一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因的制作方法

文档序号：14051724阅读：326来源：国知局

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说利用化学合成方法及基因家族改组技术，改造来源耶尔森菌的酸性植酸酶基因，使之能在毕赤酵母中高效表达，表达的植酸酶具有耐高温性，结构稳定。

背景技术：

禾谷类、豆科类及油料作物是人的食品和动物饲料中的主要原料。这些原料中虽含有大量的磷，但其中50%-70%是以植酸磷（六磷酸肌醇）的形式存在（salunkhe1982，食品研究进展）。植酸酶能将植酸磷水解成肌醇和磷酸。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率很低。在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率。开发植酸酶的直接原因来源于植酸带来的磷污染。一方面，植酸中螯合的磷无法吸收利用，另一方面则是必须在饲料和食品中添加大量无机磷，造成磷源浪费和环境污染（cromwell1991，生物技术在食品工业中的应用进展）。随着养殖业的发展，无机磷的排泄量大幅度上升，磷污染遍及河流、山川和平原耕作地，直接威胁人类自身的生存。自80年代中期，欧洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方案(councildirective91/676/eec)中，着重强调限制养殖业的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加剂中，具有最直接、最显著环保社会效益的酶制剂。由于磷是动物生长过程中的基本元素，为了弥补新陈代谢中磷的消耗，常常需要在食品和饲料中添加无机磷（common1989，自然杂志）。植酸酶将植酸中鳌合的磷释放出来，从而减少了饲料中磷酸氢钙等无机磷的使用量，降低幅度达50%-70%。

植酸酶广泛存在于植物﹑动物和微生物中。不同的物种产生的植酸酶在比活、最适反应ph、耐热性等性质上存在很大差异。许多微生物都能产生高比活的植酸酶。1968年shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所有22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于曲霉aspergillusterreusno.9a-1,其最适ph为4.5，最适反应温度为70℃,ph在1.2~9.0范围内，该酶均能稳定维持一定活性。到目前为止，发现200多种真菌、细菌、酵母、各种各样的植物和动物组织能够产生植酸酶，其中真菌植酸酶产量最高，活性高，是商品植酸酶最主要的生产菌。来源于黑曲霉（aspergillusnigervar.awamori)的植酸酶phya对植酸钠有很高的底物特异性，酶的特异比活性为100u/mg酶蛋白，是真菌中发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。由于天然菌种的植酸酶产量较低，直接用其生产出的植酸酶成本较高，从而影响了植酸酶的推广应用。1991年，荷兰人将来源于无花果曲霉的phya基因克隆后，转入黑曲霉中，诞生了世界上第一个植酸酶基因工程菌；后来丹麦将来源于隔孢伏霉菌的phya基因克隆后，转入米曲霉中；1998年，中国农科院姚斌等对黑曲霉963的植酸酶基因进行改造，转化到毕赤酵母中，经发酵罐高密度发酵培养，植酸酶的产量达到1.5×102u/ml，比原菌株的产量高3000倍，这是中国饲料工业中构建的第1株具有实用价值的生产饲料添加剂的基因工程菌。

vats和banerjee(2004)发现在所有植酸酶中，绝大多数真菌产生的植酸酶为酸性植酸酶的最适ph值在2.5-5.5，有些耐高温真菌如schwanniomycesoccidentalis，myceliophthorathermophila和thermomyceslanuginosus，aspergillusfumigatus产生的植酸酶最适ph值达到6.0，虽然具有很好的耐温性，但它在37℃下的酶活性极低，在饲料中没有使用价值。细菌产生的植酸酶有两种，一种为酸性植酸酶，如e.coli植酸酶在ph2.0-3.5区域活性很强，其蛋白的结构和催化机理与真菌酸性植酸酶相似，具有保守的催化基元rhgxrxp和hd。另一种为碱性植酸酶，最适ph为7.0，如来源于枯草杆菌（bacillussubtilis）的植酸酶，这种植酸酶结构为β-螺旋浆，由β折叠组成的六叶螺旋浆。碱性植酸酶的热稳定性更强，某些酶能耐受80-95℃的高温,如park从bacillusamyloliquefaciens中分离到的植酸酶最适作用温度是70℃，在90℃下处理10min也能保持活性，该类植酸酶催化活性和热稳定性均依赖ca2+。目前对细菌来源的植酸酶的开发非常重视，市场中至少存在3种细菌植酸酶产品，主要因为细菌来源酸性植酸酶的比活性高，大肠杆菌appa的比活比黑曲霉中的phya高近30倍。因此目前的细菌植酸酶大多从e.coli植酸酶开发出来的，如大肠杆菌的植酸酶基因appa的毕赤酵母生产菌株，大肠杆菌的植酸酶基因phyq毕赤酵母菌株等等。

