专利名称：一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法
技术领域：
本发明涉及分子信标，即荧光原位杂交信号经流式细胞仪高灵敏识别，直接定量检测到病人分泌物标本中低含量的金黄色葡萄球菌，同时也适用于阳性血培养物中金黄色葡萄球菌的快速定量检测。
背景技术：
目前国内外金黄色葡萄球菌的检测多采用传统的培养法以及分子生物学技术[1]。 然而，培养法耗时长，需1-4天，不利于感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防与控制。尽管PCR方法能够快速、特异性检测金黄色葡萄球菌，但实验室扩增产物污染以及病人标本中可能存在有未知的酶抑制剂等问题难以克服，及时采用荧光原位杂交检测方法也不能直接用于分泌物标本中金黄色葡萄球菌的检测，因此，分子生物学的方法在临床试验室的应用受到一定程度的限制。分子信标(Molecular beacon,MB)由于其特异性强、灵敏度高并可在均相溶液中与靶核酸分子进行杂交等特点而在荧光原位杂交技术中得到应用M。文献检索披露PCR和FISH技术用于金黄色葡萄球菌的检测已有多篇报道[1_6]，这些技术方法的建立能够对病人分泌物标本以及阳性血培养物中的金黄色葡萄球菌进行快速检测。但是PCR方法容易造成扩增产物污染，这使得金黄色葡萄球菌在临床实验室的检测受到了一定程度的限制。目前，在已报道的多种用于检测金黄色葡萄球菌的FISH技术均是采用线形探针进行杂交检测，并且所检测的标本均来源于血培养瓶中的阳性培养物。这种情况存在2个缺点一是线形探针不能用于均相溶液中靶分子的检测，因此，在杂交检测时必须进行标本的固定或者对探针进行固定，杂交反应完成后必须进行严格的冲洗以去除未杂交的探针，否则荧光背景信号高；二是病人分泌物标本中的金黄色葡萄球菌的含量低， 不能对这样的标本进行直接检测，因此，FISH的应用受到了限制。本发明将分子信标可在均相溶液中对靶分子进行杂交检测的特点与流式细胞仪高分辨、高灵敏度识别荧光染色细胞的特点相结合快速对病人分泌物标本及阳性血培养物中金黄色葡萄球菌进行荧光原位杂交检测。分子信标荧光原位杂交反应体系的建立首先简化了 FISH的操作步骤，无需对标本或探针进行固定，也不用对未杂交的探针进行冲洗去除，杂交检测可一步完成，最大限度地降低了干扰因素对实验的影响；其次流式细胞分析仪可以高灵敏度定量识别荧光染色的细胞，不但能直接定量检测病人分泌物标本中低含量细菌，而且能够对阳性血培养物中完整的活细胞进行定量检测，克服了目前FISH不能用于分泌物标本中低含量细菌检测的局限。本发明针对金黄色葡萄球菌特异性的16SrRNA片断，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标荧光原位杂交反应体系，克服了培养法耗时长以及目前分子生物学技术检测的诸多问题，为金黄色葡萄球菌感染性疾病的早期诊断以及医院或社区获得性感染的预防、控制提供新的快速检测方法
发明内容
本发明的目的在于利用荧光原位杂交-流式细胞术法，建立一种快速、灵敏、特异检测病人分泌物标本以及阳性血培养物中低含量金黄色葡萄球菌的方法。本发明的目的是这样实现的一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法， 包括以下步骤1)针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为5，-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3，；荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm;同时设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸(P: 5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50°C，计算分子信标S/B值；3)用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定的反应体系，即去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20xl05cfU/y 1，分子信标的浓度为 10 ng/μ 1。本发明的技术要点或原理荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)技术是一种应用非放射性荧光物质标记的核酸探针根据杂交原理检测细胞或组织内特定DNA或RNA的方法，1996年Tyagi和Kramer[1]首次报道了一种可以实时监测PCR反应产物扩增过程的新型荧光标记探针，即分子信标，与众多用于荧光原位杂交技术的核酸探针不同的是分子信标具有独特的空间“发夹”结构，在未结合靶分子时，分子信标呈“发夹”结构，有一个环序列(loop)与一茎序列(stem)，其中环是与靶分子互补的核酸碱基序列，茎为两列与靶分子杂交无关的互补碱基序列，在探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，当探针处于完整的“发夹”结构时，荧光基团和淬灭基团由于茎序列的互补结合而彼此紧密相邻，从而产生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)效应，导致荧光信号被有效淬灭而不能释放出来，当探针与互补的靶分子结合时，分子信标的“发夹”结构被打开，荧光基团和淬灭基团彼此分离，荧光信号不能被淬灭而得以释放，本发明中流式细胞仪能够检测到杂交后的荧光信号，从而检测到金黄色葡萄球菌，彰显技术进步。
本发明对照附图作进一步的阐明附图为分子信标热变性曲线如图所示上曲线为分子信标与完全互补的寡核苷酸杂交曲线，对应荧光强度值即F open;中间曲线为分子信标随温度变化的曲线，对应荧光强度值即F closed;下曲线为缓冲液随温度变化的曲线，对应荧光强度值即F buffer.
