三重转录因子及其在哺乳动物蛋白表达系统的应用的制作方法

本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体涉及三重转录因子及其在哺乳动物蛋白表达系统的应用。
背景技术：
：蛋白表达是现代工业、医疗和基础研究领域的重要组成部分，而利用重组技术生产蛋白，特别是高纯度、高活性的蛋白，在生物医学研究和制药学领域当中起着举足轻重的作用。目前，常见的重组蛋白表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和哺乳动物表达系统。原核表达系统和酵母表达系统虽然具有高产量和易操作的特点，但是当用于哺乳动物蛋白的表达时，则存在着天然的缺陷：(1)这类微生物系统缺乏或难以完成蛋白翻译后的各种化学修饰例如糖基化、乙酰化等，而蛋白的翻译后修饰对蛋白在细胞以及体内的转运、蛋白稳定性和在有机体内的生物活性都有着非常重要的作用。因此，缺乏此类修饰会对重组蛋白的生物活性有着极大的影响。虽然昆虫表达系统具有一定的蛋白翻译后的修饰能力，但由于种属差异和基因组的不同，其蛋白翻译后修饰在复杂性和多样性上无法与哺乳动物相比，且该系统的蛋白产量亦不高；(2)很多人源蛋白在细菌或昆虫表达系统中无法正常折叠，从而形成包含体，因此，纯化出的蛋白需要进行复杂的复性过程以恢复活力。对于传统哺乳动物表达系统而言，其优点在于蛋白能够实现正确折叠，带有比较完善的蛋白翻译后修饰，具有完整的生物活性，但其缺点是蛋白产量通常较低，生产成本居高不下。这也是市场上来源于哺乳动物表达系统的重组蛋白的种类和数量均较其他系统为少的重要原因。对于医疗领域而言，目前获得食品和药物管理局(fda)批准的生物药大部分是重组蛋白，这类药品的生产更是需要保持人体本身的蛋白翻译后修饰，以减少或消除药物进入人体后可能诱发的免疫反应。哺乳动物细胞对于蛋白表达有着精细的调控机制，包括转录、翻译以及修饰调控。其中，上游的基因转录水平在很大程度上决定了下游的蛋白的产量。molecularcell(nanhaihe,minliu,joannehsu,yuhuaxue,seemaychou,almaburlingame,nevanj.krogan,tomalber,andqiangzhou.hiv-1tatandhostaff4recruittwotranscriptionelongationfactorsintoabifunctionalcomplexforcoordinatedactivationofhiv-1transcription.(j)molecularcell.2010.05.14(38)428-438)报道了一个多蛋白复合物，后命名为超级延伸复合物(supperelongationcomplex,sec)，其对转录调控的延伸阶段起着非常关键的作用，以艾滋病病毒hiv(humanimmunodeficiencyvirus)为研究模型，具体阐述了这个复合物中的两个蛋白ell(elongationfactorforrnapolymeraseii)2和aff(af4/fmr2familymember)4对艾滋病病毒hiv在基因转录上的作用机制，研究表明，该复合物中的这两个蛋白的组合可以极大的促进hiv的基因表达，利用报告基因的方法测试显示，这两个蛋白的组合可以成百倍的促进艾滋病启动子的基因表达，显示这个蛋白复合物，特别是其中的两个蛋白，对艾滋病病毒hiv有着极为重要的作用。crtc是camp(camp-responsiveelementbindingprotein,creb)反应元件结合蛋白的转录共激活因子(creb-regulatedtranscriptioncoactivator)，crtc家族有3个成员(crtc1-3)，包含crtc(crebregulatedtranscriptioncoactivator)1，crtc2和crtc3，其家族可以显著增强creb靶基因的转录。但是，目前还没有关于ell2、aff4和crtc2组合应用于哺乳动物蛋白表达系统以提高哺乳动物蛋白表达量的报道。技术实现要素：本发明所解决的现有技术问题是：现有的哺乳动物蛋白表达系统普遍有着表达量低，成本高的特点。为了解决上述问题，本发明先是提供一种转录因子组合物，含有ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子，优选地，ell转录因子选自ell2或ell1中的一种，aff转录因子选自aff4或aff1中的一种，crtc转录因子选自crtc2或crtc1或crtc3中的一种。本发明提供了一种dna分子，所述dna分子含有编码ell转录因子的碱基序列，编码aff转录因子的碱基序列和编码crtc转录因子的碱基序列。本发明提供了一种重组表达载体，其是将转录因子组合物或三重转录因子克隆到哺乳动物表达载体而得到。本发明还提供了重组表达载体的制备方法，其是将将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因分别与载体连接，得到含有三重转录因子的重组载体；然后将重组载体转化到受体细胞，筛选得到转录因子表达的载体；最后将表达载体进行dna测序，得到重组表达载体。