来源于耶尔森菌属植酸酶比活性比大肠杆菌高，但是耐高温性不强，本专利针对9个按毕赤酵母密码子合成的耶尔森菌属(yersinia)植酸酶基因，利用创新的植酸酶基因家族改组及高通量筛选技术体系，对这些植酸酶基因进行改良，解决植酸酶的高比活和耐高温的矛盾，同时实现新型植酸酶在甲醇酵母中高效表达，完成植酸酶工程菌株发酵工艺的优化，并解决新型植酸酶的制剂工艺，研发植酸酶的保护剂和增效剂，实现植酸酶工程菌的工业化生产。

技术实现要素：

本发明采用基因化学合成和基因家族体外重组方法，筛选一种在酵母菌中高效表达的耐高温高比活植酸酶基因。

本发明通过载体构建、酵母电击转化、高活性菌株筛选等步骤来制备生产耐高温高比活植酸酶甲醇酵母菌株。

本发明为了提高植酸酶的在酵母中的表达。将所有耶尔森菌属植酸酶基因进行化学合成，设计寡核苷酸引物长度为60碱基，引物之间连接通过20bp重叠序列，tm值为60-66将所有引物加入反应体系，进行pcr扩增，共进行35个循环，合成酸性植酸酶基因。

本发明按照酵母表达需要，优化所有植酸酶基因。优化的原则包括：消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的gc/at均衡，提高rna的稳定性；避免2、3位用cg和ta双寡核苷酸（cg在植物中易造成甲基化）；使基因编码蛋白符合n端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；优化mrna二级结构自由能，以提高基因表达效率。

以合成的9个来自耶尔森菌属植酸酶基因克隆载体为模板，以载体上的通用引物pbskz18：gcgattaagttgggtaacgcc；pbskf18：ggaaagcgggcagtgagcgcaacg，扩增植酸酶基因，将所有基因片段用dnasei酶切成10-50bp小片段，利用taqdna聚合酶进行dna分子重排，电击入大肠肝菌，构建突变基因库。

酶切所有重排dna分子，将片段插入大肠杆菌-酿酒酵母穿梭的酵母表达载体pvt102u/α(专利201510230599.8)，转化酿酒酵母，通过硝酸纤维素膜影印和40孔细胞培养板筛选，大规模筛选高活性的植酸酶基因，最终获得耐高温高比活的植酸酶基因yappa102，完成突变基因序列测定。

按突变基因的两端序列设计出引物，在基因5`端加入χhol切点和信号态切割序列，引物为ymappa1z，在基因3`端加入noti切点，引物为ymappa1f，扩增片段克隆后，χhol和noti双酶切，定向插入毕赤酵母分泌表达载体ppypx88（genbank:ay178633），构建成突变植酸酶基因yappa102的酵母表达载体（图1），挑选植酸酶高表达重组酵母p.pastoris菌种，进行高密度发酵，表达的植酸酶具有较高的酶活性，1ml发酵液含有相当于13200单位酶活性，90℃高温处理后30分钟后植酸酶残存活性达到68%。

本发明有益效果如下：

通过偏爱密码改造及基因家族重排获得的植酸酶基因具有以下优点：

1.新的植酸酶基因yappa102适合在毕赤酵母中高效表达，小罐发酵植酸酶后每毫升含量达13200单位。

2.基因表达产物具有很高的高温耐受性，90℃高温处理后30分钟后植酸酶残存活性达到68%。

附图说明：

图1构建成植酸酶毕赤酵母表达载体pyappa102。

图2重组菌株高密度发酵时间与植酸酶表达量的关系。

图3不同ph值条件下植酸酶酶活性。

图490℃高温处理后植酸酶残存活性分析

具体实施方式

实施例1：植酸酶基因的化学合成

利用连续延伸pcr合成植酸酶基因。设计引物长度为60bp，基因两端引入bamhi和saci酶切位点。引物与引物之间连接通过20bp重叠序列，tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng。pcr反应体系为100μl。pcr扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。pcr扩增用酶为高保真taqdna聚合酶。将pcr扩增片段通过ta克隆方法克隆到常规载体puc18中。dna序列测定确定合成基因序列正确性。