具体实施方式
实施例(1)分子信标及寡核苷酸序列的设计与合成
针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16S rRNA序列，设计出能特异地检测金黄色葡萄球菌的分子信标(5’ -FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’ )及与其完全互补的寡核苷酸 (P :5，-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3，)。
(2)通过对分子信标做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为5(TC， 计算分子信标 S/B (Signal-to-background ratio，S/B)值S/B =(F open-F buffer)/(F closed—F buffer)；
用流式豳进行荧*原位杂交.病定纖_反应体系；用正交设W敦件擴
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(3)选择出能特异性地检测金黄色葡萄球菌的靶序列，在该段靶序列上用beacon designer〗· 1软件设计与其完全互补的分子信标探针(5，-FAM_cgctgaAGAAGCAAGCTTCTCGTC CGTtcagcg-DABCYL-3')，该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中5，端用FAM 标记，3，端用DABCTL标记，荧光基团要求激发波长495nm，检测波长520nm ；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸。 (4) 3种溶液在PCR反应管中配制后置于荧光定量PCR仪中，温度从80°C下降到
530°C，温度每降低1°C采集一次荧光；将3种溶液从80°C下降到30°C的荧光强度做散点图即为MB的热变性曲线；从热变性曲线图看出，温度在45-55°C内时，MB与完全互补的寡核苷酸杂交稳定，荧光强度较高；MB随温度降低，曲线较平缓，说明荧光强度较稳定；当温度在50°C时，MB与完全互补的寡核苷酸杂交的荧光强度最高，因此可确定最佳的杂交温度为 500C ；并计算出S/B值，由表1可见实验6中S/B值最高，说明该组为最佳反应体系。(5)按照表2配制杂交溶液，用流式细胞仪进行荧光原位杂交，比较实验结果(阳性标本的荧光值减去阴性对照的荧光值)，可确定最佳反应体系是第2组，即去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20X105cfu/y 1，分子信标的浓度为10 ng/ μ ；
(6)获取金黄色葡萄球菌的菌液将金黄色葡萄球菌ATCC25923接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的20 mM Tris-HCl, pH 7. 2缓冲液调至 20xl05cfu/y 1 浓度；
其1菌体制备吸取20xl05cfu/y 1的金黄色葡萄球菌^il，10000 rpm离心5 min，收集菌体；加入6ml固定液，固定液为4%多聚甲醛+96% 20 mM Tris-HCl，pH 7. 2 ；4 °C固定 Ih ；离心10000 rpm, 5 min，除去残留的多聚甲醛；用20 mM Tris-HCl，pH 7. 2缓冲液洗涤 1次，得菌体沉淀物；
其2酶处理向上述的菌体沉淀物中加入lmg/ml溶葡萄球菌酶100 μ 1，37°C，15 min ；收集菌体 10000 rpm, 5 min ；分别用 50%、80%、95% 乙醇脱水 3min ；用 20 μ 1 20 mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，平均加入2个管中备用；
其3配制杂交缓冲液在EP管中加入10 μ 1 100 ng/ μ 1的MB和10 μ 1100%的去离子甲酰胺后，用20 mM 1Tris-HCl补足至100 μ 1 ；对照缓冲液在EP管中加入10μ 1100%的去离子甲酰胺后，用20 mM Tris-HCl缓冲液补足至100μ 1，备用；
其4杂交经酶处理的产物一管作为阳性，加入100 μ 1杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入100 μ 1阴性对照缓冲液；2个管置于50 °C，避光杂交池，2个管分别收集菌体 10000 rpm, 5 min ;2个管分别加入不含探针的100 μ 1缓冲液，于48 °C洗涤15min ;2个管分别重悬于500μ 1缓冲液中，置于冰上，3h内取样，过滤后测定。(7)分子信标的浓度为1 OD的分子信标质量数为32. 68ug，在管中加入327 μ 20 mM Tris-HCl, pH 7. 2缓冲液溶解，则配成浓度为100 ng/μ 1的母液贮存。(8)上述的分子信标及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲酸、20 mM Tris-HCl、去离子甲酰胺和溶葡萄球菌酶Iysostaphin 7386均购自Sigma ；哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司。
