重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M1及制备方法与流程

本发明涉及基因改造和蛋白质工程
技术领域：
，具体涉及一种酶活力高、稳定性好、操作简便、适用于大规模生产的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1及制备方法。
背景技术：
：蛋白酶k（proteinasek,ec3.4.21.64）是一种重要的丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌（tritirachiumalbumlimber）的提取物中发现。蛋白酶k具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸c末端邻接的酯键和肽键。蛋白酶k在生化实验中应用较为广泛：在核酸提取中，可以除去核酸中的dna酶和rna酶；在原位杂交中，具有降解包围靶dna蛋白质的作用，可用来处理杂交前的样本，提高检测的灵敏性；在生物检测方面，可以用来检测脑组织中的致病性朊病毒。除此之外，蛋白酶k在污水处理、工业制造、造纸、生物加工过程及饲料等领域展现出良好的应用效果。目前，生产蛋白酶k主要有两条途径：一是由林伯氏白色念球菌经发酵后分离纯化获得，二是通过基因重组表达后获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，故蛋白酶k的产量较低；而且林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度，使其生产成本较高，不适合大规模生产。2008年，来源于林伯氏白色念球菌的蛋白酶k成功在毕赤酵母系统中实现了分泌表达；之后来源于布氏白僵菌的蛋白酶k也成功在毕赤酵母系统中实现了分泌表达，并且重组布氏白僵菌蛋白酶k活性较野生型林伯氏白色念球菌蛋白酶k高出50％。但在实际运用中发现，重组布氏白僵菌蛋白酶k溶液在4℃保存时酶活稳定性较差，酶活降低很快，大规模产业化应用受到限制。技术实现要素：本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种酶活力高、稳定性好、操作简便、适用于大规模生产的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1及制备方法。本发明的技术解决方案是：一种重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1，其特征在于氨基酸序列如seqidno：1所示。上述重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：a.构建重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体表达载体ppic9k-m1合成如seqidno.2所示的m1编码序列并克隆至puc57质粒中，得到puc57/m1质粒；扩增puc57/m1质粒，分别用限制性内切酶ecori、noti将m1编码序列切下，与进行同样双酶切的ppic9k载体连接，将连接产物转化至top10感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，得到重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体载体ppic9k-m1；b.将重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体表达载体ppic9k-m1转化到gs115酵母感受态细胞利用限制性内切酶sali酶切重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体载体ppic9k-m1，再用te缓冲液溶解至浓度为2μg/μl的线性片段，取10μl线性片段与gs115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯中，冰浴5min后电击；之后向电转杯中加入1ml冰预冷的1m山梨醇溶液，混匀后转至1.5mlep管中，30℃静置孵育5h；将菌体悬液每200μl涂布一块md平板上，将md平板置于30℃环境培养至出现单个菌落；c.筛选高拷贝数和mut+表型的gs115/ppic9k-m1酵母单菌落配制浓度5g/lg418的ypd筛选平板，在md平板上挑取200个长出的菌落，点在所述浓度5g/lg418的ypd筛选平板中，再筛选出直径大于2mm的酵母菌落，并以所筛选出的酵母菌落dna为模板dna进行pcr鉴定；所述pcr引物如下：f-aox1：gactggttccaattgacaagc；r-aox1：ggcaaatggcattctgacat；所述pcr体系如下表：所述pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸2min，反应进行30个循环；72℃延伸5min；利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，筛选pcr产物为2200bp、1632bp两条条带的酵母单菌落为高拷贝数和mut+表型的gs115/ppic9k-m1；d.将筛选得到的高拷贝数和mut+表型的gs115/ppic9k-m1的酵母单菌落接种至50mlypd培养基中，30℃，200rpm振荡培养od600为3.0时，再按1%的接种量接种至50mlbmgy培养基中，30℃，200rpm振荡培养至od600为2~6；1500g离心收集菌体，用100mlbmmy培养基重悬菌体，28℃，200rpm继续振荡培养120小时，每24h向发酵液中补加终浓度v/v为0.5%的甲醇；离心培养基，得到含有重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的发酵液上清；e.将发酵液上清经过8,000rpm离心分离、金属离子螯合亲和层析，用含300mmol/l咪唑、ph7.5的洗脱缓冲液洗脱，将收集的洗脱液通过超滤去除咪唑、离子交换柱层析分离、大孔脱色胶脱色和冻干后得到重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1。本发明从改造重组布氏白僵菌的蛋白酶k分子结构入手，得到活性和稳定性均提高的蛋白酶k突变体pk-m1；优化表达系统，利用酵母细胞外分泌表达技术，可大规模发酵高效表达重组蛋白酶k突变体，进一步提高蛋白酶k产量；采用高效亲和层析的蛋白纯化方式，提高蛋白酶k纯化过程中的收率，实现了蛋白酶k的规模化生产。附图说明图1是本发明实施例的重组布氏白僵菌蛋白酶突变体pk-m1氨基酸序列中突变位点的概要图。图2是本发明实施例利用sds-page检测重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1在gs115酵母细胞中的表达结果示意图。