本发明属于生物制药领域，具体而言，涉及一种血源性人凝血因子ⅷ的制备方法。
背景技术：
人凝血因子ⅷ(humancoagulationfactorⅷ，fⅷ)是一种主要由肝脏合成的大分子糖蛋白，正常人血液中含量为100～200ng/ml，其编码基因位于x染色体。凝血因子ⅷ缺乏或功能障碍可导致凝血功能异常，称为血友病a(hemophiliaa)。血友病的人群发病率为5～10/10万，男性婴儿发生率约1/5000。冰岛是世界上血友病发病率最高的国家，在男性中的发病率为38.6/10万。我国血友病患病率为2.73/10万，目前估计发病人数约为4～6万，其中80％以上是血友病a。典型血友病患者常自幼年发病、自发或轻度外伤后因凝血功能障碍，出血不能自发停止，严重者在较剧烈活动后也可自发性出血。目前血友病a治疗方法主要应用人凝血因子ⅷ替代疗法。
中国人凝血因子ⅷ批签发数据显示：除去进口重组产品，2016年批签发量为109万瓶(100iu计算)，复合增长率高达37.3％。除去进口重组产品，国内2015年仅有5家企业有批签发记录，主要包括绿十字、华兰生物、山东泰邦、上海莱士等，上海所份额较小。进口重组制品尚不能满足临床需求，国产产品后续仍有提价空间。此外，国内血友病患者仅有约1万人接受治疗，而且预防治疗缺失，随着国内临床对血友病患者福利逐渐重视、生产厂家逐渐增多，凝血因子ⅷ供给量有望大幅提升，凝血因子ⅷ市场尚有较大潜在空间。
当前中国血浆资源极其有限。据世界卫生组织的报告，全球主要发达国家千人口血浆采集量在10升/年以上，以美国2013年为例，共有注册的血浆站400多家，血浆产量达到约29391吨，而我国千人口血浆采集量约为3升/年。2015年，我国原料血浆采集量已上升到近6000吨，仍满足不了约1.2万吨年需求量。所以开发高效地fⅷ生产工艺、提高血浆综合利用率，具有巨大的社会效益和经济效益。
在人血浆中，fⅷ与血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)结合形成fⅷ—vwf复合物的形式存在，该复合物是一种酸性蛋白复合物，其等电点(pi，isoelectricpoint)在5.5～6.0之间，这种特性一定程度决定了fⅷ的纯化方法。随着科学技术的发展，人凝血因子ⅷ的纯化生产工艺有很多，如甘氨酸沉淀、聚乙二醇沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析以及膜层析等技术，当然这些方法也可结合起来使用。对比这些方法，仅采用沉淀方法获得的fⅷ纯度和比活较低，例如bioproductslab公司采用肝素重悬结合甘氨酸沉淀方法生产的factor
因此，临床急需一种更高效率且产品稳定的人凝血因子ⅷ的生产方法。
技术实现要素：
本发明首先涉及一种peg沉淀结合阴离子交换层析制备人凝血因子ⅷ制品的方法。
所述的peg沉淀结合阴离子交换层析制备人凝血因子ⅷ制品的方法包括如下步骤：
步骤(1)、血浆冷沉淀预处理得冷沉淀溶解液；
步骤(2)、peg沉淀及病毒灭活得初提原液；
步骤(3)、阴离子交换层析得精提原液；
步骤(4)、超滤透析得纯化液；
步骤(5)、冻干、干热灭活及包装。
步骤(1)所述的血浆冷沉淀的预处理步骤为：
1)粉碎血浆冷沉淀；
2)将粉碎后的血浆冷沉淀缓慢加入到tris缓冲液中，其中，血浆冷沉淀与tris缓冲液重量比为1:2～1:4(优选为1:3)；
3)水浴搅拌至血浆冷沉淀完全溶解，获得冷沉淀溶解液。
其中，
tris缓冲液ph6.5～ph7.5、温度为20℃～35℃、浓度为0.02mol/l；
水浴搅拌温度为20℃～35℃、时间为0.5～1.5小时；
冷沉淀溶解液ph在7.0～7.6之间。
步骤(2)所述的peg沉淀及病毒灭活步骤为：
1)将peg溶液加入到冷沉淀溶解液中，以hac溶液调节ph至6.2～6.7，水浴搅拌；
2)离心去除沉淀并收集上清液；
3)用孔径不大于1μm的滤器对上清液进行澄清过滤，之后加入s/d母液，温和搅拌灭活病毒得初提原液；
其中，
peg为peg200～6000，优选为peg3000～4000，peg的终浓度为1％～5％，优选为3.0％～4.5％；
