有机磷水解酶及用途的制作方法

本发明涉及有机磷水解酶及用途，属于去除农残和环保领域。

背景技术：

我国的化学农药使用量每年达100万吨左右，其中高毒的杀虫剂产量在我国农药中位居第一。有机磷农药的大规模使用引发了一系列严重的问题。其对环境中地下水、地表水等水资源和土壤的污染，对生物体的非靶向毒害作用，在食物中的残留以及对人类健康的威胁等问题已成为全球普遍关注的焦点，有机磷化学战剂对人类和环境造成的污染也是一件十分棘手的问题。

用来降解有机磷农药的酶有很多，其中有机磷水解酶最有应用前景。它通过破坏磷酯键，使有机磷农药分子的毒性消失。由于不同种类有机磷农药的区别大都在取代基上，磷酯键仍然是大部分有机磷农药的产生毒性的关键部分，所以有机磷水解酶可水解多种底物，具有较好的广谱性。目前已经投入使用的有机磷水解酶是北京森根比亚生物工程技术有限公司的比亚酶。但比亚酶活性较低，而且采用毕赤酵母菌发酵制得，产量低且工艺较复杂。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供第一种有机磷水解酶。

本发明的第二个目的是提供第二种有机磷水解酶。

本发明的第三个目的是提供第三种有机磷水解酶。

本发明的第四个目的是提供第一种有机磷水解酶的用途。

本发明的第五个目的是提供第二种有机磷水解酶的用途。

本发明的第六个目的是提供第三种有机磷水解酶的用途。

本发明的技术方案概述如下：

有机磷水解酶mopd1，其氨基酸序列用seqidno.1所示。

有机磷水解酶mopd2，其氨基酸序列用seqidno.5所示。

有机磷水解酶mopd3，其氨基酸序列用seqidno.6所示。

有机磷水解酶mopd1降解有机磷的用途。

有机磷水解酶mopd2降解有机磷的用途。

有机磷水解酶mopd3降解有机磷的用途。

本发明的优点：

本发明成功改造获得能高效降解毒死蜱的有机磷水解酶基因，并成功构建了含有该基因的重组表达载体，建立了制备有机磷水解酶的方法获得了有机磷水解酶。本发明有机磷水解酶降解有机磷活性高，极大地提高了有机磷水解酶对毒死蜱等有机磷农药的降解活性。

附图说明

图1为四个重组菌株的有机磷水解酶对毒死蜱降解活性。

具体实施方式

本发明所使用的是大肠埃希氏菌sybe_002444。大肠埃希氏菌(escherichiacoli)

sybe_002444，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏并存活，保藏号cgmccno.7961。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明所用表达载体pmopd由人工合成得到，该表达载体含有组成型trc启动子，使用卡那抗生素抗性进行筛选，并且仅含有本发明涉及的若干常用酶切位点，其核苷酸序列如seqidno.9所示。

lb培养基组成为：10g/lnacl、10g/l蛋白胨和5g/l酵母粉，余量为蒸馏水，定容至1l，按100ml分装后高压121℃蒸汽灭菌20min。使用前，在超净工作台上加入已灭菌的卡那霉素至终浓度为50mg/l。

含有葡萄糖的m9培养基组成为：称取na2hpo4.7h2o64g，kh2po415g，nacl2.5g，nh4cl5.0g，酵母粉5.0g,用蒸馏水溶解，定容至1l，按50ml分装后高压121℃蒸汽灭菌20min。使用前，在超净工作台上加入已灭菌的0.1mlmgso4·7h2o(1m)、1.25ml葡萄糖[20％(w/v)]、5μl的cacl2(1m)及卡那霉素至终浓度为50mg/l。