合成基因序列为：

1）yaappa来源阿氏耶尔森氏菌yersiniaaldovaeatcc35236（seqidno.1所示）

gcaccacaacctgctggttacaccttggagagagtcgtcatcttgtccagacatggtgtt60

agatccccaaccaaacagactcagttgatgaatgacgtcactcctgacaagtggcctcaa120

tggcctgtcaaggctggttacttgactcctagaggtgcacagttggtcactctgatgggt180

cagttctacggtgactacttcagatccaagggtttgctgcttgctggttgtcctgctgag240

ggtgtcatctacgcacaggctgacatcgaccagagaaccagactgactggtcaggcattc300

ctggatggtgtcgctcctgactgtggtctgaaggtccactaccaggctgacctgaagaag360

accgatccactgttccatcctgtcgaagctggtgtctgcaagttggatgctgtccagact420

cagaaggctgtcgaagagcatctgggtggtccattgtcttctcttggtgagagatacacc480

aagccattcgctcagatgggtgaggtcctgaacttcgcaaagtctccatactgcaagacc540

agacaacagaacgacaagacctgcgacttcgcacacttcgctgctaacgagatcaaggtc600

aacaaagagggttccaaagtctccctgaacggtccactggccttgtcctccaccttgggt660

gaaatcttcctgctccagaatgctcagaacatgcctaatgttgcctggaacagactgtct720

ggtactgagaactgggcatctcttctgtctcttcacaacgtccagttcgacttgatggcc780

aagactccatacattgccagacacaagggtactccactgttgcaacagatcgatgctgcc840

ttgactctgcaacctgatgcactgggtcagaccttgccactgtctccacagtccagagtc900

ctcttcatcggtggtcatgacaccaacatcgcaaacattgctggtatgttgggtgcctct960

tggcaacttccacagcaacctgacaacactccacctggtggtggtttggtcttcgagttg1020

tggcagaaccctgacaaccatcagagatacgttgctgtcaagatgttctaccaaactatg1080

gatcagttgagaaaggcagagatgctggacttgaagaacaaccctgctggtatgatctcc1140

gtcgctgtcgagggttgtgagaactctggtgatgacaaactgtgccagcttgacaccttc1200

cagaagaaggtcgctcaggtcatcgagcctgcttgccacatctaa1245

2）ybappa来源伯氏耶尔森氏菌yersiniabercovieriatcc43970（seqidno.2所示）

catggtgttagaagtccaactaagcaaacccagttgatgaacgacgtcactcctgacaag120

tggcctcaatggcctgttcaagctggttatctgactcctagaggtgcacagttggtcact180

ctgatgggtggtttctacggtgactacttcagatcccaaggtttgctcccagctggttgt240

cctgctgatggtgccatctacgcacaagctgatgttgatcagagaaccagattgactggt300

caagcattccttgatggtattgcacctggttgtggtctgaaggtccactaccaggctgat360

ctgaagaaggtcgatccactgttccatcctgtcgaagctggtgtctgcaagttggactct420

gcacaatcccaacaggcaatcgaggctagactgggtggtccattgtctgaactgtctcag480

agatacgctaagccattcgcacagatgggtgagatcctgaacttcgctgcttctccatac540

tgcaactcccttcagcagcaaggtaagacttgcgacttcgcaaccttcgctgctaacgaa600

gtcaaggtcaacaagcagggtactaaggtctccctgtctggtccactggcattgtcttcc660

accttgggtgaaatcttcttgctccagaactcccaaggtatgcctgacgttgcttggaac720

agattgtctggtgctgagaactgggtctccttgttgtctctgcacaacgctcagttcgac780

ttgatggctaagactccttacatcgccagacacaagggtactccattgttgcaacagatc840

gatactgctctggtcctccagagagatggtcaaggtcagaccctgccattgtctgctcag900

accaagctgctgttccttggtggtcatgacaccaacattgccaacgtcgctggtatgctg960

ggtgctaactggcaacttccacaacagcctgacaacactccacctggtggtggtctggtc1020

ttcgagctgtggcagaaccctgacaaccaccagcagtacgtcgctgtcaagatgttctac1080

caaactatggaccagttgagaaactccgagaagttggacctgaagatccaccctgctggt1140

attgtcgcaatcgagatcgctggttgtgagaacaatggtgctgacaagctgtgccagctt1200

gacaccttccagaagagagtcgctcagatcatcgaacctgcctgccacatctaa1254

3）yeappa来源结肠炎耶尔森杆菌yersiniaenterocolitica（seqidno.3所示）

gctcctatcgctactgctcctgctggttacactctggagagagtcgtcatcctgtccaga60

cacggtatcagaagtcctactaagcagactcagctgatgaacgacatcactcctgacaag120

tggccacagtggcctgtcaaggctggttatctgactcctagaggtgctgagctggtcact180

ctgatgggtggtttctacggtgactacttcagatcccagggtctgctgtctgctggttgc240

cctgttgacggttctgtctacgctcaggctgacgttgaccagagaactagactgactggt300

caggctttcctggacggtatcgctcctgactgcggtctgaaggtccactaccaggctgac360

ctgaagaaggttgaccctctgttccacactgtcgaggctggtgtctgcaagctggactct420

gctaagactcaccaggctgtcgaggagagactgggtggtcctctgtctgacctgtctcag480

agatacgctaagcctttcgctcagatggacgaggtcctgaacttcgctgcttctccttac540

tgcaagtctctccagcagaacggtaagacttgcgacttcgctactttcgctgctaacgag600

atcaaggtcaacgaggagggtactaaggtctctctgtctggtcctctggctctgtcttct660

actctgggtgaaatcttcctgctccagaactctcaggctatgcctgacgtcgcttggcac720

agactgtctggtgaggagaactgggtctctctgctgtctctgcacaacgctcagttcgac780

ctgatggctaagactccttacatcgctagacacaagggtactcctctgctccagcagatc840

gacactgctctggtcctccagagaaacgctcagggtcagactctgcctctgtctcctcag900

actaagctgctgttcctgggtggtcacgacactaacatcgctaacatcgctggtatgctg960

ggtgtcaactggcagctgcctcagcagcctgacaacactcctcctggtggtggtctggtc1020

ttcgagctgtggcagaaccctgacaaccaccagagatacgtcgctgtcaagatgttctac1080

