表达凝血因子viii的表达载体及其应用的制作方法

专利名称：表达凝血因子viii的表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及B区缺失重组人凝血因子VIII (B Domain delete recombinant human coagulation factor VIII，BDD-rhFVIII)的植物表达载体及其在植物中表达生产BDD-rhFVIII的应用。具体地，涉及BDD-rhFVIII的植物表达载体及利用小球藻生产 BDD-rhFVIII 的方法。
背景技术：
血友病血友病(Hemophilia)是一组由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。包括血友病A(甲)、血友病B(乙)，因子XI缺乏症(曾称血友病丙)和vWF因子(vonwi Ilibrand factor)缺乏的血管性假血友病，他们构成血友病的四种类型。前两者为性染色体——X染色体连锁的隐性遗传病，仅男性发病；因子XI缺乏症为常染色体不完全隐性遗传。血友病在先天性出血性疾病中最为常见。血友病A是由于血液中缺乏功能性的凝血因子VIII，而造成的出血不止的出血性疾病。血友病A在男性人群中的患病率约为1/5000，占血友病总数的80%以上；血友病 B在男性人群中的患病率约为1/30000，占血友病总数的10% 20%。中国是世界上人口最多的国家之一，估计血友病患者65，000-130，000例，国内调查显示，绝大多数血友病患者未得到及时的诊断和治疗(Zhang et al.，2003)。血友病是遗传性、伴随终身的出血性疾病。身体各个部位都有可能发生出血，以关节最为常见，肌肉出血次之，内脏出血少见但病情较重。重型血友病儿童多于2岁左右发生关节出血，此后反复的关节出血导致慢性血友病性关节炎，进而因为关节畸形而导致残疾， 几乎是血友病患者的共同结局。因此在欧美国家实施了血友病综合关怀的治疗模式，尤其是对重型血友病儿童实行预防治疗，使重型血友病由威胁生命的、严重影响生存质量的疾病转变成终生携带但可以正常生活的疾病。加拿大2006年统计，2663个血友病患者(占全国血友病患者的98%)中，进行预防治疗的儿童占84% (Biss et al，2008)。但我国血友病工作起步晚，血友病儿童的状况不容乐观。目前，本病在发展中国家(如我国)的致残率和病死率远高于发达国家。FVIII的结构特点FVIII是血浆中大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FVIII是治疗血友病A 的唯一有效的制剂。FVIII基因定位在X染色体的长臂顶端(Gitschier et al.，1984)，长超过1801Λ。包含有沈个外显子，最初翻译产物为2351个氨基酸(Vehar et al. , 1984)的单链蛋白质，该蛋白质包含19个氨基酸的信号肽和2332个氨基酸的成熟蛋白质。FVIII是多结构域的大分子糖蛋白，一个成熟的蛋白质由大约分子量为^OkDa的轻链和重链组成。 轻链分子量约为801^^，结构包括々3，(1和C2，连接方式为A3-C1-C2。重链分子量约90至约 200kDa，结构包括域 Al，A2 和 B，连接方式为 Al-A2-B(Vehar et al. , 1984 ；Lenting et
3al.，1998)。重链中，B结构域上的氨基酸残基Asp，Ser和Thr被广泛的糖基化。重链和轻链的连接是金属离子依赖性的，依赖于在Al和A3区的氨基酸残基与金属离子的结合，Al和 A3区包含有相互作用位点。天然凝血因子VIII (FVIII)蛋白质前体共含有沈个可能的糖基化位点，其中在B 结构域上有19个；而本发明中的rhFVIII结构中，B结构域已被除去，只编码两个分子量分别约为90kD和SOkD的重链和轻链，含6-7个糖基化位点，仍具有天然人凝血因子VIII的功能。当FVIII在血液中循环时，它通常与载体蛋白——血管性因子结合。当被凝血酶和/或活化的FXa因子水解时，FVIII被激活，这过程也包括诱导血管性因子与FVIII的解离。FVIII —旦被激活，活化的FVIIIa反过来可以与其它因子一起激活凝血因子FX，产生活化的F)(a。血友病A的治疗方法通常包括输入血浆或全血，注射从血浆中浓缩的FVIII，注射从转基因哺乳动物或通过转基因动物细胞培养系统中分离得到的重组人凝血因子。从血浆或哺乳动物细胞培养系统生产第八因子可能是困难和成本过高。