实施例1

改造型有机磷降解酶突变体和融合体的获得

从核酸数据库选取野生型有机磷水解酶(organophosphorushydrolase，oph，genbank登录号为m29593，基因名称为opd)。为了提高对目前应用最广泛的有机磷农药,如毒死蜱等的降解活性，对野生型oph的8个有益突变位点进行集成,如表1所示，理性设计了全新的改造型有机磷水解酶mopd1，其氨基酸序列如seqidno.1，其编码基因命名为mopd1。选取假单胞杆菌来源的冰核蛋白n端(基因名称为inaqn，蛋白名称为inaqn)作为锚定蛋白，其对应氨基酸序列如seqidno.3。将inaqn与mopd1融合，得到有机磷水解酶mopd2，其对应氨基酸序列如seqidno.5。将3个inaqn串联并与mopd1融合，得到有机磷水解酶mopd3，其对应氨基酸序列如seqidno.6。

表1有机磷水解酶突变位点设计

使用jcat在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合optimizer在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/optimizer/)，同时去除常用酶切位点，对mopd1、inanq、oph编码基因的核苷酸序列进行大肠杆菌密码子优化后，全人工合成，人工合成得到的基因分别命名为mopd1、syninaqn、synopd，其核苷酸序列如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.8所示。mopd1、inaqn、oph所对应的氨基酸序列如seqidno.1、seqidno.3、seqidno.7所示。

用高保真dna聚合酶，建立pcr体系。分别以引物对synopd-f(seqidno.10)和synopd-r(seqidno.11)、引物对mopd1-f(seqidno.12)和mopd1-r(seqidno.13)、引物对syninaqn-f1(seqidno.14)和syninaqn-r1(seqidno.15)为特异性的上下游引物，synopd、mopd1、syninaqn基因片段为模板，大量扩增制备含相应酶切位点序列的synopd、mopd1、syninaqn基因。

pcr过程是，95℃变性5min；95℃变性30s，选择65℃退火30s，由于目标基因长度不同，延伸时间各异，扩增synopd和mopd1延伸时间为40s，扩增syninaqn延伸时间为15s，循环数为30个。扩增含相应酶切位点序列的synopd、mopd1、syninaqn基因，纯化扩增产物后，备用。

实施例2

有机磷降解酶基因重组表达载体的构建

利用载体pmopd为基本骨架，质粒序列见seqidno.11，分别构建重组表达载体pmopd1、pmopd2、pmopd3、pmopd4。具体步骤如下：

(1)重组表达载体pmopd1、pmopd4的构建

将含相应酶切位点序列的mopd1基因片段用fastdigest内切酶bglii和kpni进行酶切，反应体系为：5μl10*fdbuffer，2.5μlbglii、2.5μlkpni、30μl含相应酶切位点序列的mopd1基因片段和10μl超纯水。反应条件为：37℃，2h。并用试剂盒纯化回收得到用bglii和kpni双酶切的mopd1基因片段。将用bglii和kpni双酶切的mopd1基因片段连于相同酶切线性化的表达载体骨架pmopd的trc启动子下游进行连接反应得到pmopd1质粒。其连接反应体系为：1μl10*t4dnaligasebuffer,1μlt4dnaligase,6μl用bglii和kpni双酶切的mopd1基因片段和2μl相同酶切后的表达载体骨架。连接反应条件为：30℃、0.5h。

以同样的方法构建含有synopd基因的载体pmopd4。

(2)重组表达载体pmopd2的构建

对扩增得到的含相应酶切位点序列的syninaqn基因片段用fastdigest内切酶ncoi和bglii进行酶切，并用试剂盒纯化回收得到用ncoi和bglii双酶切的syninaqn基因片段。将用ncoi和bglii双酶切的syninaqn基因片段连于相同酶切线性化的表达载体骨架pmopd1得到pmopd2质粒。其连接反应体系为：1μl10*t4dnaligasebuffer,1μlt4dnaligase,6μl用ncoi和bglii双酶切的syninaqn基因片段和2μl相同酶切后的表达载体骨架pmopd1。连接反应条件：30℃、0.5h。pmopd2质粒表达蛋白为mopd2，由1个跨膜蛋白与改造型有机磷水解酶组成的融合蛋白。