本发明提供了一种哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其是通过利用增强基因转录的方式来提高蛋白含量。这不仅会大大降低哺乳动物重组蛋白的生产成本，增加收益，同时也会对生命科学研究和生物制药业的发展产生积极的促进作用。本发明哺乳动物蛋白表达系统的制备方法是将重组表达载体和目的基因表达载体共同转染到细胞株中表达，得到重组蛋白。本发明哺乳动物蛋白表达系统的制备方法还可以将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因整合到目的基因中，得到含有编码三重转录因子的基因的目的基因，然后将含有编码三重转录因子的基因的目的基因与载体连接，得到含有编码三重转录因子的基因的目的基因表达载体，最后转染到细胞株中得到哺乳动物蛋白表达系统。本发明还提供了一种哺乳动物蛋白表达系统的纯化方法，其是在收集的细胞株中加入裂解液，离心得上清液；然后将上清液与标签混合后，离心去除上清液，加入高盐洗涤液进行洗涤；接着对洗涤液进行离心，去除上清液，加入低盐洗涤液进行洗涤；最后用带有标记的肽进行洗脱，离心得到上清液，所述上清液即为哺乳动物蛋白表达系统。具体来说，本发明提出了如下技术方案。一种转录因子组合物，含有ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子，优选地，ell转录因子选自ell2或ell1中的一种，aff转录因子选自aff4或aff1中的一种，crtc转录因子选自crtc2或crtc1或crtc3中的一种。优选的，对于所述的转录因子组合物，其中，所述组合物所述组合物含有ell2、aff4和crtc2，所述ell2、aff4和crtc2的比例为1:1-3:1-4；更优选的，所述ell2、aff4和crtc2的比例为1:1:1。优选的，对于所述的转录因子组合物，其中，所述转录因子组合物选自于人源、鼠源、狗源或者猪源中的一种；优选的，所述转录因子组合物为人源的。一种三重转录因子，其包含上述的转录因子组合物。一种dna分子，所述dna分子含有编码ell转录因子的碱基序列、编码aff转录因子的碱基序列和编码crtc转录因子的碱基序列；优选，所述编码ell转录因子的碱基序列选自以下碱基序列中的一种：(a)碱基序列如seqidno.1所示；(b)与seqidno.1序列的同源性在90％以上的碱基序列，优选95％以上的碱基序列；更优选在99％以上的碱基序列；(c)编码seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；(d)在seqidno.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有调控基因转录活性的由(c)衍生的蛋白质。所述编码aff转录因子的碱基序列选自以下碱基序列中的一种：(a)碱基序列如seqidno.3所示；(b)与seqidno.3序列的同源性在90％以上的碱基序列，优选95％以上的碱基序列；更优选在99％以上的碱基序列；(c)编码seqidno.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；(d)在seqidno.4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有调控基因转录活性的由(c)衍生的蛋白质。所述编码crtc转录因子的碱基序列选自以下碱基序列中的一种：(a)碱基序列如seqidno.5所示；(b)与seqidno.5序列的同源性在90％以上的碱基序列，优选95％以上的碱基序列；更优选在99％以上的碱基序列；(c)编码seqidno.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；(d)在seqidno.6所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有调控基因转录活性的由(c)衍生的蛋白质。一种重组表达载体，其是将所述转录因子组合物或者所述三重转录因子克隆到哺乳动物表达载体中而得到。一种重组表达载体的制备方法，其包含下述步骤：(1)将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因分别与载体连接，得到含有三重转录因子的重组载体；(2)将步骤(1)所得到的重组载体转化到受体细胞，筛选得到转录因子表达的载体；(3)将步骤(2)所得到的转录因子表达的载体进行dna测序，得到重组表达载体。所述转录因子组合物或三重转录因子在哺乳动物蛋白表达系统中的应用。一种哺乳动物蛋白表达系统，其是将重组表达载体或重组表达载体与目的基因表达载体共同转染到细胞株中表达得到，所述重组表达载体的总量与目的基因表达载体的总量的比为1：1-5。优选的，对于所述的哺乳动物蛋白表达系统，其中，所述细胞株选自于人胚胎肾细胞293或者中国仓鼠卵巢细胞中的一种。一种哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其包含下述步骤：(1)将重组表达载体和目的基因表达载体总量比为1：1-5共同转染到细胞株中；(2)1-3天后收集细胞，得到哺乳动物蛋白表达系统。