此外，血浆源性因子VIII 可能含有污染物，例如，A型肝炎，B和C病原体以及细小病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)的病原体等有害杂质。凝血因子VIII的生产目前，凝血因子VIII的来源主要有三种①直接从血液中提取纯化的凝血因子 VIII。②采用人或动物培养细胞表达体系生产的FVIII。③用转基因动物代替动物细胞来生产FVIII。但这三种来源的FVIII都有一些不足或缺陷。从血液中提取和纯化凝血因子VIII从血液中直接提取和纯化的凝血因子VIII制剂最大的问题是病毒感染和产生 FVIII抑制物。国外统计从1979—1984年约有一半血友病患者感染HIV病毒。在1978-1985 年间，使用凝血因子浓缩制剂的患者感染艾滋病毒的情况60-70%的患者感染了 HIV ；他们中有数千人死于艾滋病；感染了丙型肝炎之后感染HIV使肝衰竭的风险增加了 21倍。我国80年代使用进口 FVIII制剂的血友病患者已发现有HIV感染者。Wang等Q004)报道的肝炎与HIV患病率为49. 1%和3.5%。钟小红等(2010)调查结果表明，HIV、HCV、HBV感染率分别是3.4%U0. 1%,2.5%,总感染率为16. 0 %，由于89例患者未进行相关检测，真实感染率不得而知。尽管目前浓缩凝血因子的安全性日益提高，但是有相当部分的患者仍然使用冷沉淀及血浆进行治疗，因此，开展输血相关性病毒感染筛查，提高用血安全管理仍然值得重视。采用人或动物培养细胞表达体系生产的FVIII近年推出的基因重组凝血因子，采用人或动物培养细胞的表达体系来进行表达， 通过培养产生大量凝血蛋白，再将凝血因子VIII蛋白提取纯化和浓缩，即成为基因重组凝血新药。这些动物细胞系包括幼仓鼠肾细胞培养系，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株和猴 C0S-7细胞系。然而，使用哺乳动物细胞因子生产凝血因子VIII不能消除病原体传染给人类的可能性。因此，从动物细胞系生产的凝血因子VIII需要额外的质量保证测试和生物安全试验，以防止病原的传播。人或动物培养细胞表达体系所用的培养基主要有两类有血清培养基和无血清培养基(人工血清培养基)。有血清培养基可能携带病毒造成感染转移的危险，而人工血清培养基则成本高昂，限制了血友病预防性治疗的广泛应用，尤其是在发展中国家的推广。用转基因动物代替动物细胞来生产FVIII科学家也尝试着用转基因动物来代替动物细胞来生产FVIII。在所有的转基因的方法中，生产一种蛋白总是在一个特殊的组织中如乳汁，血液和尿液中。1997年I^aleyanda 等首次成功在转基因猪的乳汁中表达凝血因子(Paleyanda et al.，1997)。最近又有报道将重组凝血因子FVIII转入兔子中(Chrenek et al.，2007)，利用兔子的乳汁来生产凝血因子FVIII。但利用动物来生产凝血因子也存在问题，比如说存在动物的病原体和一些动物源的疾病会感染人类等问题(SouWiarev et al.，2002)。综上所述，血友病在我国的治疗存在很大的障碍无足够的凝血因子制剂(供需比约为1 10)；凝血因子制剂费用太高，存在着病原微生物污染的可能。因此，开发一种安全、高效、低成本的重组人凝血因子VIII生产系统迫在眉睫。利用小球藻生物反应器可生产凝血因子VIII目前重组药用蛋白制备主要通过动物和人类细胞及微生物作为生物反应器来生产的。常用的外源基因的表达体系如E.Coli，在表达过程中容易形成包涵体或不能进行正确的后加工而受到限制，为此常采用哺乳动物或人体培养细胞来解决这些问题，但这些体系由于所用的培养基组成、培养条件及纯化和病源微生物的污染等问题而使得成本相对较高，安全性也令人担忧。小球藻是一种真核单细胞藻类，具有原核表达系统所不具备的蛋白后加工过程， 且本身营养价值高，可直接食用，繁殖速度快，可自养培养也可异养培养，适宜于规模化生产，这些优点是其它表达系统所不具备的。作为低等植物，转基因真核单细胞绿藻的培养则不仅具有转基因植物的这些优点，而且繁殖速度快，分离、纯化表达产物相对简单，产业化的培养技术已经成熟，适宜于规模化生产。作为新一代的生物反应器，有巨大的研发潜力(Chen et al.，2001)。在小球藻中表达和生产人凝血因子VIII的研究还未见报道。

发明内容