(3)重组表达载体pmopd3的构建

用高保真dna聚合酶，建立pcr体系。以syninaqn-f2(seqidno.16)和syninaqn-r1(seqidno.15)为特异性的上下游引物，syninaqn基因片段为模板，扩增制备含同尾酶bamhi和bglii酶切位点序列的syninaqn基因。pcr过程是，95℃变性5min；95℃变性30s，选择65℃退火30s，延伸时间为15s，循环数为30个。纯化扩增产物后，分成两组，用fastdigest内切酶bamhi和bglii分别进行单酶切，并用试剂盒纯化回收得到不同单酶切后的syninaqn基因片段。将这两组分别经过单酶切的syninaqn基因片段用t4dna连接酶连接可得到2个syninaqn串联的片段2syninaqn。

对得到的2syninaqn基因片段用fastdigest内切酶bamhi和bglii进行酶切，并用试剂盒纯化回收得到用bamhi和bglii双酶切的2syninaqn基因片段。将用bamhi和bglii双酶切的2syninaqn基因片段连于用bglii单酶切线性化的表达载体骨架pmopd2质粒得到pmopd3质粒。pmopd3质粒表达酶为mopd3，由3串联跨膜蛋白与改造型有机磷水解酶组成的融合蛋白。

构建的载体和菌株如表2所示。

表2本发明使用基因及其构建表达载体与菌株

实施例3

重组大肠杆菌细胞的获取及有机磷水解酶降解活性

1.重组大肠杆菌细胞的获取

将所构建的载体pmopd1、pmopd2、pmopd3、pmopd4分别电击转化进入宿主细胞e.colisybe_002444中，分别得到重组菌株ope1、ope2、ope3、ope4。

2.有机磷水解酶的生产

将重组菌株ope1、ope2、ope3、ope4分别在37℃的lb培养基中培养至对数期，转接到含有葡萄糖的m9培养基中发酵,发酵温度为30℃，摇床转速为200rpm，目标蛋白达到最大生产量时，结束发酵得发酵液。取发酵液10ml，离心，收获细胞，用ph＝7.4的pbs缓冲液5ml重悬，超声破碎后12000r/min离心10分钟，上清即为有机磷水解酶溶液。

3.有机磷水解酶对毒死蜱农药的降解效果

采用毒死蜱农药来进行有机磷水解酶的酶降解活性测定,测定方法如下：

以不同浓度毒死蜱的正己烷溶液为横坐标，其浓度分别为10、20、40、80、160mg/ml；以不同浓度毒死蜱的正己烷溶液在293nm波长的吸光度值为纵坐标，可得毒死蜱的标准曲线。毒死蜱的浓度与吸光度成线性关系，其相关系数为0.999，其回归方程为y＝0.0176x-0.0005。

取有机磷水解酶溶液3ml，加入1ml100mg/ml毒死蜱pbs(ph＝7.4)溶液，37℃反应1h后，加入3滴1mol/l的hcl水溶液终止反应。向反应体系加入nacl至饱和，静置，加入4ml正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层正己烷溶液在293nm处进行吸光度值测定，对比毒死蜱的标准曲线，计算残留毒死蜱的浓度。已降解毒死蜱浓度除以反应体系中总毒死蜱浓度为有机磷水解酶的降解率，用降解率表征酶的降解活性。

野生型有机磷水解酶oph对毒死蜱的降解率为4％，改造型有机磷水解酶mopd1对毒死蜱的降解率为46.5％，改造型有机磷水解酶mopd2对毒死蜱的降解率为54.3％，改造型有机磷水解酶mopd3对毒死蜱的降解率为87％，降解活性分别比oph提高了11.6倍、13.6倍和21.8倍。四个重组菌株的目标产物对毒死蜱降解活性对比如图1所示。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

序列表

<110>天津大学

<120>有机磷水解酶及用途

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