一种连续进样的菌落PCR反应体系配制及进样装置及PCR仪的制作方法

本发明涉及分子生物学器材，更特别地，涉及一种连续进样的pcr反应体系配制及进样装置及pcr仪。

背景技术：

聚合酶链式反应(pcr)是分子生物学的奠基技术，其原理是，利用dna在95℃左右的高温使双链dna解链，在降温后，高浓度的引物与解链的dna模板之间退火，再将反应体系的温度调节至聚合酶活性温度，使聚合酶沿着沿着磷酸到五碳糖(5’-3’)的方向合成互补链。基于聚合酶制造的pcr仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

自perkin–elmercetus公司第一台pcr仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr仪。在短短的几年间，pcr仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。

pcr技术虽然得到了很大的发展，但是所有的pcr仪都是通过以下方法来控制pcr反应的：将装有pcr反应体系的pcr管置于固定的控温底座的控温孔中，并紧贴控温孔的内壁，通过控制控温孔壁的温度来控制pcr管及其内部所装的反应体系的温度。这类装置虽然已经普遍化，然而它存在着一些不可克服的缺点。

耗时长是最主要缺点之一。正常的pcr反应一般包括30个循环，其中变性30s、退火30s、延伸30s/kb。加上初始变性5min，终末延伸10min，扩增1kb的片段只需要一个半小时左右的时间。然而，在pcr仪上进行反应时，我们发现，扩增1kb的片段往往需要至少超过2小时的时间。其原因在于，pcr仪中样品的位置是固定的，所以，必须操控控温底座的温度改变至反应进行到的阶段所需要的温度。30个循环，每次循环有3次变温，也就是说需要进行90次左右的变温。这接近100次的升降温过程需要消耗大量的时间。

除了在升降温过程中耗费时间外，现有的pcr还有一个巨大的缺点在于，不适合全自动化操作。由于循环反应在固定的位置进行，需要在pcr管中配制反应体系，然后将装有反应体系的pcr管转移至pcr仪的反应孔中。由于经常需要配制多个反应体系(例如，模板不同、引物不同等)，无论体系配制和pcr管的转移，都需要花费大量人力，无法做到全自动。目前为止，还没有任何仪器能做到从pcr体系配制到pcr反应完成的全自动化。pcr反应中还有一种比较特殊的pcr反应较菌落pcr，即，将除模板以外的反应组分配制配制好后，用牙签等菌落挑取器挑取单菌落，并将粘有菌落的那端浸渍于反应组分混合液中，以此向反应组分混合中添加模板，从而配制成pcr反应体系。

技术实现要素：

申请人发明了一种管式控温装置，使反应体系从反应管入口进入，经过管身，反应体系的温度通过热传导而与所处位置的管身温度相同，并在该温度下进行反应。

基于该装置，本发明提供了一种连续进样的pcr反应体系配制及进样装置包括反应组分提供部、混合室、进样管和洗液提供器，所述混合室的顶部设置有允许菌落挑取器穿过的开口，所述反应组分提供部的出口与所述混合室连通，所述洗液提供器的出口与所述混合室的入口连通，所述混合室的出口与进样管连接，所述混合室的反应体系出口处设置有反应体系出口阀，所述混合室还设置有废液出口，所述废液出口与废液排出管连接，并且，所述废液出口处设置有废液排出阀。

通过使用该用于菌落pcr的反应体系配制及进样装置，使用者可不再承受配制pcr体系的繁重工作，尤其当样品多达几十个甚至数百个时。仅需要设定体系配制参数，通过控制系统，指示反应组分提供部中设置的剂量泵向混合室中加入设定量的相应组分，然后将菌落挑取器的粘有单菌落的一端通过所述开口浸渍于反应组分混合物中，即可完成pcr体系配制，配制得到的pcr反应体系通过进样管被直接泵入管式控温装置中，即可进行pcr反应。

当一个反应体系配制好并通过进样管进入管式控温装置后，洗液提供器通过计量泵向混合室中加满洗液，对混合室进行洗涤，洗液通过废液出口和废液排出管排出，洗涤后的混合室继续用于下一个pcr反应体系的配制，并将配制得到的pcr反应体系通过经反应体系出口、进样管被直接泵入管式控温装置中。从而使得在同一个管式控温装置中同时进行多个pcr反应。

在一个优选实施方案中，所述洗液可为水或聚合酶的缓冲液。

在一个实施方案中，所述反应组分提供部为装有混合反应组分的装置。

优选地，所述反应组分提供部中装有pcr反应体系中除模板外所有其他组分的混合物。即，所述反应组分提供部中装有含有缓冲液、酶、dntp、引物对的混合液。

在另一个实施方案中，所述反应组分提供部包括多个组分提供器和一个预混室，每个所述组分提供器的出口均与所述预混室的入口连通，所述预混室的出口与所述混合室的入口连通。组分提供器分别装有各组分，并根据设定的值通过计量泵输入到预混室中，从而得到可用于多个pcr反应量的混合物，预混室中的计量泵将一个pcr反应的量的混合物输入混合室中，然后向混合室中插入粘有单菌落的菌落挑取器，从而配制成pcr反应体系。