cagactatggaccagctgagaaacgctgagaagctggacatgaagaacaaccctgctaag1140

atcgtccctatcactatcgagggttgcgagaacgagggtgacaacaagctgtgccagctg1200

gagactttccagaagaaggtcgctcaggtcatcgagcctgcttgccacatctaa1254

4）yfappa来源弗氏耶尔森氏菌yersiniafrederiksenii（seqidno.4所示）

gagcagaacgacggtctccagctccagtctgtcgtcatcgtctccagacacggtgttaga60

gcaccaactaagctgactccactgatgcagaacgtcactcctgacacttggccacagtgg120

tctgtcccactgggttggctgactcctagaggtggtgagctgatctctctgctgggtgac180

taccagagacagagactgatctctgagggtctgatcaatgctgctcagtgtccttctgct240

aagcaggtcgctgtcatcgctgacactgacgagagaactagaaagactggtgaggctttc300

atctctgctctggctccacactgcgctctgcctgtccacgtccagcagaacctgagacag360

actgaccctctgttcaacccactgaagactggtcactgccagctggacaagccaactgtc420

agagctgctatcctgaagcaggctggtggttctatcgaggctctgaacaagcagtaccag480

cctgctttcactactctggctgacgtcctgaacttcagagagtctccactgtgccagcag540

gagaagagatgcactctgcctgaggctctgccatctgagctggaggtctctaagagaaac600

gtctctttctctggtgcttggggtctggcttctactgtctctgaaatcttcctgctccag660

caggctcagggtatggctgatcctggttggggtagaatcaagaactctgagcagtggcag720

cagctgctgtctctgcacaacgctcagttcgacctgctccagagaactccagaggtcgct780

tcttccagagctactccactgctggacctgatcatcgctactctgactcctggacacgct840

ggtaagcagatggctggtatctctctgccaacttctctgctgttcatcgctggtcacgac900

actaacctggctaacctgggtggtgctctgggtatgtcttggactctgcctgaccagcct960

gacaacactccacctggtggtgagctggtcttcgagagatggcacagagctactgacaac1020

actgactggattcaggtctctctggtctaccagactctccagcagatgagaaacgtcact1080

agactgtctatgactactcctcctggtaaggtcccactgactgtcaacggttgccaggag1140

actaactctcagggtatgtgctctctgaagtctttcactgctgtcatcaacactatcaga1200

aaccctgcttgcgctctgtaa1221

5）yiappa来源中间耶尔森菌yersiniaintermedia（seqidno.5所示）

gctgaggctgcacatcctgtcagacatctggagagagtcgtcatcgtctccagacatggt60

gttagagcaccaaccaagatgcctgcactgatcagagaggtcactcctgatggttggcct120

gtctggcctgttccacttggtgatctgactcctagaggtgcttctctggttactctgctt180

ggtgcctactacagacagcagttgtccagagagggtctgcttcctgcacagggttgtcct240

cctgctggttgggtctatgcatggactgatgtcgatcagagaaccagaaagactggtgct300

gctttcctccagggtttggcacctggttgtgctgttgctatccatcacagacctgatgtt360

tcccagagagatccactgttccatcctgtcaaggctggtctgtgtagactggacaaggcc420

agaaccagaagagccatcgaagcacaggctggtatgccacttgctgcactgaatcacaga480

tacggtactgctcttgcacagatggctagagtcctgcacttcgcatcctctccatactgt540

cagagaagatccggtgatggtgtctgcaccctcgctagaaccatgccaactagactgcac600

atggatgctcatggtgctatcgctctgagaggtgctcttggtctgtctgctactctggct660

gagatgttcctgttgcagcaggctcagggtatggctcagcctgcttggggtagaatcgct720

actcctgctcagtggagatccttgctccagctgcacaaccttcagttcgatctgctgtcc780

agaaccgactacatcgctagacacagaggtactccactgatgtacactgttcttcaggca840

ctgcatggtcagactcctagactgcctggtttgactgcacagaacagactgctgctgctg900

gttggtcatgacaccaaccttgccaatctgtccggtctgctgcaaactccttggtctctt960

cctggtcagcctgacaacactccacctggtggtgaactgagattcgagagatggagagac1020

tctactggtagagcatgggtcagagtctctgttgtctaccagtctctggcacaactgaga1080

agacagtccagactgactcttccacttccaccacatcagatgactcttgcattgcctggt1140

tgcagaggtgagatggctgatggtctgtgtccactggatgcattctctcagtggctttct1200

tccagactgatccctgcttgtctgcctgttcctgatggtgctaccaacgcaatggagtaa1260

6）ykappa来源克氏耶尔森氏菌yersiniakristenseniiatcc33638（seqidno.6所示）

gcaccacttgctgcacagtccactggttacactttggagagagtcgtcatcttgtccaga60

catggtgttagaagtccaaccaagcagacccagttgatgaacgacgtcactcctgacaag120

tggcctcaatggcctgtcaaggctggttacttgactcctagaggtgctggtttggtcact180

ttgatgggtggtttctacggtgactacttcagatcctacggtttgttgcctgctggttgt240

cctgctgacgaatccatctacgtccaagctgatgtcgatcagagaaccagactgactggt300

caggcattcctggatggtatcgcacctgactgtggtctgaaggtccactaccaagctgac360

ctgaagaagatcgacccactgttccacactgttgaggctggtgtctgcaaactggaccct420

gagaagacccaccaggctgtcgagaagagactgggtggtccactgaacgaactgtcccag480

agatacgctaagccattcgctctgatgggtgaggtcctgaacttctctgcatctccatac540

tgcaactccctgcaacagaagggtaagacctgtgacttcgcaaccttcgctgccaacgag600

atcgaggtcaacaaagaaggtactaaggtctccctgtctggtccactggcactgtcttcc660

accttaggtgaaatcttcctgttgcagaactctcaggcaatgcctgatgttgcttggaac720

agactgtctggtgaagagaactggatctccttgttgtccctgcacaacgcacagttcgac780

ttgatggctaagaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaatt840

gatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcagggtcagaccctgccactgtctccacag900

accaagctgctgttccttggtggtcatgacaccaacattgccaacatcgctggtatgttg960

ggtgccaactggcaactgccacagcaacctgacaacactccacctggtggtggtctggtc1020

ttcgagctgtggcagaaccctgacaaccatcagagatacgttgctgtcaagatgttctac1080

cagactatggagcagttgagaaacgctgacaagttggacctgaagaacaaccctgcaaga1140

atcgtcccaatcgctatcgaaggttgcgagaacgagggtgacaacaagctgtgtcagctg1200

gagaccttccagaagaaggtcgctcaagtcatcgaaccaacctgccacatctaa1254

7）ymappa来源莫氏耶尔森氏菌yersiniamollaretii（seqidno.7所示）

gctcctgtcgctgctcctgtcactggttacactctggagagagtcgtcatcctgtccaga60

cacggtgttagaagtcctactaagcagactgagctgatgaacgacgtcactcctgacaag120

tggccacagtggcctgttcctgctggttatctgactcctagaggtgctcagctggtcact180

ctgatgggtggtttctacggtgactacttcagaaaccagggtctgctgcctgctggttgt240

cctgctgacggtactctgtacgctcaggctgacatcgaccagagaactagactgactggt300

caggctttcctggatggtatcgctcctggttgtggtctgaaggtccactaccaggctgac360

ctgaagaaggttgatcctctgttccaccctgtcgaggctggtgtctgtcagctggactct420

actcagactcacagagctatcgaggctcagctgggtgctcctctgtctgagctgtctcag480

agatacgctaagcctttcgctcagatgggtgagatcctgaacttcactgcttctccttac540

tgcaagtctctccagcagcagggtaagtcttgcgacttcgctactttcgctgctaacgag600

gtcaaggtcaaccagcagggtactaaggtctctctgtctggtcctctggctctgtcttct660

actctgggtgaaatcttcctgctccagaactctcagggtatgcctgacgtcgcttggcac720

agactgtctggtgctgagaactgggtctctctgctgtctctgcacaacgctcagttcgac780

ctgatggctaagactccttacatcgctagacacaagggtactcctctgctccagcagatc840

gtcactgctctggtcctccagagaaagggtcagggtcagactctgcctctgtctgagcag900

actaagctgctgttcctgggtggtcacgacactaacatcgctaacatcggtggtatgctg960

ggtgctaactggcagctgcctcagcagcctgacaacactcctcctggtggtggtctggtc1020

ttcgagctgtggcagaaccctgacaaccaccagcagtacgtcgctgtcaagatgttctac1080

cagactatggaccagctgagaaactctgagaagctggatctgaagtctcaccctgctggt1140

atcgtccctatcgagatcgagggttgcgagaacatcggtactgacaagctgtgccagctg1200

gacactttccagaagagagtcgctcaggtcatcgagcctgcttgccacatctaa1254

8）ypappa来源假结核耶尔森氏菌yersiniapseudotuberculosis（seqidno.8所示）

gagccatctggttacaccttggagagagtcgtcatcttgtccagacatggtgttagaagt60

cctaccaagcagacccagctgatgaacgacgtcactcctgacaagtggcctcaatggcct120

gtcaaggctggttacttgactccaagaggtgctgagttggtcactctgatgggtggtttc180

tacggtgactacttcagatcccttggtctgttggctgctggttgtcctgctgagggtgtc240

gtctatgcacaggctgacatcgatcagagaaccagattgactggtcaggcattcctggat300

ggtgttgctcctggttgtggtttgaccgtccacaaccaggctgacctgaagaagaccgat360

ccactgttccatcctgtcgaggctggtgtctgcaagttggatgctgcccagaccgacaag420

gctatcgaagaacagctgggtggtccattggacactgtctctcagagatacgctaagcca480

ttcgcacagatgggtgacgtcctgaacttcgctgcatctccatactgcaagtctctgcaa540