水浴搅拌温度为20℃～35℃、时间为0.5～1.0小时；
离心参数为：转速4000～6000rpm，时间10～15min，温度为20℃～30℃；
加入s/d母液后tween80、tnbp终浓度分别为1％和0.3％；
搅拌灭活为：搅拌时间为6小时、温度24℃～26℃水浴搅拌。
步骤(3)所述的阴离子交换层析的步骤为：
1)层析树脂优选为
2)层析步骤为层析柱平衡、初提原液上样、清洗、洗脱得精提原液；
其中，层析柱平衡的步骤为：线速度80～120cm/h，用平衡缓冲液冲洗层析柱3～6个柱床体积；
上样步骤为：线速度80～120cm/h将初提原液上样，完成后用平衡缓冲液继续冲洗2～7个柱床体积；
清洗的步骤为：线速度80～120cm/h，用清洗缓冲液冲洗2～5个柱床体积；
洗脱的步骤为：线速度50～100cm/h，用洗脱缓冲液冲洗2～5个柱床体积，洗脱目的蛋白，收集洗脱液即为精提原液。
其中，所述的各种缓冲液ph都为6.9～7.5，
平衡缓冲液配方为：10mmol/l枸橼酸钠、0.10～0.12mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸、9～10g/l甘氨酸；
清洗缓冲液配方为：10mmol/l枸橼酸钠、0.12～0.15mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸、9～10g/l甘氨酸；
洗脱缓冲液配方为：10mmol/l枸橼酸钠、0.25～0.35mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸、9～10g/l甘氨酸。
步骤(4)所述的超滤透析步骤为：
1)选择截留孔径为100kd的超滤膜包；
2)用透析缓冲液透析3～8个制品体积，优选为7体积，透过端液体ph和电导率与透析缓冲液基本一致；
3)用0.2μm除菌级滤器过滤样品得纯化液，并将纯化液分装。
所述的透析缓冲液配方为：枸橼酸钠2～50mmol/l、氯化钠10～200mmol/l、甘氨酸50～600mmol/l、氯化钙1～30mmol/l、盐酸赖氨酸1～200mmol/l，ph6.5～7.5。
步骤(5)所述的冻干、干热灭活及包装步骤为：
1)预冻：分装纯化液低温入柜，-50℃～-35℃，保持1～10小时；
2)退火：升温至-30℃～-20℃，保持1～10小时，之后降温到-50℃～-35℃，保持5～10小时；
3)一次升华：抽真空至20pa以下，温度-50℃～-35℃之间，保持30～50小时；
4)二次升华：保持真空度在20pa以下，升温至-30℃～-15℃之间,保持10～20小时；
5)保温：二次升华后将冻干粉温度升至35℃以下，真空度维持在20pa以下，保持10～20小时；压塞出柜、轧盖；
6)干热灭活：99.5℃～102℃，水浴灭活30min；
7)以符合生物制品包装规程的操作进行包装。
本发明的有益效果在于：
人血浆凝血因子类制品活性对温度极为敏感，市场上同类产品均或多或少存在高温条件下fⅷ活性容易失活的问题。本发明的获得的人血浆凝血因子类制品活性高，稳定性好。
具体而言，
(1)本发明采用了精细的peg沉淀步骤和阴离子层析步骤，
(2)本发明的透析液配方既可有效的保护人凝血因子ⅷ活性、赋型良好的冻干后外观，又不含糖及白蛋白、保证100℃、30min干热灭活病毒的过程中人凝血因子ⅷ活性受到较小的损伤，
(3)精细设计的冻干退火过程，能够改变制品共熔点，改善冻干成品外观效果。
附图说明
图1、血源性人凝血因子ⅷ的制备方法路线图。
具体实施方式
一、基本要求
1、原料血浆及冷沉淀应符合2010版《中华人民共和国药典》(三部)《血液制品生产用人血浆》等相关规定；
2、生产仪器设备、设备等应符合清洁消毒等要求；
3、生产人员应经过相关培训合格后方可上岗。
二、本发明主要缓冲液配方
1、tris缓冲液：0.02mol/l、ph在6.5～7.5之间；
2、s/d母液：20％tween80和6％tnbp的混合溶液；
3、层析缓冲液：ph皆调为6.9～7.5；
