本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种悬钩子属植物总rna的快速提取方法。
背景技术：
获得高质量总rna是进行分子生物学研究如基因表达水平研究、基因操作如rna干扰、转基因等下游研究的前提条件。悬钩子属植物的树莓、黑刺莓中富含有花青素苷、原花青素等多酚类次生代谢产物，这些物质给总rna提取带来了重重困难：酚类化合物极易被氧化成褐色物质，然后与rna不可逆地结合，导致rna活性丧失，或形成不溶复合物导致在用氯仿抽提时rna的大量丢失。
trizol试剂盒在应对该类植物总rna提取时显得无能为力，而传统的总rna提取方法如ctab、sds等需要较多的植物材料，且需要使用多步抽提来去除多糖、蛋白和基因组dna。目前使用最多的方法是在植物细胞破碎后，使用licl进行rna的选择性沉淀，达到去除基因组dna或多糖的目的。但该方法最大的缺点是耗时太长，一般都选择沉淀过夜。若改成醇沉淀，dna污染特别严重，需要进一步使用dnase处理，然后经过酚-氯仿抽提以灭活dnase，结果造成rna的大量损失。另外，licl沉淀后的洗脱过程要求严格，因为残留的li+，cl-会对后续的逆转录及pcr扩增产生负面的影响。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种悬钩子属植物总rna的快速提取方法，以有效克服上述现有技术的不足。
本发明创造了一种悬钩子属植物总rna的快速提取方法，它包括以下操作步骤：
1)取2ml离心管，向离心管中加入700～1000μl去糖缓冲液，并加入5～15μlβ-巯基乙醇，于-20℃预冷5～10min；
2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1～0.15g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，温柔上下颠倒混匀后于冰上静置10min；
3)在4℃下按照3200×g离心5～10min；
4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入700～1000μl65℃预热的细胞裂解液，涡旋1min，于55～65℃保温20～30min；
5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的ph调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min；
6)在4℃下按照16000×g离心5～10min；
7)将步骤6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入上适量核酸沉淀剂，于-20℃静置30min以上，在4℃下按照16000×g离心10min后弃上清液，保留沉淀；
8)将步骤7)离心所得沉淀用体积分数为70～75％乙醇洗涤后室温风干，用depc处理水溶解后-80℃保存。
所述去糖缓冲液为：0.05m氯化钠、50mmph8.0的乙二胺四乙酸二钠、200mmph8.0的三羟甲基氨基甲烷；
使用碱性细胞裂解液裂解细胞，所述细胞裂解液为：30g/l十六烷基三甲基溴化铵、1.4m氯化钠、50～100mmph8.0的乙二胺四乙酸二钠、100～200mmph8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/l聚乙烯吡咯烷酮k30；
在细胞彻底裂解后，再使用ph调节剂调节混合液ph，使用的ph调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸；
使用的核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇；
核酸沉淀时，使用的无水乙醇体积为上清体积的2～2.5倍；使用异丙醇体积为上清体积的0.8～1倍；
其适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种；
其中植物材料包括但不限于果实、叶片及花。
本发明具有的优点是：与已有ctab法相比，本发明可以快速提取悬钩子属植物各器官组织总rna，用时短，在3小时之内可以轻松完成，而已有方法需要12小时以上。为达到去除蛋白质、多糖以及基因组dna的目的，传统方法需经过2～3轮抽提及2轮以上沉淀，操作步骤繁琐，本方法只进行1轮抽提及1轮沉淀，简化了操作流程。本方法在去蛋白之前增加一步可选的去糖步骤，可以根据rna提取材料中糖分含量高低进行选择，增加了方法的适用性，能适用于悬钩子属植物树莓、黑莓等植物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：
实施例：
一种悬钩子属植物总rna的快速提取方法，它包括以下操作步骤：
1)取2ml离心管，向离心管中加入1000μl去糖缓冲液，并加入15μlβ-巯基乙醇，于-20℃预冷5min；
2)取新鲜植物材料或经液氮速冻后-80℃保存的植物材料0.1g，加入0.1g交联聚乙烯基吡咯烷酮，在液氮冷冻条件下研磨成粉状，迅速转移至步骤1)的离心管中，温柔上下颠倒混匀后于冰上静置10min；
3)在4℃下按照3200×g离心10min；
4)彻底去除步骤3)离心所得上清液，向沉淀中加入1000μl65℃预热的细胞裂解液，涡旋1min，于60℃保温30min；
5)待步骤4)中的混合液冷却至室温后，按顺序加入细胞裂解液等体积的水饱和酚，1/80-1/50裂解液体积的ph调节剂，1/5裂解缓冲液体积的氯仿，剧烈震荡2min；
6)在4℃下按照16000×g离心10min；
7)将步骤6)离心所得上清液转入另一离心管，向管中加入上适量核酸沉淀剂，于-20℃静置30min以上，在4℃下按照16000×g离心10min后弃上清液，保留沉淀；
8)将步骤7)离心所得沉淀用体积分数为75％乙醇洗涤后室温风干，用depc处理水溶解后-80℃保存。
所述去糖缓冲液为：0.05m氯化钠、50mmph8.0的乙二胺四乙酸二钠、200mmph8.0的三羟甲基氨基甲烷；
使用碱性细胞裂解液裂解细胞，所述细胞裂解液为：30g/l十六烷基三甲基溴化铵、1.4m氯化钠、100mmph8.0的乙二胺四乙酸二钠、200mmph8.0的三羟甲基氨基甲烷以及20g/l聚乙烯吡咯烷酮k30；
在细胞彻底裂解后，再使用ph调节剂调节混合液ph，使用的ph调节剂包括但不限于弱酸如冰醋酸、草酸；
使用的核酸沉淀剂包括但不限于无水乙醇、异丙醇；
核酸沉淀时，使用的无水乙醇体积为上清体积的2.5倍；使用异丙醇体积为上清体积的1倍；
其适用于悬钩子属下的树莓、黑莓以及其他种或变种；
其中植物材料包括但不限于果实、叶片及花。
本方法在去蛋白之前增加一步可选的去糖步骤，可以根据rna提取材料中糖分含量高低进行选择，增加了方法的适用性，能适用于悬钩子属植物树莓、黑莓等植物。