图3是本发明实施例利用电泳对所得冻干重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的纯度进行检测的结果示意图。图4是本发明实施例的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的稳定性结果示意图。具体实施方式本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如j.萨姆布鲁克（sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：1.蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法（gb/t25327-2009）。2.酶活单位的定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和ph值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。3.蛋白酶k采用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42.4g/l），三氯乙酸（65.4g/l），梯度ph值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0g/l）。反应过程如下：试管中加入1ml酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1ml，摇匀后40℃温浴10min，加入2ml三氯乙酸溶液，摇匀（空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1ml滤液，加碳酸钠溶液5ml，加福林试剂使用溶液1ml，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的制备方法，按照如下步骤进行：a.构建重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体表达载体ppic9k-m1将氨基酸序列如seqidno：3所示的野生型布氏白僵菌蛋白酶k的dna（seqidno：4所示）编码序列替换为毕赤酵母偏爱密码子组成的dna序列，在其5’端添加ecori酶切位点，3’端顺次添加六聚组氨酸标签、终止密码子taa及noti酶切位点，并在此基础上引入相应突变，如图1所示，h101s、r102t、a103s、k104p、n346g、v347d。利用化学方法合成如seqidno.2所示的m1编码序列（北京六合华大基因科技有限公司）并克隆至puc57质粒中（北京六合华大基因科技有限公司），得到puc57/m1质粒；扩增puc57/m1质粒，分别用限制性内切酶ecori、noti将m1编码序列切下，与进行同样双酶切的ppic9k载体连接，将连接产物转化至top10感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，得到重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体载体ppic9k-m1；b.将重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体表达载体ppic9k-m1转化到gs115酵母感受态细胞利用限制性内切酶sali酶切重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体载体ppic9k-m1，再用te缓冲液（ph8.0）溶解至浓度为2μg/μl的线性片段，取10μl线性片段与gs115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯（两极间隙0.2cm）中，冰浴5min后电击，电击参数：电压1.5kv，电容25μf，电阻250ω；之后迅速向电转杯中加入1ml冰预冷的1m山梨醇溶液，混匀后转至1.5mlep管中，30℃静置孵育5h；将菌体悬液每200μl涂布一块md平板（13.4g/l酵母基础氮源；0.4mg/l生物素；20g/l葡萄糖，1.5%琼脂）上，将md平板置于30℃环境培养至出现单个菌落；c.筛选高拷贝数和mut+表型的gs115/ppic9k-m1酵母单菌落配制5g/lg418浓度的ypd筛选平板（酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，1.5%琼脂），在md平板上挑取200个长出的菌落，点在所述g418浓度的ypd筛选平板中，再筛选出直径大于2mm的酵母菌落。分别挑取所筛选出的直径大于2mm的酵母单菌落接种至3mlypd培养基中，30℃，200rpm振荡培养24h，使用酵母基因组提取试剂盒提取基因组dna，以该基因组dna作为模板dna，对所筛选出的酵母菌落进行pcr鉴定。所述pcr引物如下：f-aox1：gactggttccaattgacaagc；r-aox1：ggcaaatggcattctgacat；pcr体系如下表：反应体系体积（μl）2×taqmix10f-aox10.4r-aox10.4模板dna0.4ddh2o8.8pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸2min，反应进行30个循环；72℃延伸5min；利用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，筛选pcr产物为2200bp、1632bp两条条带的酵母单菌落为高拷贝数和mut+表型的gs115/ppic9k-m1；d.将筛选得到的高拷贝数和mut+表型的gs115/ppic9k-m1的酵母单菌落接种至50mlypd培养基（酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l）中，30℃，200rpm振荡培养od600为3.0时，再按1%的接种量接种至50mlbmgy培养基（酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，ynb13.4g/l，0.1mol/lph6.0磷酸缓冲液，生物素0.4mg/l，甘油10g/l）中，30℃，200rpm振荡培养至od600为2~6；1500g离心收集菌体，用100mlbmmy培养基（酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，ynb13.4g/l，0.1mol/lph6.0磷酸缓冲液，生物素0.4mg/l，甲醇5ml/l）重悬菌体，28℃，200rpm继续振荡培养120小时，每24h向发酵液中补加终浓度v/v为0.5%的甲醇；离心培养基，得到含有重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的发酵液上清，置于-70℃保存；如在发酵罐扩大培养过程中，菌体生长阶段温度控制在28℃，诱导表达阶段温度控制在25℃，整个发酵过程中ph控制在7.0。