cagcaaggtaagacctgcgacttcgctcacttcgctgctaacgaagtcaacgtcaacaag600

gaaggtactaaggtcactctgtctggtccactggcattgtcctccaccttgggtgaaatc660

ttcttgttgcagaacgcacaagctatgcctgaggttgcatggcagagactgaagggtgct720

gagaactgggtctccttgttgtccttgcacaacgctcagttcaacttgatggccaagact780

ccatacatcgctagacacaagggtactccattgttgcagcagatcgacactgctctgacc840

ctgcaactggatgctcagggtcagaagctgccaatctctgcacagaacagagtcttgttc900

cttggtggtcatgacaccaacattgccaacatcgctggtatgctgggtgctgactggcag960

cttcctgagcaacctgacaacactccacctggtggtggtctggtcttcgaactctggcag1020

aaccctgacaaccaccagagatacgttgctgtcaagatgttctaccagactatggatcag1080

ttgagaaacgctgagaagttggacctgaagaacaaccctgctggtatcatctctgtcgct1140

gttgctggttgtgagaacaacggtgacgacaagctgtgcgagcttgacaccttccagaag1200

aaggtcgctaaggtcatcgaacctgcttgccacatctaa1239

9）yrappa来源罗德耶尔森菌yersiniarohdeiatcc43380（seqidno.9所示）

gctgcacctgtcatcactgcacctgctggttacactctggagagagtcgtcatcctgtcc60

agacatggtgttcgttctccaaccaaacagacccagttgatgaacgaggtcactcctgac120

aagtggcctcaatggcctgtcaaggctggttacttgactcctagaggtgcacaactcgtc180

actctgctgggtgccttctacggtgagtacttcagatcccagggtttgctgcctgctggt240

tgtcctcctgaaggtactgtctacgcacaagctgacatcgaccagagaaccagactcact300

ggtcaggcattcctggatggtgttgcacctggttgtggtctggaggtccactaccaggct360

gacctgaagaagactgatccactgttccatcctgtcgaagctggtgtctgcaaggttgac420

ttggcacagaccagacaggctgttgagcagagattgggtggtccactgaccaccctgtcc480

cagagatacgccaagccattcgctcagatgggtgaagtcctgaacttcgctgagtctcca540

ttctgcaagtccctccaacagaagggtaagacctgtgacttcgctaccttcgctgccaac600

gagatcgacgtcaacaaggacggtactaaaatctctctgactggtcctctggctctgtcc660

tccactctggctgaaatcttcctgttgcagaactctcaggcaatgcctgatgtcgcatgg720

cacagactgtctggtgctgagaactgggtctccttgctgtctctgcacaacgcacagttc780

gacttgatggctaagactccatacatcgccagacacaagggtactccactgctgcaacag840

atcaacactgcactggtcctccagagagatgctcagggtcagactctgccactgtctcca900

cagaccaaggtcctgttcctgggtggtcacgacaccaacattgccaacatcgctggtatg960

ctcggtgcaaactggcaactgcctcaacaacctgacaacactccacctggtggtggtctg1020

gtcttcgagctgtggcaacatcctgacaaccatcagagatacgtcgctgtcaagatgttc1080

taccagactatggatcagctgagaaacgtcgagaagttgaacctgaccaccaaccctgct1140

ggtatcatccctatcgctgtcgaaggttgcgagaacatgggtgacgacaagctctgtcag1200

ctcgaaaccttcgagaagaagatcgcacaagtcgtcgaacctgcatgtcacatctaa1257

实施例2：植酸酶基因的家族改组文库构建

2.1pcr扩增植酸酶基因及回收

在puc18克隆载体两端设计通用引物，扩增植酸酶基因为模板，引物序列为：pbskz18：gcgattaagttgggtaacgcc（seqidno.10所示）；pbskf18：ggaaagcgggcagtgagcgcaacg（seqidno.11所示），反应条件为：94℃10min预变性，94℃变性30s，50℃退火30s和72℃延伸90s，共30个循环，1%agrose电泳，透吸袋法回收1.3kp的基因片段。