具体地，所述多个组分提供器分别向所述预混室供应pcr反应缓冲液、核苷酸、聚合酶和引物对。

在一个实施方案中，该装置还设置有隔离流体提供器，所述隔离流体提供器中装有隔离流体，所述隔离流体提供器的出口与所述进样管连通。当一个反应体系进入管式控温装置后，隔离流体提供器通过计量泵向进样管中注入一定量的隔离流体，以隔开相邻两个反应体系，并且可维持反应体系两端的压强。

在一个实施方案中，所述隔离流体为空气、惰性气体或矿物油。

本发明还涉及一种全自动pcr仪，其包括上述pcr反应体系配制及进样装置以及管式控温装置，所述pcr反应体系配制及进样装置与所述管式控温装置通过所述进样管连通。

附图说明

图1为实施例1的反应体系配制及进样装置的示意图；

图2为反应组分提供部的一个实例的示意图；

图3为控温装置的一个实例的示意图；

图4为控温装置一个实例的横截面视图；

图5为控温装置的一个实例的横截面视图；

图6为为控温装置的一个实例的示意图；

附图中，各标号所代表的部件列表如下：

1、反应组分提供部，101、固定组分提供器，102、预混室，2、开口，3、混合室，4、进样管，5、控温柱，6、反应管管身，7、入口，8、出口，9、反应产物排出管，10、洗液提供器，11、反应体系出口，12、废液出口，13、废液排出管，14、隔离流体提供器，501、变性区，502、退火区，503、延伸区，601、变性区段，602、退火区段，603、延伸区段，604、绝缘短管，701、出口阀，801、阀。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

如图1所示，该实施例的连续进样的pcr反应体系配制及进样装置包括反应组分提供部1、混合室3、进样管4和洗液提供器10，所述混合室3的顶部设置有允许菌落挑取器穿过的开口2，所述反应组分提供部1的出口与所述混合室3连通，所述洗液提供器10的出口与所述混合室3的入口连通，所述混合室3的出口11与进样管4连接，所述混合室3的反应体系出口11处设置有反应体系出口阀，所述混合室3还设置有废液出口12，所述废液出口12与废液排出管13连接，并且，所述废液出口12处设置有废液排出阀。所述反应组分提供部1为装有反应组分混合物的装置。

优选地，所述反应组分提供部1中装有pcr反应体系中除模板外所有其他组分的混合物。

通过使用该pcr反应体系配制及进样装置，使用者可不再承受配制pcr体系的繁重工作，尤其当样品多达几十个甚至数百个时。仅需要设定体系配制参数，通过控制系统，指示反应组分提供部1中的剂量泵向混合室3中加入设定量的相应组分，然后将菌落挑取器的粘有单菌落的一端通过所述开口浸渍于反应组分混合物中，即可实现全自动完成pcr体系配制，配制完成后，出口阀打开，pcr反应体系通过进样管4被直接泵入管式控温装置中，即可完成pcr反应。在本实施例中，需要先配制好反应组分混合物，将混合物加入到反应组分提供部1中。

当一个反应体系配制好并通过进样管进入管式控温装置后，洗液提供器通过计量泵向混合室中加满洗液，对混合室进行洗涤，洗液通过废液出口和废液排出管排出，洗涤后的混合室继续用于下一个pcr反应体系的配制，并将配制得到的pcr反应体系通过经反应体系出口、进样管被直接泵入管式控温装置中。从而使得在同一个管式控温装置中同时进行多个pcr反应。

实施例2

如图1和2所示，本实施例的反应体系配制及进样装置包括反应组分提供部1、混合室3、进样管4和洗液提供器10，所述混合室3顶部设置有允许菌落挑取器穿过的开口2，所述反应组分提供部1的出口与所述混合室3均连通，所述洗液提供器10的出口与所述混合室3的入口连通，所述混合室3的出口11与进样管4连接，所述混合室3的反应体系出口11处设置有反应体系出口阀，所述混合室3还设置有废液出口12，所述废液出口12与废液排出管13连接，并且，所述废液出口12处设置有废液排出阀。

所述反应组分提供部1包括多个组分提供器101和一个预混室102，每个所述组分提供器101的出口均与所述预混室102的入口连通，所述预混室102的出口与所述混合室3的入口连通。所述多个反应组分提供器101分别向所述预混室102供应pcr反应缓冲液、核苷酸、聚合酶和引物对。反应组分提供器101分别装有各组分，并根据设定的值通过计量泵输入到预混室102中，从而得到可用于多个pcr反应量的混合物，预混室102中的计量泵将一个pcr反应的量的混合物输入混合室中，然后将菌落挑取器的粘有单菌落的一端通过所述开口浸渍于反应组分混合物中，从而配制成pcr反应体系。

