaatatcaaaagcatgacaattttag1860tttccagttgtttgagtatgacaccgataatattgaaaaaaacattgagataataaaatc1920actatgtagttag1933<210>4<211>1607<212>dna<213>artificialsequence<220><221>cds<223>pbr322-nirbpro::sope2-ha-gsk-cifvector<400>4cctgcggaaccatcggtactatgttgacctttgtggttaccggcccgatcgttgaacata60gcggtccgcaggcggcactgcttacagcaaacggtctgtacgctgtcgtctttgtgatgt120gcttcctgttaggtttcgtcagccgtcaccgtcagcataacaccctgacctctcattaat180tgctcatgccggacggcactatcgtcgtccggccttttcctctcttcccccgctacgtgc240atctatttctataaacccgctcattttgtctattttttgcacaaacatgaaatatcagac300aattccgtgacttaagaaaatttatacaaatcagcaatatacccattaaggagtatataa360aggtgaatttgatttacatcaataagcggggttgctgaatcgttaaggtaggcggtaata420gaaaagaaatcgaggcaaaagtgactaacataacactatccacccagcactacagaatcc480atagaagtgacgttgaaccagtaaaagaaaaaacaacggagaaggacatttttgcaaaaa540gtattactgccgttagaaatagctttatcagcctgtcgacgagtctgtcagatcgtttta600gcctgcatcaacaaacagacataccgactacccattttcatcgtgggaacgcttctgagg660gtagggcggtattaaccagtaaaactgttaaagattttatgctgcaaaagctcaatagtc720tggatatcaaaggtaatgcgagtaaagatccgtatccatatgacgttccagattacgcta780tgagtggtcgccctcgcactactagtttcgctgaaagtgtaaatactgaagctgtattat840ctcccatgcaacacacttcagccttacatgtaagagattttgcttccctgtgctcacaga900acctcaaagctaatgtattgctaaatagtgatgaccacgaagtacctatacatcagaaaa960atcctgctgcaataatgcaaaatatcgactctaacatcaaacagatggcaacagactggg1020ggatgtcgattgaggaggttgaggttattatagggcgagagaaaggcattgtggaaccct1080cctgcggagttaccgctaatgctattatgaaactatttctggacaaggatggcttcagtt1140actgctttgaaaatgaacagacactatcgctcgagcagcttcaggaacgcctgtcctgta1200tgcctgaatgtaagagctttgtattacgtgttaatgatggtgcgcttggtcatgcttaca1260ttgtcgatattcccaaaggagaaaactcttgtcgtcctgcattcttgtatcagtcagatt1320taggagagggcgtcaccagaaagttaagatttgaggactggatgacgcataaagcattga1380ctccgattttgctggatgatatttgtaattacttctcctgcatgtctcaaaataagacag1440atttggagcagattgcaacgttatttgatattgatgggaatgttaaaatgttacgaaagg1500aaaatattcaatatcaaaagcatgacaattttagtttccagttgtttgagtatgacaccg1560ataatattgaaaaaaacattgagataataaaatcactatgtagttag1607<210>5<211>882<212>dna<213>artificialsequence<220><221>cds<223>phbad-mcmv-ha-cif-cmv-gfpadenovirusvector<400>5gccaccatgtatccatatgacgttccagattacgctaaagacattacccttccccccccg60acgtccgcgtcctgtctgacaggggccatatctgtaaatactgaagctgtattatctccc120atgcaacacacttcagccttacatgtaagagattttgcttccctgtgctcacagaacctc180aaagctaatgtattgctaaatagtgatgaccacgaagtacctatacatcagaaaaatcct240gctgcaataatgcaaaatatcgactctaacatcaaacagatggcaacagactgggggatg300tcgattgaggaggttgaggttattatagggcgagagaaaggcattgtggaaccctcctgc360ggagttaccgctaatgctattatgaaactatttctggacaaggatggcttcagttactgc420tttgaaaatgaacagacactatcgctcgagcagcttcaggaacgcctgtcctgtatgcct480gaatgtaagagctttgtattacgtgttaatgatggtgcgcttggtcatgcttacattgtc540gatattcccaaaggagaaaactcttgtcgtcctgcattcttgtatcagtcagatttagga600gagggcgtcaccagaaagttaagatttgaggactggatgacgcataaagcattgactccg660attttgctggatgatatttgtaattacttctcctgcatgtctcaaaataagacagatttg720gagcagattgcaacgttatttgatattgatgggaatgttaaaatgttacgaaaggaaaat780attcaatatcaaaagcatgacaattttagtttccagttgtttgagtatgacaccgataat840attgaaaaaaacattgagataataaaatcactatgtagttag882<210>6<211>1181<212>dna<213>artificialsequence<220><221>cds<223>p-psope-sope-ha-gsk<400>6aacaaaatagatgtaataagcgatattattatattccagatcgattagaaatgcgttgaa60atttgcatcctttctgacgcgctcgaaaaagtggttaagcataagctgtaattccatttg120ttaacctattgtaagttataatgttatatgttgtgttagagtattgttgcttaaaagcag180ccatacagatatgttacctaaaagcaataataatcacctggtatcatatagtttacgtta240tgattggaatagtgttgcaattgttactgattatttctcgtagcgcgtttttttgaccac300taatagatgcgtcaatccatttcatttgtagtttttctgaacgtcatgaaaagtcataat360atataaaaatcagttaattaattgatgtttagataaggattacagtgacggagaggtttg420gcgtggcgactttataggttttgaaaaagcggctaactcgctggcaggataattggtagc480cagcctgcgaatgggggcaaaatcgtaacaacatcagcataaataataatattcatgaat540gttttatgtgacgcagtagttgaattgaagtgatgttttacctgttcaggattgtcccga600taaaaatgttcctcgataaaagtcgatcaccttgcgccgaaaaaaaacaggctaagtgac660agaagaacaaaatccatcaggaaaataaaatttataaatatcaatgagtaaaaatggttg720tggagaaggtggctattttttgaaagcaagaaatataaacaaagtgtagctatgcatagt780tatctaaaaggagaactaccgtgactaacataacactatccacccagcactacagaatcc840atagaagtgacgttgaaccagtaaaagaaaaaacaacggagaaggacatttttgcaaaaa900gtattactgccgttagaaatagctttatcagcctgtcgacgagtctgtcagatcgtttta960gcctgcatcaacaaacagacataccgactacccattttcatcgtgggaacgcttctgagg1020gtagggcggtattaaccagtaaaactgttaaagattttatgctgcaaaagctcaatagtc1080tggatatcaaaggtaatgcgagtaaagatccgtatccatatgacgttccagattacgcta1140tgagtggtcgccctcgcactactagtttcgctgaaagttga1181当前第1页12当前第1页12