2.2dnasei降解dna及回收小片段

回收所有9个基因片段以dnasei缓冲液(50mmol/ltris-clph7.4+1mmol/lmgcl2)100μl溶解；加入0.1udnasei，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10%丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl10×无引物pcr缓冲液(primerlesspcrbuffer)（50mmol/lkcl+10mmol/ltris-clph9.0+1%triton）溶解沉淀。

2.3无引物pcr(primerlesspcr)

将所有9个基因的dnasei降解片段按等比例混合，进行primerlesspcr扩增。反应体系：5μl小片段dna+4μl2.5mmol/ldntps+4.5μl25mmol/lmgcl2+taq2u+ddh2oto50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环），2%agrose电泳检测pcr扩增结果。

2.4有引物pcr(primerpcr)

进行primerpcr扩增反应。反应体系：5μlprimerlesspcr产物+phyiz10.2ng+phyif10.2ng+10×pcrbuffer5μl+2.5mmol/ldntps4μl+taq2u+ddh2oto50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，1%agrose电泳检测，回收1.3kp基因片段。

回收1.3kb的重排植酸酶基因片段，ta克隆连接到puc18克隆载体，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株dh5α获得突变体文库，库容达到10⁸。

将大肠杆菌克隆质粒库上的植酸酶突变基因库双酶切消化，回收突变植酸酶基因的酶切片段在大肠杆菌-酿酒酵母穿梭的酵母表达载体pvt102u/α(专利201510230599.8)的基础上构建突变植酸酶基因的酵母分泌表达质粒库。

实施例3：耐高温高比活植酸酶基因的筛选

将突变文库转化到酿酒酵母，然后突变植酸酶基因的酿酒酵母转化子影印至硝酸纤维素膜上，并分别在原先的固体培养皿和膜上做对应标记。

将带有转化菌落的膜先置于不含组氨酸的固体培养上，28℃下培养24个小时。在培养皿内放三层湿润的无菌滤纸，再将培养后的带菌膜置于滤纸之上，90℃下加热30min个小时，将带有酵母菌落的硝酸纤维素膜置于浸有钼黄试剂的无菌滤纸上进行显色。

选择显色深的菌落区域（存在几百个酵母转化子），该阳性菌落区域被认为含有高温耐受性的突变体。

找出原始固体培养皿上对应的阳性菌落区域，将全部菌落挖下，置培养液中稀释后进行涂板，在固体培养基上进行第二次培养、影印、高温处理和筛选，获得阳性酵母单菌落。

将阳性酵母单菌落分别点于40孔板中进行液体培养（在每块板上的不同部位设3个对照），培养后将板置于90℃下加热30min并进行酶的活性测定，选择高温处理后活性较对照植酸酶基因提高的菌株。具体步骤如下:取150μlsd培养液，每一个孔等量加入40孔培养板，待酵母菌生长到od600=0.4-0.6，将板置于90℃下加热30min。从培养板的孔中取出10μl菌液转移到新40孔培养板，加入植酸钾钠底物，37℃反应30分钟，加入钼蓝显色剂（钼酸胺，硫酸亚铁，浓硫酸）显色。挑取单菌落进行活性比较，获得耐高温高比活的植酸酶基因yppa102。

抽提获得的耐高温高比活植酸酶酵母菌株dna，将dna转化到大肠杆菌，抽提质粒，进行突变基因序列测定，获得的植酸酶基因序列如seqidno.12所示。

实施例4：酵母表达植酸酶载体构建

按突变基因的两端序列设计引物，在基因5’端加入xhoi切点和信号态切割序列，引物为：ymappa1z(5’-aactcgagaaaagagaacctccggagctcctgtcgctgctcctgtcactg-3’)（seqidno.13所示），在基因3’端加入noti切点：引物为：ymappa1f(5’-aacgcggccgcttagatgtggcaagcaggctcgatgacctg-3’)（seqidno.14所示）。扩增片段克隆后,xhoi和noti双酶切,定向插入ppypx88（genbank:ay178633）,该载体对分泌信号肽进行了改造，在mf4i启始密码子atg后增加了毕氏酵母aox1基因atg后的三个氨基酸，分别为a、i和p，此外在mf4i信号肽的中间增加了eeaeaeaepk10个氨基酸。构建成植酸酶的酵母表达载体pyappa102（图1）。