4、eqbuffer：10mmol/l枸橼酸钠，0.10～0.12mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸、9～10g/l甘氨酸；
5、washingbuffer：10mmol/l枸橼酸钠、0.12～0.15mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸,9～10g/l甘氨酸；
6、elutionbuffer：10mmol/l枸橼酸钠、0.25～0.35mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙,0.016mol/l盐酸赖氨酸，9～10g/l甘氨酸；
7、透析缓冲液：透析缓冲液包含氯化钠10～200mmol/l、枸橼酸钠2～50mmol/l、甘氨酸50～600mmol/l、氯化钙1～30mmol/l、盐酸赖氨酸1～200mmol/l，ph在6.5～7.5之间。
三、工艺过程
1、复溶冷沉淀：将粉碎后的冷沉淀缓慢加入到tris缓冲液中，冷沉淀与tris缓冲液重量比为1:3；
2、冷沉淀溶解：20℃～35℃水浴搅拌0.5～1.5小时，直到冷沉淀完全溶解，过程检测温度变化，搅拌完成后复溶液ph应在7.0～8.0之间；
3、peg沉淀：将peg(3000～4000)溶液加入到冷沉淀tris缓冲液溶解液中，peg终浓度在3.0％～4.5％之间。之后用hac溶液调节混合液ph到6.2～6.7之间，并于20℃～35℃水浴搅拌0.5～1.0小时；
4、离心去除沉淀：大型低温高速离心机4000～6000rpm，离心10～15min，离心温度控制在20℃～30℃之间；
5、s/d病毒灭活：收集离心后上清液，用孔径不大于1μm的滤器进行澄清过滤，之后加入s/d母液，保证tween80、tnbp终浓度分别为1％和0.3％。病毒灭活条件24℃～26℃水浴、温和搅拌6小时。
6、层析样品制备：调节s/d病毒灭活后样品渗透压至370～400mosmol/kg、ph6.9～7.5之间；
7、离子交换层析：
a、层析柱平衡：用eq冲洗层析柱3～6个柱床体积(cv)；
b、上样：线速度80～120cm/h上样，完成后用eq继续冲洗2～7cv，上样及冲洗过程收集流穿峰样品检测分析；
c、洗涤：eq冲洗2～7cv后，用2～5cv的洗涤缓冲液冲洗杂质蛋白；
d、洗脱：用2～5cv的elutionbuffer洗脱目的蛋白，本工艺中洗脱峰样品可定义人凝血因子ⅷ原液。
e、再生及cip：用浓度1.0mol/l的nacl溶液冲洗2～3cv，之后用0.5mol/l的naoh溶液冲洗2～3cv
f、层析柱保存：0.05～0.1mol/l的naoh冲洗2～5cv后保存。
8、超滤透析：
a、超滤膜包：选择截留孔径为100kd；
b、超滤透析：用透析缓冲液透析5～8个制品体积，一般推荐为7体积，透过端液体ph和电导率与透析缓冲液基本一致。
9、过滤分装：用0.2μm除菌级滤器过滤样品，并将过滤后样品按要求量分装，过滤前后应进行膜完整测试。
10、冻干：
a、制品低温入柜；
b、预冻：-50℃～-35℃、保持1～10小时；
c、退火：升温至-30℃～-20℃、保持1～10小时，之后降温到-50℃～-35℃、保持5～10小时，退火能够改变制品共熔点，改善冻干成品外观效果；
d、一次升华：抽真空至20pa以下，温度-50℃～-35℃之间、保持30～50小时；
e、二次升华：保持真空度在20pa以下，升温至-30℃～-15℃之间、保持10～20小时；
f、保温：二次升华后将制品温度升至35℃以下，真空度维持在20pa以下，保持10～20小时；
g、压塞出柜、轧盖。
11、干热灭活：99.5℃～102℃水浴灭活30min。
12、包装：符合“生物制品包装规程”。
实施例1、血源性人凝血因子ⅷ的制备
1、取血浆冷沉淀粉碎；
2、血浆冷沉淀复溶：将粉碎后的血浆冷沉淀缓慢加入到ph6.5～ph7.5、温度20℃～35℃的0.02mol/ltris缓冲液中，血浆冷沉淀与tris缓冲液重量比为1:3；
3、冷沉淀溶解：20℃～35℃水浴搅拌0.5～1.5小时，直到血浆冷沉淀完全溶解，过程检测温度变化，搅拌完成后溶液ph为7.0～7.6之间，获得冷沉淀tris缓冲液溶解液；