本发明提供了 B区缺失重组人凝血因子VIII的植物表达载体，其通过将硝酸还原酶启动子 NRpro(SEQ ID NO 1), BDD-rhFVIII (SEQ IDNO 2)和终止子 Nos(SEQ ID NO 3) 首尾连接到植物表达载体中而获得。在本发明的一个方面，包括编码有凝血活性的BDD-rhFVIII基因，其序列为SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。在本发明的另一个方面，包括重组DNA序列，该序列包括一个启动子，该启动子在小球藻中是有功能的，还包括编码有凝血因子VIII活性的核苷酸序列，该核苷酸序列能够连接到启动子上。在本发明的一个优选实施方案中，所述载体质粒选自由pBinl9，pGreen, PCABIA1300, pBinl21, pbin221 和 pBADW 组成的组。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述载体质粒是如图1所示的pBI221质粒或如图2所示的pGreen0029。
在本发明的一个优选实施方案中，所述外源基因是BDD-rhFVIII基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :2所示的序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述小球藻藻种为椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。 在本发明的另一个方面，提供了上述表达载体在利用小球藻表达外源基因中的应用。特别地，其中所述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。本发明的另一个方面，提供了上述构建B区缺失重组人凝血因子VIII的植物表达载体的方法，其通过将硝酸还原酶启动子NRpro (SEQ ID NO 1), BDD-rhFVIII (SEQ ID NO: 2)和终止子Nos(SEQ ID NO 3)首尾连接到植物表达载体中的步骤，其中所述载体质粒适于在小球藻中表达外源基因。特别地，其中所述载体质粒、外源基因和小球藻藻种如上所定义。具体地，本发明涉及表达凝血因子VIII的植物表达载体，其包含首尾连接的序列为SEQ ID NO 1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO 3的终止子Nos。优选地，所述编码凝血因子VIII的基因为SEQ IDNO :2所示的序列。更优选地所述植物表达载体选自由pBinl9，pGreen, pCABIA1300, pBinl21, pbin221和pBADW 组成的组。最优选地，所述植物表达载体选自pGreen0029。本发明还涉及包含上述的植物表达载体的小球藻。优选地，所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)。本发明还涉及上述植物表达载体在小球藻中表达凝血因子VIII中的应用。优选地，所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。优选地，所述编码凝血因子VIII 的基因为SEQ IDNO 2所示的序列。本发明还涉及构建在小球藻中表达凝血因子VIII的表达载体的方法，其特征在于将首尾连接的序列为SEQ ID NO 1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO :3的终止子Nos克隆入植物表达载体中。优选地，所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。更优选地，所述编码凝血因子VIII的基因为SEQ ID NO 2 所示的序列。由本发明的内容可知，本发明的表达载体安全、高效的生产凝血因子VIII。


图1.PBI221质粒结构图。
图2.pGreen0029质粒结构图。
图3.pGreen0029-nos质粒结构图。
图4.pGreen0029-NRpro质粒的结构图。
图5.pGreen0029-FVIII-nos 质粒结构图。
图6.pGreen-NRpro-FVIII-nos 质粒结构图。
图7.电击方法转化椭圆小球藻得到的抗G418的藻落。
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图8. FVIII基因PCR检测结果。1泳道为阴性对照未转基因藻株；2泳道为阳性质 粒；3-16泳道为转基因藻株。图9.人凝血因子VIII相关抗原的免疫酶联检测(Human FVIII-Ag ELISAAssay)结果。图10.阳离子交换柱层析SP-S印harose chromatography的紫外吸收峰图。图11.阴离子交换柱层析DEAE-650M chromatography的紫外吸收峰图。图12.免疫亲和柱层析Immune-affinity chromatography的紫外吸收峰图。图13.纯化的小球藻表达的rhFVIII的MALDI-TOF-MS检测结果图谱。