实施例5：植酸酶高表达重组酵母筛选

将活化的酵母菌株pichiapastoris于500mlypd中30℃培养18hr,至od600=1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500，250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml预冷的1mol/l山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮，用于电击感受态。

大量抽提酵母表达载体pyappa102,bglii酶切回收小片段,取2μg线性化片段加入50μl感受态细胞，冰浴5min，用bio-redgenepulser电击仪电击，参数为2.5kv，25μf。电击结束后立即加入1.0ml预冷的1mol/l山梨醇，取200μl涂布于固体选择培养基平板(18.6%山梨醇，2%葡萄糖,1.34%ynb,0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，2%琼脂糖)，30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到mm（1.34%ynb，0.00004%生物素，0.5%甲醇，1.5%琼脂糖）和md（1.34%ynb，0.00004%生物素，2%葡萄糖，1.5%琼脂糖）平板上，30℃培养2d，在md上生长正常而在mm上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。

将重组酵母接种于20mlbmgy(1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%ynb0.000004%生物素，1%甘油)，30℃培养，离心收集菌体，加入20ml诱导培养基bmmy（用0.5%甲醇代替bmgy中的甘油），30℃下继续诱导培养36hr。

以甲醇为唯一碳源的mm培养基和以葡萄糖为碳源的md培养基进行对应培养，进一步筛选定点整合的重组转化子。

将所有的阳性克隆单独接种三角瓶中,30℃培养至od600=4-5,利用甲醇诱导培养36hr,每个诱导菌株取5μl上清液进行sds-page检测，另取10μl上清液稀释100倍，以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法（basfcompany）。取2ml标准酶制剂溶液、样品、空白和对照溶液的玻璃试管按顺序以10秒的间隔时间置于37.0℃的水浴锅中。精确定时5分钟。然后按相同的顺序，相同的间隔时间，向每支试管中加入4.00ml37.0℃植酸钠溶液,并将离心管放入水浴中,精确培养60分钟后,再按相同的顺序以相同的间隔时间加入4.00ml显色/终止缓冲液（在250ml容量瓶中依次加入62.5ml钼酸铵溶液，62.5ml钒酸铵溶液，在缓慢加入41.25ml硝酸（70％），冷却至室温后加入重蒸水定容至刻度。该溶液每日随用随配）。摇匀后终止反应，放置10分钟后,将溶液在4000r/min离心15min。用分光光度计在415nm测定吸收峰，以空气作为仪器零点。

植酸酶酶活性单位（u）定义为：在37℃下，每分钟分解植酸盐释放出1nmol/l无机磷酸所需要的酶量为1u。结合电泳条带和酶活力单位，筛选到4株高效表达植酸酶基因的重组子p.pastorisyappa2，p.pastorisyappa9、p.pastorisyappa43、p.pastorisyappa52。

实施例6：重组菌株的高密度发酵

挑取植酸酶高表达重组酵母p.pastorisyappa9菌株接种200mlyped培养基，30℃培养至od600=3.0，转入b.braun5l发酵罐中进行高密度发酵，以yped培养重组酵母，利用氨水控制ph值为5.5，发酵过程中氧含量控制在20%，培养90hr,甘油耗尽，加入0.5%甲醇，30℃诱导培养。

30℃培养6hr后，重组酵母进入对数生长期，氧消耗加快，须充入纯氧，氧含量控制在20%，在发酵过程中，持续加入氨水调节ph值恒定在5.5，发酵90hr后，od600=110,加入0.5%甲醇诱导培养，诱导不同时间后取3ul无菌体的诱导培养液进行sds-page检测。随着诱导时间的增加，植酸酶的表达量不断提高，120h后，上清液中的表达量保持稳定。重组子p.pastorisyappa9诱导120hr后，植酸酶表达量高达2.5mg/ml。表达的植酸酶分子量大小约为52kd（图2）。

在37℃ph5.5的条件下对含表达产物的培养液进行植酸酶活性测定，重组酵母p.pastorisyappa9培养120hr后，酶活力为13200u/ml，增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。

实施例7：植酸酶性质测定

将底物分别配制成ph=1.5;2.5;3.5;4.5;5.5;6.5,以ph=4.5时的酶活单位为100%，以高密度发酵上清液测定不同ph条件下植酸酶的相对活力。结果表明该植酸酶在ph2.5-6.5之间均有酶活力，ph值为4.5时，植酸酶活性最高(图3)。

将上清液用90℃处理不同时间，放置冰上冷却，加入酶反应底物，37℃反应30min，以未经高温处理的发酵液为参比，测定上清液中的残存酶活性。酶液经过90℃高温处理30min处理，植酸酶的活性仍保持68%(图4)。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因

<130>2017

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1245

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1