权利要求
1.一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于1)针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为 5，-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT -DABCYL-3，，其中 5，端用 FAM 标记，3，端用 DABCYL 标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm ；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸 (P :5’ -ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为 50°C，计算分子信标S/B值；3)用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20xl05cfU/y 1，分子信标的浓度为10 ng/μ ；其中将金黄色葡萄球菌ATCC25923接种于哥伦比亚血琼脂平板培养，挑取对数生长期的菌落，用无菌的20 mM Tris-HCl，pH 7. 2缓冲液调至20X105Cfu/l·! 1浓度；其1菌体制备吸取20xl05cfu/y 1的金黄色葡萄球菌^il，10000 rpm离心5 min，收集菌体；加入6ml固定液，固定液为4%多聚甲醛+96% 20 mM Tris-HCl，pH 7. 2 ；4 °C固定 Ih ；离心10000 rpm, 5 min，除去残留的多聚甲醛；用20 mM Tris-HCl，pH 7. 2缓冲液洗涤 1次，得菌体沉淀物；其2酶处理向上述的菌体沉淀物中加入lmg/ml溶葡萄球菌酶100 μ 1，37°C，15 min ；收集菌体 10000 rpm, 5 min ；分别用 50%、80%、95% 乙醇脱水 3min ；用 20 μ 1 20 mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体，平均加入2个管中备用；其3配制杂交缓冲液在EP管中加入10 μ 1100 ng/μ 1的MB和10 μ 1100%的去离子甲酰胺后，用20 mM 1Tris-HCl补足至100 μ 1 ；对照缓冲液在EP管中加入10 μ 1100%的去离子甲酰胺后，用20 mM Tris-HCl缓冲液补足至100μ 1，备用；其4杂交经酶处理的产物一管作为阳性，加入100 μ 1杂交缓冲液；另一管作为阴性对照，加入100 μ 1阴性对照缓冲液；2个管置于50 °C，避光杂交池，2个管分别收集菌体 10000 rpm, 5 min ;2个管分别加入不含探针的100 μ 1缓冲液，于48 °C洗涤15min ;2个管分别重悬于500μ 1缓冲液中，置于冰上，3h内取样，过滤后测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于分子信标的浓度为1OD的分子信标质量数为32. 68ug，在管中加入327 μ 1 20 mM 1Tris-HCl，pH 7. 2缓冲液溶解，则配成浓度为 100 ng/μ 1的母液贮存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于分子信标S/B值的计算S/B=F open-F buffer/F closed-F buffer。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用的分子信标及寡核苷酸序列，由上海生工生物工程有限公司合成；多聚甲醛、20 mM Tris-HCl、去离子甲酰胺和溶葡萄球菌酶 Iysostaphin 7386均购自Sigma ；哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图绿科生物工程有限公司ο
全文摘要
本发明提供的一种用分子信标快速检测金黄色葡萄球菌的方法，1)针对金黄色葡萄球菌ATCC25923的16SrRNA的片断选择靶序列，人工设计分子信标探针MB，其碱基组成为5’-FAM-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-DABCYL-3’，其中5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm；并设计出与分子信标完全互补的寡核苷酸(P5’-ACGGACGAGAAGCTTGCTTCT-3’)；2)通过对分子信标特性确定荧光原位杂交的温度为50℃，计算分子信标S/B值；3)用流式细胞仪进行荧光原位杂交，确定去离子甲酰胺的浓度为10%，金黄色葡萄球菌的菌液浓度为20x105cfu/μl，分子信标的浓度为10ng/μl。
文档编号C12Q1/06GK102304571SQ20111023771
公开日2012年1月4日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者吴良, 唐金路, 张新, 苗书魁, 陈旭, 马集云, 鹿新红 申请人:新疆生产建设兵团医院