4、peg沉淀：将peg溶液(分子量为3000～4000)加入到冷沉淀tris缓冲液溶解液中，peg终浓度为3.0％～4.5％；以hac溶液调节ph至6.2～6.7，并于20℃～35℃水浴搅拌0.5～1.0小时；
5、离心去除沉淀：以4000～6000rpm，离心10～15min，离心温度为20℃～30℃；
6、s/d病毒灭活：收集离心后上清液，用孔径不大于1μm的滤器进行澄清过滤，之后加入s/d母液使tween80、tnbp终浓度分别为1％和0.3％；以24℃～26℃水浴，温和搅拌6小时灭活病毒。
7、层析样品制备：调节渗透压至370～400mosm/kg、ph6.9～7.5之间；
8、离子交换层析：
a)层析树脂：日本东曹的
b)层析缓冲液：ph皆调为6.9～7.5：
平衡缓冲液(eqbuffer)10mmol/l枸橼酸钠，0.10～0.12mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸、9～10g/l甘氨酸；
洗涤缓冲液(washingbuffer)10mmol/l枸橼酸钠、0.12～0.15mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸,9～10g/l甘氨酸；
洗脱缓冲液(elutionbuffer)10mmol/l枸橼酸钠、0.25～0.35mol/l氯化钠、1mmol/l氯化钙、0.016mol/l盐酸赖氨酸，9～10g/l甘氨酸。
c)层析柱平衡：线速度80～120cm/h，用eqbuffer冲洗层析柱3～6个柱床体积(cv)；
d)上样：线速度80～120cm/h上样，完成后用eqbuffer继续冲洗2～7cv；上样及冲洗过程收集流穿峰样品检测分析；
e)washing：eq冲洗2～7cv后，线速度80～120cm/h用2～5cv的washingbuffer冲洗杂质蛋白；冲洗过程收集washing峰样品检测分析；
f)洗脱：线速度50～100cm/h，用2～5cv的elutionbuffer洗脱目的蛋白；本工艺中洗脱峰的洗脱样品即为人凝血因子ⅷ原液。
g)层析柱再生及cip：
h)层析柱保存：0.05～0.1mol/l的naoh冲洗2～5cv后保存。
9、超滤透析：
a)超滤膜包：选择截留孔径为100kd；
b)透析缓冲液：透析液包含氯化钠10～200mmol/l、枸橼酸钠2～50mmol/l、甘氨酸50～600mmol/l、氯化钙1～30mmol/l、盐酸赖氨酸1～200mmol/l，ph在6.5～7.5之间；本配方既可有效的保护人凝血因子ⅷ活性、赋型良好的冻干后外观，又不含糖及白蛋白、保证100℃、30min干热灭活病毒的过程中人凝血因子ⅷ活性受到较小的损伤。
c)超滤透析：用透析缓冲液透析7体积，透过端液体ph和电导率与透析缓冲液基本一致；
10、过滤分装：用0.2μm除菌级滤器过滤样品，并将过滤后样品按要求量分装。
11、冻干：
a)制品低温入柜
b)预冻：-50℃～-35℃、保持1～10小时；
c)退火：升温至-30℃～-20℃、保持1～10小时，之后降温到-50℃～-35℃、保持5～10小时，退火能够改变制品共熔点，改善冻干成品外观效果；
d)一次升华：抽真空至20pa以下，温度-50℃～-35℃之间、保持30～50小时；
e)二次升华：保持真空度在20pa以下，升温至-30℃～-15℃之间、保持10～20小时；
f)保温：二次升华后将制品温度升至35℃以下，真空度维持在20pa以下，保持10～20小时。
g)压塞出柜、轧盖；
12、干热灭活：99.5℃～102℃水浴灭活30min；
13、包装：符合“生物制品包装规程”。
实施例2、制品稳定性试验结果
按照本发明的方法，发明人于2012年生产的连续三批制品(批号：201208016、201209017和201209018)稳定性试验(长期稳定试验和6个月的加速稳定性试验)结果表明：本发明制备的人凝血因子ⅷ较好的解决了高温条件下容易失活的问题，保证了制品在长期储存、运输或短期常温存放过程中fⅷ活性不失活、产品质量不受影响。
