特异靶向巨噬细胞的蛋白质传递系统的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于酵母中空β-葡聚糖外壳包裹GMP-BSA的蛋白质靶向巨噬细胞的传递系统。该系统利用壳聚糖(CS)、三聚磷酸盐(TPP)、海藻酸钠与BSA靠静电吸附作用形成的致密层将BSA包被在酵母壳中。该技术制备的GMP-BSA颗粒在体外实验中表现出非常好的蛋白释放行为，并能避免蛋白质丢失。该颗粒高特意靶向巨噬细胞，如Raw 264.7细胞，原代BMDM细胞(原代骨髓巨噬细胞)和腹腔巨噬细胞(PEMs)，而该颗粒并没有被诸如NIH3T3、AD293、HeLa及Caco-2等非巨噬肿瘤细胞和血液中的中性粒细胞吞噬。巨噬细胞在各种疾病的发病机理中起很重要的作用，是非常重要的潜在靶点。此外，巨噬细胞是关键的抗原传递细胞，且在疫苗设计中十分重要。我们认为该体系可高选择性靶向输送各种蛋白到巨噬细胞，在靶向药物给药和在巨噬细胞疫苗设计方面也有广泛的应用前景。
【专利说明】
特异靶向巨噬细胞的蛋白质传递系统
【背景技术】
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[0001]巨噬细胞是先天免疫系统的白细胞，在体内广泛分布。巨噬细胞在先天免疫中发挥着各种免疫功能、活化和免疫反应。因此，巨噬细胞在各种疾病如巨噬细胞活化综合征、风湿性关节炎、动脉硬化、肠炎和肿瘤发生等病理生理方面起重要的作用。基于巨噬细胞在疾病中的调控作用，它们可能成为重要的潜在药物作用靶点。本研究旨在研发靶向巨噬细胞的新药从而抑制和治疗相关疾病。
[0002]另外，巨噬细胞是重要的抗原递呈细胞，它可能有效地诱导特定⑶8+细胞毒性T细胞起免疫反应，通过抗原加工和递呈在适应性免疫(获得性免疫)的特异防卫机制初期起作用。在设计显著有效的疫苗方面，蛋白质和多肽类药物的靶向传递至巨噬细胞是一个有效的策略。巨噬细胞吞噬病原体，首先通过巨噬细胞表面上的识别受体识别病原体相关分子模式做为危险信号导致激活和抗原呈递。
[0003]特异靶向巨噬细胞传递药物分子治疗疾病是个难题，深入研究构建新型载体系统十分必要，开展此项研究首先具备基于巨噬细胞表面的模式识别受体，例如甘露糖受体、Fe受体和补体受体等清除受体，这些受体被巨噬细胞用来清除吞噬的病原体。有时高密度脂蛋白受体、淀粉样蛋白多肽受体和透明质酸受体也能成功用于靶向目标。发展靶向给药系统可能使达到临床效果所用的药物(治疗剂)的减少，也可以有效减少药物引起的毒副作用和其他副作用。包裹或吸附药物分子到载体系统可以保护药物以免在到达巨噬细胞的途中降解或失活。然而，较低的细胞选择性和高异质性是这些系统在实际应用中面临的主要问题，而且载体体系通常需要模式识别受体的配体修饰其载体表面。
[0004]来源于烘焙酵母外壳的β -葡聚糖颗粒，是一种中空的多孔约2-4 μ m的微球，在人类营养学中作为补充品以及在疫苗设计中作为佐剂而广泛应用。该空壳是酵母主要的病原体相关分子模式，由模式识别受体Dectin-1识别，该受体主要在巨噬细胞表面表达凝集素。葡聚糖颗粒可有效被巨噬细胞在体外吞噬。葡聚糖颗粒的中空多孔结构可实现高载药量，这一点也是该结构做为靶向巨噬细胞的载体的优点。近年来，Aouadi等证明了β -葡聚糖包裹SiRNA颗粒做为口服的传递载体有效靶向巨噬细胞，显著沉默了 Map4k4基因，并且保护了动物免受脂多糖引起的杀伤性。然而这种方法由于使用多种成分导致制备过程繁琐，且使用了毒性较大的PEI，因此会降低结果的再现性并引发毒副作用。Huang等人提供了一种简单的包裹制备方法，直接吸收蛋白抗原进入葡聚糖颗粒，这种颗粒在体内做为免疫佐剂可引起有力的免疫反应。然而这种直接吸收制备方法的缺点是从载体上释放吸收的蛋白也很迅速。因此我们需要研制将蛋白质包裹进葡聚糖颗粒的新策略。