具体实施例方式下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是， 下述实施例是举例说明的目的，其不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保护 范围由后附的权利要求所限定。各种限制性内切酶，DNA上样缓冲液(6XLoading Buffer)购自TaKaRa公司； 普通Taq酶，plus 2000Maker, DNA纯化回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司； T4DNA连接酶购自NEB公司；葡萄糖及其他无机试剂均购自北京经科宏达生物技术有限 公司；鲑鱼精DNA购自hvitrogen公司；Human FVIII-Ag ELISA Assay kit试剂盒购自 北京冬歌生物科技有限公司；Coamatic FVIII kit试剂盒购自北京友谊中联生物科技有 限公司；阳离子交换柱层析的填料Cation exchange SP-Sepharose chromatography，阴 离子交换柱层析的填料Anion exchange DEAE-650M chromatography及免疫亲和柱层析 Immune-affinity chromatography均购自北京拜耳迪生物技术有限公司。实施例1.椭圆小球藻表达载体的构建方法根据文献Wang等(wang et al.，2004)报道的椭圆小球藻高效的硝酸还原酶基 因的启动子NRpro序列设计引物，上游引物NRpro-f :5，TGAAGCTTGTACCAGTGGTGCTGAGGTAG A-3，(SEQ ID NO :4)下游引物 NRpro-r :5，ACTCTAGACTTGTCGTCCTACTGCCGCAACAC-3，(SEQ ID NO :5)，其中在上游引物中加入Hind III酶切位点(下划线标出部分)，下游引物中加 入》10 I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR方法从椭圆小球藻基因组中得到NRpro启动 子，测序结果显示为NRpro启动子序列(SEQ ID NO 1)。PCR反应条件为94°C预变性IBmin， 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环结束后，72°C延伸lOmin。将PCR产 物1244bp大小的片段，用Hindlll和Xho I内切酶双酶切，质粒pGreen 0029 (来自BBSRC) (图2)也经Hind III和Biol内切酶双酶切，然后将双酶切产物与同样是双酶切的载体 pGreen 0029在16°C循环水浴锅中连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 a，在含有50mg/ L卡那霉素的LB培养基上37°C倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Hindlll和 BamHI内切酶双酶切鉴定，能够得到约1240bp大小片段(即NRpro启动子)的质粒即命名 为 pGreenOO^-NRpro (图 4)。实施例2.利用pGreenOO^框架构建的表达载体。根据Nos终止子序列(SEQ ID NO :3)设计引物，上游引物5，-ATAAGAATGCGGCCGC TCGAATTTCCCCGATCGTTCAAAC-3，(SEQ ID NO :6)下游引物5，-CGAGCTCGCCCGATCTAGTAACATA GATGA-3' (SEQ ID NO :7)其中在上游引物中加入Not I酶切位点(下划线标出部分)，在下游引物中加入Me I酶切位点(下划线标出部分)，用PCR的方法从pBI221(来自Clontech 公司的载体，载体图见图1)中获得了 Nos终止子(即图1中的Nos-Ter)，PCR反应条件为 94°C预变性3min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环结束后，72°C延伸 lOmin。