注：本结果在其余指标均合格的情况下，仅列举活性检测结果,并对其进行统计分析。
a、长期稳定性试验结果
依据表1三批活性平均值进行线性回归公式y＝1.34-0.00511x(y为活性标识量、x为月份数)，故而从目前稳定性数据可预见本工艺生产的人凝血因子ⅷ在拟存放条件2～8℃下，理论有效期为105个月，远大于本制品暂定的两年有效期。
表1三批制品长期稳定性试验(2～8℃)活性结果
b、25±2℃、6个月加速稳定性试验结果
依据表2三批活性平均值进行线性回归公式y＝1.36-0.0145x，r2＝0.96，故而从目前稳定性数据可预见本工艺生产的人凝血因子ⅷ在存放条件25±2℃下，理论上可能的有效期为90个月。
表2三批制品加速稳定性试验(25±2℃)活性结果
c、37±2℃、6个月加速稳定性试验结果
依据表3三批活性平均值进行线性回归公式y＝1.35-0.0307x，r2＝0.99，求得x≤43个月。故而从目前稳定性数据可预见本工艺生产的人凝血因子ⅷ在存放条件37±2℃下，理论上可能的有效期为43个月。
表3三批制品加速稳定性试验(37±2℃)活性结果
加速稳定性试验结果仅仅作为初步判定制品有效期的辅助试验，而制品有效期最终确定还要依据长期稳定性试验的结果。但加速稳定性试验结果本发明生产的人凝血因子ⅷ较好的解决了高温条件下fⅷ活性容易失活的问题。
实施例3、各步骤人凝血因子ⅷ比活
对制备各步骤人凝血因子ⅷ比活进行检定，表4数据显示纯化制备过程人凝血因子ⅷ纯度(从冷沉淀到成品)提高了100倍以上，并且原液比活在20～60iu/mg之间、成品比活在40～60iu/mg之间，均大于现行2010版《中华人民共和国药典》三部《人凝血因子ⅷ》中对于原液及成品(无白蛋白类保护剂)均大于1iu/mg的要求。
表4各步骤人凝血因子ⅷ比活
3、与其他工艺相比
表5数据显示：本发明与传统肝素钠纯化法以及专利《一种从血浆中提取人凝血因子ⅷ的工艺》(专利号:cn103864920a)从产品比活和回收率两方面对比，结果显示本发明制备的人凝血因子ⅷ制品比活更高，且回收率也较后者更高。说明本发明能更加有效地制备高质量的fⅷ制品。
表5与其他工艺相比
4、成品杂质蛋白鉴定
如前所述，本发明制备的人凝血因子ⅷ制品比活较高，即杂质蛋白含量少。人凝血因子类产品常见的杂质蛋白，如：白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等。当这些杂质蛋白随制品长期大量输注入人体内时将不可避免地引起一些副反应，如：凝血功能紊乱等。对本发明所制备的成品主要杂质进行检测，结果见表6。检定方法：使用德国西门子公司血浆特定蛋白检测仪，型号bnprospec进行检测；样品：本发明所制备的人凝血因子ⅷ成品，存放于2～8℃冷库中。
表6结果显示在本产品中主要杂质蛋白含量极低，白蛋白4.525mg/l、主要球蛋白均未检出，而纤维蛋白原含量也0.146mg/ml以下。本发明所制备的人凝血因子ⅷ产品比活高，杂质蛋白含量极低，从而保证制品更加安全、有效。
表6人凝血因子ⅷ杂质蛋白鉴定
5、三批成品检测结果
对本发明2012年8～9月份连续制备的三批人凝血因子fⅷ制品(批号：201208016、201209017和201209018)参照2010年版《中华人民共和国药典》(三部)《人凝血因子fⅷ》(p236～237)的要求进行全面检定，结果见表7.
检定结果表明：本发明所制备人凝血因子fⅷ制品所有质量检测指标均达到了2010年版《中华人民共和国药典》(三部)《人凝血因子fⅷ》的要求。其中比活性(≧10.0iu/mg)这一关键质量指标，明显高于2010年版《中华人民共和国药典》(三部)中的要求(≧1.0iu/mg)。另外成品peg、磷酸三丁酯和聚山梨酯80残留量等指标也均远远低于药典所要求的最大含量，进一步保证了产品的安全性。说明本发明能够生产出符合国家标准的人凝血因子fⅷ，并且一些关键指标较国家标准有显著地提高，进一步证明本发明工艺稳定可行、可靠。
表7三批成品主要指标检测结果
最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用做的保护范围的限定。