【发明内容】
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[0005]本发明构建了一种基于β -葡聚糖颗粒的酵母外壳包被蛋白质“GMP-BSA”结构靶向巨噬细胞传递蛋白质系统。利用从面包酵母分离出的葡聚糖颗粒研制该载体系统。该系统利用壳聚糖(CS)、三聚磷酸盐(TPP)、海藻酸钠与BSA靠静电吸附作用形成的致密层将BSA包被在酵母壳中。该系统能大大减少蛋白质在输送途中释放以及丢失。体外和体内细胞摄取实验表明BSA-1oaded葡聚糖颗粒(GMP-BSA)的识别机制。包被蛋白质并不影响β -葡聚糖颗粒本身的识别机制。GMP-BSA颗粒由巨噬细胞选择性摄取，如Raw 264.7细胞，原代BMDM细胞(原代骨髓巨噬细胞)和腹腔巨噬细胞(PECs)，而该颗粒并没有被诸如NIH3T3、AD293、HeLa及Caco_2等非巨噬肿瘤细胞和血液中的中性粒细胞吞噬。我们认为该体系可高选择性靶向输送各种蛋白到巨噬细胞，在靶向药物给药和在巨噬细胞疫苗设计方面也有广泛的应用前景。
【具体实施方式】
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[0006]1.制备β-葡聚糖颗粒
[0007]酵母S.cerevisiae经过一系列碱性酸性处理步骤得到β _葡聚糖颗粒。3.75g酵母溶于50mL纯水中，用1.0M NaOH调节pH值到12.0-12.5左右，然后60°C边加热边搅拌，I小时后2000g离心1min收集酵母壳沉淀，该沉淀溶于50mL纯水中，用1.0M HCl调节pH值到4-5左右，在55°C边加热边搅拌持续I小时后，离心收集酵母壳沉淀，水洗酵母空壳3遍，异丙醇洗酵母空壳4遍，丙酮洗2遍，真空干燥后得到1.72g酵母壳粉。
[0008]2.荧光素和罗丹明标记葡聚糖颗粒和BSA
[0009]500mg GMP 溶于 50mL 0.1M Na2CO3 (pH 9.2)，5mg FITC 或罗丹明 B 溶于 2mL DMSO中，然后滴加于GMP中，室温下避光搅拌过夜。1mL 1.0M Tris溶液(pH 8.3)加入到上述溶液中搅拌15-30min淬灭未反应的荧光染料，水洗并离心收集标记过的GMP，直至上清无颜色。无水乙醇和丙酮各洗一遍去水，避光真空干燥。
[0010]1mg BSA 溶于 1mL 5mM EDTA 和 1.2mL 0.1M Na2CO3 (pH 9.2)，Img FITC 或罗丹明B溶于0.4mLDMS0中，然后滴加于BSA溶液中，室温下避光搅拌过夜。2mL 1.0M Tris溶液(pH 8.3)加入到上述溶液中室温下搅拌15-30min淬灭未反应的荧光染料，透析去除未反应的荧光染料，避光冻干得到标记的BSA。
[0011 ] 3.制备囊缩 BSA 的 GMP 颗粒(GMP-BSA)
[0012]20 μ L 50mg/mL BSA加入到1mg干酵母壳粉，室温下孵育10_30min，加入20 μ L0.4%ρΗ5.0低分子量CS室温下孵育2小时囊缩BSA进酵母壳。1.0mL过量TPP/Alg(l.0mg/mL TPP, 0.4mg/mL海藻酸钠)加入到酵母壳中，超声1s分散颗粒，搅拌I小时。2000g离心5min收集GMP-BSA，PBS洗三遍，70 %乙醇洗一遍除菌，再用PBS洗三遍，真空冻干得到GMP-BSA 粉末。
[0013]4.GMP-BSA的形态学表征
[0014]使用共聚焦显微镜和JSM-7500F扫描电子显微镜(东京，日本)检测GMP-BSA颗粒的外形和表面特征。酵母壳表面标记上罗丹明B，BSA标记上FITC或者FITC标记在酵母壳表面，罗丹明B标记在BSA上，利用共聚焦显微镜检测颗粒形态和蛋白质在颗粒中的分布。颗粒大小用马尔文激光粒度仪Nano ZS90。结果证明BSA很好地囊缩在GMP里面，且GMP-BSA颗粒都呈2-4 μ m的椭圆形状态。