将PCR产物^m3p大小的片段，用Not I和&ic I内切酶双酶切，质粒pGreen0029 (图 3，来自BBSRC)也经Not I和Me I内切酶双酶切，然后将两双酶切产物16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37°C倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行Not I和Mc I内切酶双酶切鉴定，能够得到270bp左右大小片段(即Nos终止子)的质粒即命名为pGreen0029-nos (图3)。实施例3.合成BDD-rhFVIII基因利用基因合成的方法合成BDD-rhFVIII基因(SEQ ID NO 2)，并通过酶切位点 XhoI和Not I进行双酶切，回收约4. 3kb的酶切片段(SEQ IDNO :2)，然后与同样是经过 XhoI和Not I进行双酶切载体pGreen0029-nOS (图幻连接，16°C连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上37°C倒置培养过夜，对长出的抗性菌落提取质粒进行》ιοΙ和Not I内切酶双酶切鉴定，能够得到4. 3kb左右大小片段(即 rhFVIII 基因)的质粒即命名为 pGreenO(^9-FVIII-nos(图 5)。实施例4. BDD-rhFVI11 表达载体 pGreen-NRpro-FVIIl-nos 的构建.按照常规技术，将NRpro启动子(SEQ ID NO 1)从载体pGreen0029_NRpro (图 4)中通过HindIII和BioI双酶切，回收酶切产物中约1. 21Λ的片段，将rhFVIII基因 (SEQ ID NO 2)从载体 pGreen0029-FVIII-nos (图 5)中通过 XhoI 和 Not I 双酶切，回收酶切产物中约4. 3kb的片段，将载体pGreen0029-nos(图3，来自于BBSRC)通过HindIII 和NotI双酶切，调整好两个片段——启动子和基因的质量比为1 1后，两个片段同时与用Hind III和Not I双酶切的pGreen0029-nOS载体连接，转化得到抗性菌落，PCR检测、酶切验证和测序检测得到正确连接的质粒，即构建成BBD-rhFVIII的植物表达载体 pGreen0029-NRpro-FVIII-nos(图 6)。实施例5.椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)的电击转化椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea) SE液体培养基见表1。椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)固体培养基液体培养基+7 %琼脂pH 5. 5-8. O。椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)筛选培养基小球藻固体培养基中添加抗生素G418至终浓度为30mg/L。取IOOml对数生长期的椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea，藻种来自中国科学院水生生物研究所)，50Xg，离心IOmin离心收集藻细胞(Refrigerated Centrifuge CR 20B2，HIACHI)；用高渗液(山梨醇0. 2M，甘露醇0. 2M)冰上处理l_3h ；50 X g离心lOmin，去上清，沉淀用6ml电击缓冲液(山梨醇0. 2M，甘露醇0. 2M，KCL 0. 08M, CaCL2O. 005M, HEPES 0. 01M)悬浮，并用电击缓冲液调细胞密度到1 X IO6个/mL ；加入终浓度为10 μ g/mL的质粒 pGreen0029-NRpro-FVI I I-nos 和 25 μ g/mL 的鲑精 DNA，混勻，冰上放置 5-lOmin，然后每次吸取400 μ L混勻的小球藻细胞液进行电击。电击的参数如下脉冲电压为6-10. 5KV，脉冲持续时间分别为0. 001-0. 2s，脉冲次数为21(1，脉冲距离为2mm，循环周期为100。电击后将小球藻转入固体筛选培养基中进行筛选培养(图7)。