在一个优选实施方案中，所述用于菌落pcr的反应体系配制及进样装置还可设置有机械手。机械手可自动夹持菌落挑取器挑取单菌落，并浸渍于混合室中，配制成pcr反应体系，从而实现菌落pcr从反应体系的配制和上样的全自动化。

实施例3

如图1所示，本实施例的装置还设置有隔离流体提供器14，所述隔离流体提供器14中装有隔离流体，所述隔离流体提供器14的出口与所述进样管4连通。当一个反应体系进入管式控温装置后，隔离流体提供器通过计量泵向进样管中注入一定量的隔离流体，以隔开相邻两个反应体系，并且可维持反应体系两端的压强。

在一个实施方案中，所述隔离流体为空气、惰性气体或矿物油。

本发明还涉及一种全自动pcr仪，其包括上述pcr反应体系配制及进样装置以及管式控温装置，所述pcr反应体系配制及进样装置与所述管式控温装置通过所述进样管4连通。

实施例3

本发明的全自动pcr仪包括上述的pcr反应体系配制及进样装置以及管式控温装置，所述pcr反应体系配制及进样装置与所述管式控温装置通过所述进样管4连通。

如图3所示，该控温装置包括控温柱5和反应管，所述反应管包括入口7、出口8和管身6，所述反应管的管身6螺旋盘绕在所述控温柱上5，所述入口7与进样管4连通，所述出口8与反应产物排出管9连通。

运行过程中，反应体系通过进样管4从入口7进入，经过管身6，反应体系的温度通过热传导而与所处位置的管身6温度相同，并在该温度下进行反应，完成反应后从反应产物排出管9出来。这样的管式控温装置可用于营造恒温反应和温度循环变化反应的反应环境。

在另一个实施方案中，如图4所示，控温装置的控温柱5横截面的外周划分为三个恒温加热区，依次为变性区501、退火区502和延伸区503，所述变性区501的温度为90-98℃，所述退火区502的温度为45-70℃，所述延伸区503的温度为70-75℃，所述反应管的入口7位于所述变性区501的靠所述退火区503的一端，所述反应管的出口8位于所述延伸区503靠所述变性区501的一端。该装置可用于pcr仪中，作为pcr反应的控温装置。

三个恒温加热区的划分使得在反应管中形成一个pcr循环的三个阶段中所需的温度，并且在该控温装置中，这三个温区都是恒温，不需要在变性温度-退火温度-延伸温度之间进行循环切换。反应体系从变性区开始依次流过退火区、延伸区，完成一次pcr的温度循环，从而每绕控温柱运行一次即完成一个循环的pcr反应。

在另一个实施方案中，恒温加热区可包括多个恒温加热单元，部分恒温加热单元组成变性区，部分组成退火区，部分组成延伸区。可通过改变各区中的恒温加热单元的数量来调节各区的长度，从而控制反应时间。

在另一个实施方案中，控温柱和管身可分为三段，一段用于起始变性阶段，一段用于循环反应阶段，还有一段用于终末延伸阶段。

在另一个实施方案中，如图5所示，控温装置反应管的管身6根据所处恒温加热区分段，每圈螺旋相应地形成三个恒温区段，依次为变性区段601、退火区段602和延伸区段603，并且相邻的区段之间通过热绝缘材料制成的短管604连通。通过在相邻的区段之间采取热绝缘的短管604连通，更好地避免了管身6的不同恒温区段之间的热传递。本实施例中所谓的热绝缘材料是指热传导率较低的材料，而非绝对不导热的材料。

在一个更优选的方案中，所述控温柱5表面具有与所述反应管管身6相匹配的螺圈凹槽，所述反应管管身6嵌入所述螺圈凹槽中。该设置使得能够更好更精确地控制反应管管身6的温度。更优选地，所述螺圈凹槽对应的恒温加热区之间由热绝缘材料隔开，更好地隔离相邻恒温加热区之间的热传导。本实施例中所谓的热绝缘材料是指热传导率较低的材料，而非绝对不导热的材料。

在另一个实施方案中，如图6所示，所述管身具有多个出口8，分别位于距所述入口7不同的螺圈数处，并且每个出口8都设置有出口阀801，离入口7最远的出口8可不设置出口阀801。所述出口阀801使得所处的出口处具有两个状态，一个状态是反应体系向下一个螺圈移动，另一个状态是反应体系离开反应管的管身6，从出口出来。例如，反应管管身6可在控温柱1上盘绕30-60圈，并在距入口不同的圈数处设置出口8，设置出口阀801的状态使反应体系经过特定的圈数并从相应的出口8通过与该出口连通的反应产物排出管9出来，从而进行特定的pcr反应循环数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。