甲醇诱导时间为120小时，溶氧量控制在35%。诱导剂甲醇的补加和溶氧量偶联，当溶氧量高于35%时补加甲醇，重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的表达量可以达到2g/l发酵液。该产率优于目前现有的蛋白酶k工业生产方法的产率（0.3~0.5g/l发酵液），从而使得后期纯化、冻干的高收率成为可能，为规模化工业生产提供了条件。e.将发酵液上清经过8,000rpm离心分离、金属离子螯合亲和层析，用含300mmol/l咪唑、ph7.5的洗脱缓冲液洗脱，将收集的洗脱液通过超滤去除咪唑、离子交换柱层析分离、大孔脱色胶脱色和冻干后得到重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1，综合收率相比现有技术提高了80%。对所得重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1氨基酸序列分析，其氨基酸序列如seqidno：1所示，即氨基酸序列第101位的his突变为ser、第102位的arg突变为thr、第103位的ala突变为ser、第104位的lys突变为pro、第346位的asn突变为gly、第347位的val突变为asp；所述“101位”……“329位”并不是表示从n端起的绝对位置，而是表示与seqidno.3的氨基酸序列相比的相对位置。实验：1.利用sds-page检测含有重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1在酵母细胞gs115/ppic9k-m1中的表达：sds-page配方如下：12%分离胶（ml）5%浓缩胶（ml）超纯水3.33.430%聚丙烯酰胺溶液（29:1）4.00.831.5mol/ltris溶液（ph8.8）2.50.631.5mol/ltris溶液（ph6.8）10%sds0.10.0510%过硫酸铵溶液0.10.05temed0.0040.005在小烧杯中依次加入12％分离胶所需溶液成分，灌入预先装配好的双层玻璃板的间隙中，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。再在小烧杯中依次加入5％浓缩胶所需溶液成分，灌入双层玻璃板间已凝聚的分离胶上方的间隙，室温放置20min以上，直至凝胶聚合完全。2×sds蛋白上样buffer配方：1.5mtris-hclph6.81ml，sds0.4g，溴酚蓝0.02g，甘油4ml，加双蒸水定容至10ml。将gs115/ppic9k-m1的发酵液上清由-70℃取出，冰上融化后取10μl上清液混合等体积的2×sds蛋白上样buffer，以沸水浴处理10min，12000g离心1min，吸取上清加入到如上制备的凝胶的样品孔道中，上样量为10μl。同时加入蛋白质分子量标准，120v恒压电泳1h。卸下凝胶。按下述配方配制染色液和脱色液，进行考马斯亮蓝染色，以观察样品中的目的蛋白条带。染色液配方：双蒸水650ml；异丙醇250ml；醋酸100ml；1g考马斯亮蓝r-250。脱色液配方：双蒸水850ml；乙醇50ml；醋酸100ml。结果如图2所示，摇瓶条件下在发酵液上清中观察到分子量29kd的明显目的蛋白条带。其中，蛋白质分子量标准（maker）的3条可见的蛋白条带分别表示48kd、35kd及25kd。结果表明，本发明的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1能够在酵母细胞中有效表达。2.重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1酶活测定采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(gb/t25327-2009)，在ph7.5条件下，分别检测蛋白酶prok和本发明实施例所制备的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1冻干粉的蛋白酶k酶活。所述蛋白酶prok是按照本发明实施例的制备方法，将野生型布氏白僵菌蛋白酶k的dna编码序列prok（seqidno.4）重组克隆纯化冻干得到的冻干粉。结果如下所示：pk-m1prok酶活（u/mg）48.730.3可见，本发明制备得到的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1酶活性明显优于野生型蛋白酶k。3.利用sds-page检测纯化冻干后的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的纯度。结果如图3所示。观察到分子量29kd的明显目的蛋白条带。其中，蛋白质分子量标准（maker）的3条可见的蛋白条带分别表示48kd、35kd及25kd。结果表明，纯化冻干后的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1具有极高的纯度（99%）。4.重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的稳定性对以溶液形式存放于-20℃的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1和以冻干粉形式存放于4℃的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1的酶活稳定性进行了检测。结果如图4所示。重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1冻干粉的酶活力在一年内基本保持不变；溶液形式的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1在一年后也保留了95%以上的酶活，表明利用本发明方法制备的重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1具有极高的稳定性。序列表<110>大连博格林生物科技有限公司<120>重组布氏白僵菌蛋白酶k突变体pk-m1及制备方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>365<212>prt<213>人工序列(proteinasek)<220><221>variant<222>(1)..