[0015]5.BSA载药量和包封效率的检测
[0016]GMP-BSA的BSA载药量和包封效率用微量二喹啉甲酸的方法直接检测上清中BCA含量。收集GMP-BSA制备过程中离心得到的上清液用微量BCA定量试剂盒分析。在1.5mL试管中每60 μ L上清混合同等体积的微量BCA检测液，60°C孵育I小时，取100 μ L混合液样品使用酶标仪在570nm处衡量样品的吸光值。上清中BSA的浓度根据已知浓度的BSA曲线计算，空GMP吸附壳聚糖/TPP/海藻酸钠，不加BSA用同样方法制备微球得到的上清溶解BSA制备标准曲线。GMP-BSA的BSA载药量为5.00% ±0.25%，包封效率为49.67%±2.12%。
[0017]6.GMP-BSA 体外释放 BSA
[0018]1mg GMP-BSA和ImL含0.02%叠氮化钠PBS(pH 7.4)在室温下摇床150rpm孵育。在合适的时间点，8000rpm离心5min收集上清，再加入等量的新鲜释放液，释放上清液中的BSA含量使用微量BCA定量试剂盒定量，采用Origin 8.0软件分析BSA含量的变化。在最初的12h里，BSA释放量不到20%，由于壳聚糖海藻酸钠的缓慢降低，该颗粒可以连续缓慢释放BSA2周时间。
[0019]7.SDS-PAGE电泳和⑶光谱证明蛋白的完整性
[0020]取不同时间点15 μ L从GMP-BSA释放的BSA上清做样品，裸BSA为阳性对照。凝胶都是在三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸SDS —次性缓冲液的条件下，使用Tanon天能数显式稳压稳流电泳仪(EPS-300) 180V的恒压模式跑胶，凝胶与考马斯亮蓝染色检测的蛋白质的完整性，结果证明释放的BSA并没有降解。释放的BSA的二级结构用圆二色谱去检测，裸BSA为阳性对照，比色皿为2mm石英圆柱池，样品扫描波长范围为200-260nm。该结果与凝胶结果一致。
[0021 ] 8.BMDM的分离和培养
[0022]C57BL/6J 10周大雌鼠用来制备原代骨髓起源巨噬细胞，该细胞分离于小鼠两侧大腿骨和胫骨，过膜除去杂质，每只小鼠的巨噬细胞接种于1cm培养皿，用含20% FBSU%双抗和30%小鼠成纤维细胞株L929培养3d的上清的DMEM培养基培养，每2天给细胞换液，5天之后准备做后续实验。
[0023]9.腹腔巨噬细胞的分离和培养
[0024]C57BL/6J 10周大雌鼠提前4天先腹腔注射2mL4%蛋白胨肉汤富集腹腔巨噬细胞，然后用PBS顺序腹膜灌洗腹膜腔得到腹腔巨噬细胞。该细胞用RPMI1640培养基重悬以6X 15的密度每孔接种于24孔板中，3小时后用PBS洗掉非贴壁细胞，留下贴壁的巨噬细胞进行后续实验。
[0025]10.活化的Ml和M2型巨噬细胞的分离和培养
[0026]来源于C57BL/6J 10周大雌鼠的骨髓起源巨噬细胞接种于24孔板中培养5天，以IFN-γ (30ng/mL)和LPS(10ng/mL)共同刺激培养36h，诱导出Ml型巨噬细胞，以IL-4(20ng/mL)刺激培养36h，诱导出M2型巨噬细胞，准备后续实验。
[0027]11.共聚焦显微镜检测体外细胞吞噬
[0028]GMP-BSA在细胞水平的吞噬同时在巨噬细胞和非巨噬细胞中进行。对于巨噬细胞，RAW264.7、原代BMDMs、PECs以I X 16个细胞/mL接种于24孔板，6h后不同浓度的GMP-BSA颗粒加入到细胞中孵育12h。PBS洗2遍后用IF488-F4/80单抗定义巨噬细胞，DAPI染核。活化的Ml和M2型巨噬细胞加入12 μ g/mL分别孵育6、12、24h。非贴壁细胞NIH3T3，AD293，HeLa, and Caco-2细胞系进行相同的操作做为阴性对照。PBS洗3遍，固定细胞DAPI染核，共聚焦显微镜检测。结果显示该颗粒高特意靶向巨噬细胞，如Raw 264.7细胞，原代BMDM细胞(原代骨髓巨噬细胞)和腹腔巨噬细胞(PEMs)，而该颗粒并没有被诸如NIH3T3、AD293、HeLa及Caco_2等非巨噬肿瘤细胞吞噬。