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实施例6.转基因椭圆小球藻的分子检测a.转基因椭圆小球藻总DNA的提取挑取平板上的单藻落细胞接种于15mg/L G418液体培养基中培养，(25°C，光照 25001ux，120rpm)。1周后(浓度达到约为1 X IO8个/mL)，1600Xg离心IOmin收集藻细胞，在液氮中将细胞磨碎，参照文献Chen et al. , (2001)的方法提取转基因椭圆小球藻总 DNA,提取的DNA存于_20°C备用。b.转基因小球藻的PCR检测以转基因椭圆小球藻基因组DNA为模板，进行rhFVIII基因检测。检测rhFVIII基因所用的 PCR 引物分别为正向引物 F8-1133 :5，AGGAGGACTGGGACTATGCT 3，(SEQ ID NO: 9)；反向引物F8-24805' TTGAACTGAGGGACACTGCC3，(SEQ ID NO 10)。PCR反应条件为94°C 预变性3min, 94°C变性30s, 57°C退火40s, 72°C延伸Imin 30s, 30个循环结束后，72°C延伸 IOmin0可以扩增出约1347bp的DNA片段，即rhFVIII基因片段。共对14个转基因藻藻株进行了检测，检测结果见图8。转化藻株即电泳图8中的 3-16，均能够扩增出外源rhFVIII基因，说明这些藻株为转基因藻株，选取这些藻株进行液体扩繁培养，用以进一步检测转基因藻株的rhFVIII的凝血活性。实施例7.转基因小球藻可溶性蛋白的提取用SE培养基(培养基成分见表1)培养转基因椭圆小球藻，离心收集对数生长期 (浓度约为IX IO8个/mL)的细胞，约3g湿重，然后按湿重PBS=I 1进行混合。超声破碎9s，间隔如，破碎次数90次(JY92-II超声细胞粉碎机，宁波)，1300rpm离心IOmin去沉淀，取上清，上清即为转基因小球藻的可溶性蛋白液。PBS的浓度为50mM的磷酸钠缓冲液，PH值为7.2。表1培养基组成
权利要求
1.表达凝血因子VIII的植物表达载体，其包含首尾连接的序列为SEQID N0:1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO 3的终止子Nos。
2.权利要求1的植物表达载体，其中所述编码凝血因子VIII的基因为SEQIDNO :2所示的序列。
3.权利要求1或2的植物表达载体，其选自由pBinl9，pGreen，pCABIA1300，pBinl21， pbin221和pBADW组成的组。
4.权利要求1或2的植物表达载体，其选自pGreen0029。
5.包含权利要求2-4任一项所述的植物表达载体的小球藻。
6.权利要求5的小球藻，其是椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)，普通小球藻 (Chlorella vulgaris)或者蛋白核7J^i求藻(Chlorella pyrenoidosa)。
7.权利要求2-4任一项的植物表达载体在小球藻中表达凝血因子VIII中的应用。
8.权利要求7的用于，其中所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)或者普通小球藻(Chlorella vulgaris)。
9.构建在小球藻中表达凝血因子VIII的表达载体的方法，其特征在于将首尾连接的序列为SEQ ID NO 1的硝酸还原酶启动子NRpro，编码凝血因子VIII的基因和序列为SEQ ID NO 3的终止子Nos克隆入植物表达载体中。
10.权利要求9的方法，其中所述小球藻是椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)或者蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
全文摘要
本发明利用硝酸还原酶启动子(Nitrate Reducase promoter，NRpro)为启动元件，构建B区缺失重组人凝血因子VIII(BDD-rhFVIII)的植物表达载体，并以小球藻作为受体，表达B区缺失重组人凝血因子VIII(BDD-rhFVIII)。在小球藻中表达的重组人凝血因子VIII具有很强的凝血作用。本发明的结果可应用于制备凝血因子VIII制剂。
文档编号C12N1/13GK102277379SQ20111023839
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者丁一巨, 孙勇如, 安洋, 宋丽英, 尹维波, 白丽莉, 胡赞民, 赵世民, 陈宇红 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所