(365)<400>1alaprovalvalgluproalaproleuileglualaargglyglnthr151015ilealaglyasntyrilevallysleulysaspthralathrmetser202530ilemetaspalaalaserlysvalserlysprolysphevaltyrthr354045aspvalpheproglytyralaalaserleuserproglugluvalglu505560argleuarghisaspproasnvalgluserilegluglnaspalaile65707580valserileasnalailevalargglnproglyalaprotrpglyleu859095glyargileserserthrserproglyaspthrthrtyrvaltyrasp100105110serthralaglyglnglyalacysvaltyrvalileaspthrglyval115120125glualathrhisprogluphegluglyargalalysglnvallysthr130135140phevalserglyserlysaspglyhisglyhisglythrhiscysala145150155160glythrileglyserlysthrtyrglyvalalalyslysvalserile165170175pheglyvallysvalleugluaspserglyserglyserleusergly180185190valilealaglymetasptyrvalalaglnaspargargthrargser195200205glucysthrlysglyalailealasermetserleuglyglyglytyr210215220seralaalavalasnlysalaalaalaasnleuglnalaserglyval225230235240phevalalavalalaalaglyasnaspasnargaspalaalaasnthr245250255serproalasergluproservalcysthrvalglyalathraspser260265270seraspargargserserpheserasntyrglylysvalleuaspile275280285phealaproglythrglyileleuserthrtrpileasnglyglythr290295300asnthrileserglythrsermetalathrprohisilealaglyleu305310315320glyalatyrleutrpvalleuglylysglythralaglyasnleucys325330335lysvalileglnaspleuserthrlysglyaspleuthrglyvalpro340345350serglythrvalasntyrleualapheasnglyalathr355360365<210>2<211>1130<212>dna<213>人工序列(proteinasek)<220><221>exon<222>(1)..(1130)<400>2gaattcgctccagttgttgaaccagctccattgattgaagctagaggccaaactattgct60ggtaactacatcgttaagttgaaggacaccgccactatgtctattatggatgctgcttcc120aaggtttctaagccaaagtttgtctacactgacgtttttccaggttacgctgcttctttg180tctccagaagaggttgaaagattgcgtcatgatccaaacgttgagtctattgaacaagac240gctatagtctccattaacgccattgtcagacaaccaggtgctccatggggtttgggtaga300atttcttctacttctccaggtgatactacttacgtctacgattctactgctggtcaaggt360gcttgtgtttacgttattgacaccggtgttgaagctactcatccagaatttgaaggtaga420gccaagcaagttaagactttcgtttccggttctaaggatggtcatggtcatggtactcat480tgtgctggtactattggttctaagacttacggtgttgctaagaaggtgtctattttcggt540gtcaaggttttggaagattctggttctggttctttgtctggtgttattgctggtatggat600tacgttgctcaggatagaagaactcgttccgaatgtactaagggtgctattgcttctatg660tctttgggtggtggttactctgctgctgttaacaaggctgctgctaacttgcaagcttct720ggtgtttttgttgctgttgctgctggtaacgataacagagatgctgctaacacttctcca780gcttctgaaccatctgtttgtactgttggtgctactgattcttctgacagaagatcctcc840ttttctaactacggtaaggtcttggatatttttgctccaggtaccggtattttgtctact900tggatcaacggtggtactaacactatttctggtacctctatggctactccacatattgct960ggtttgggtgcttacttgtgggttttgggtaagggtactgctggtaacttgtgcaaggtt1020attcaagacttgtccaccaagggtgatttgactggtgttccatctggtactgttaactac1080ttggcttttaacggtgctactcaccatcaccaccatcactaagcggccgc1130<210>3<211>365<212>prt<213>人工序列(proteinasek)<220><221>conflict<222>(1)..(365)<400>3alaprovalvalgluproalaproleuileglualaargglyglnthr151015ilealaglyasntyrilevallysleulysaspthralathrmetser202530ilemetaspalaalaserlysvalserlysprolysphevaltyrthr354045aspvalpheproglytyralaalaserleuserproglugluvalglu505560argleuarghisaspproasnvalgluserilegluglnaspalaile65707580valserileasnalailevalargglnproglyalaprotrpglyleu859095glyargileserhisargalalysglyaspthrthrtyrvaltyrasp100105110serthralaglyglnglyalacysvaltyrvalileaspthrglyval115120125glualathrhisprogluphegluglyargalalysglnvallysthr130135140phevalse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