[0029]12.细胞毒性试验
[0030]RAff 264.7以5X 13个细胞/mL接种于96孔板，GMP-BSA颗粒以不同的浓度(3-400 μ g/mL)孵育 24h，每孔加入 10 μ L MTT (5.0mg/mL) 37°C孵育 4h，弃上清，加入 100 μ LDMSO溶解甲瓒，在490nm处用酶标仪读取吸光值。结果显示GMP-BSA颗粒在高达400 μ g/mL的浓度下对细胞并没有毒副作用。
[0031]13.体内GMP-BSA吞噬的实施
[0032]C57BL/6J 10周大雌鼠提前4天先腹腔注射2mL 4%蛋白胨肉汤富集腹腔巨噬细胞，然后腹腔注射或静脉注射150 μ L 30mg/kg包裹罗丹明B标记BSA的GMP-BSA颗粒，3h后，提取脾、肝、肺和腹腔巨噬细胞，分离血液中的中性粒细胞做阴性对照，腹腔巨噬细胞从腹腔提出之后，贴壁2h洗去非贴壁细胞，IF488-F4/80单抗染色30min定义巨噬细胞，封片共聚焦显微镜检测结果。脾、肝、肺切成小块，以100U/mL脱氧核糖核酸酶I和胶原酶4在37°C孵育30min。消化过的组织通过10mm滤膜除去杂质，离心收集细胞接种于24孔盘，贴壁2-3h后，洗去未贴壁细胞，IF488-F4/80单抗染色30min定义巨噬细胞，封片共聚焦显微镜检测结果。中性粒细胞通过梯度离心中性粒细胞分离试剂盒提取自静脉注射小鼠的血液，DAPI染核后封片共聚焦显微镜检测结果。结果显示该颗粒高特意靶向巨噬细胞，器官的巨噬细胞和腹腔巨噬细胞(PECs)，而该颗粒并没有被血液中的中性粒细胞吞噬。
【主权项】
1.一种基于酵母中空β -葡聚糖外壳包裹GMP-BSA的新型蛋白质靶向巨噬细胞的传递系统。该系统利用壳聚糖(CS)、三聚磷酸盐(TPP)、海藻酸钠与牛血清蛋白(BSA)靠静电吸附作用形成的致密层将BSA包被在酵母壳中。制备方法为先将BSA加入到空酵母壳中，室温下孵育10-30min，再加入低分子量CS室温下孵育2小时囊缩BSA进酵母壳。最后加入过量TPP/海藻酸钠到酵母壳中，离心收集GMP-BSA，真空冻干得到GMP-BSA粉末。该颗粒高选择性特意靶向输送各种蛋白巨噬细胞，如Raw264.7细胞，原代BMDM细胞(原代骨髓巨噬细胞)和腹腔巨噬细胞(PEMs)，而该颗粒并没有被诸如NIH3T3、AD293、HeLa及Caco_2等非巨噬肿瘤细胞和血液中的中性粒细胞吞噬。2.根据权利要求1所述的蛋白质靶向传递系统的制备方法，其特征在于:用酵母中空外壳囊缩蛋白质做为靶向传递蛋白质系统。3.根据权利要求1所述的蛋白质靶向传递系统的制备方法，其特征在于:蛋白质用TPP、海藻酸钠和壳聚糖包裹在空酵母壳中。4.根据权利要求1所述的蛋白质靶向传递系统的特性，该系统在体外被巨噬细胞系Raw264.7细胞、小鼠分离的腹腔巨噬细胞和骨髓起源巨噬细胞所选择性吞噬。5.根据权利要求1所述的蛋白质靶向传递系统的特性，该系统在小鼠活体被腹腔巨噬细胞和器官内的巨噬细胞所选择性吞噬。6.根据权利要求1所述的蛋白质靶向传递系统的特性，该系统并不被非巨噬细胞吞口蜜。7.根据权利要求1所述的蛋白质靶向传递系统的特性，该系统并不被血液中的中性粒细胞所吞噬。
【文档编号】A61K47/36GK105983100SQ201510080066
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】洪章勇, 于敏, 陈泽铭, 郭文君, 王晋, 冯玉鹏, 孔秀琪
【申请人】南开大学