优选的，对于所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述目的基因载体的制备方法包含下述步骤：将目的基因及表达载体连接得到目的基因表达载体。一种哺乳动物蛋白表达系统，其是将三重转录因子的目的基因表达载体转染到细胞株中得到。优选的，对于所述的哺乳动物蛋白表达系统，其中，所述细胞株选自于人胚胎肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞中的一种。一种哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其包含下述步骤：(1)将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因整合到目的基因中得到含有编码三重转录因子的基因的目的基因；(2)将含有编码三重转录因子的基因的目的基因与载体连接，得到含有编码三重转录因子基因的目的基因表达载体；(3)将步骤(2)所得到的表达载体转染到细胞株中，1-3天后收集细胞，得到哺乳动物蛋白表达系统。一种哺乳动物蛋白表达系统的纯化方法，其包含下述步骤：(1)收集哺乳动物蛋白表达系统细胞，加入裂解液，离心得到上清液；(2)将步骤(1)所述的上清液与标签beads混合，离心去除上清液，然后加入高盐洗涤液洗涤；(3)将步骤(2)所得的洗涤液离心，去除上清液，加入低盐洗涤液洗涤；(4)用带有标记peptide进行洗脱，然后离心得到上清液，所述上清液即为哺乳动物蛋白表达系统。优选的，对于所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述裂解液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘油、nacl、edta、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂混合物，所述裂解液的加入量为每1×107个细胞加入1-5ml的裂解液。优选的，对于所述的纯化方法，其中，在步骤(2)中，所述上清液与标签beads的体积比为20-50:1。优选的，对于所述的纯化方法，其中，在步骤(2)中，所述高盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘油、nacl、edta、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂混合物，所述高盐洗涤液的加入量为1-5ml。优选的，对于所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，所述低盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘油、nacl、edta、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制剂混合物，所述低盐洗涤液的加入量为1-5ml。优选的，对于所述的纯化方法，其中，所述标签peptide与标签beads的体积比为3-5：1。哺乳动物蛋白表达系统，其在生物医药中的应用。本发明所取得的有益效果为：本发明所得到的哺乳动物表达系统与传统方法相比，具有低成本、高产量的优势，能够有效提高重组蛋白的产量，并保持其完整的翻译后修饰来提高生物活性。此哺乳动物表达系统通过引入优化的超级转录延伸复合物中的转录因子，在转录水平上极大的提高基因的表达，从根本上达到增加蛋白产量的目的。同时，本发明所得到的哺乳动物表达系统具有操作简单，易大规模生成和快速产业化的潜能。附图说明图1是实施例1所得到的lif蛋白表达系统的表达量的示意图；图2是实施例1所得到的lif蛋白表达系统纯度的示意图；图3是实施例1所得到的lif蛋白表达系统与利用细菌表达系统同类产品生物活性比较示意图，其中，图3-1是没有lif的蛋白表达系统的生物活性示意图，图3-2是利用细菌表达系统的同类产品的生物活性示意图，图3-3至3-6是实施例1中的蛋白表达系统在2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/l和20ng/ml的生物活性示意图。具体实施方式图1是实施例1中所得到的lif蛋白表达系统的表达量的示意图，其中，1是只有lif表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞时所得到的lif蛋白表达系统的表达量的图，2是lif表达载体和含有转录因子ell2和aff4的表达载体共同转染到中国仓鼠卵巢细胞中所得到的lif蛋白表达系统表达量的示意图，3是lif表达载体和含有三重转录因子ell2、aff4和crtc2的表达载体共同转染到中国仓鼠卵巢细胞中所得到的lif蛋白表达系统表达量的示意图，从上图可以看出，三重转录因子ell2、aff4和crtc2可以把lif的表达量提高7倍。图2是实施例1所得到的lif蛋白表达系统纯度的示意图，从图中可以看出，纯化后的lif蛋白表达系统具有极高的纯度，纯度高于95％。图3是实施例1所得到的lif蛋白表达系统与利用细菌表达系统同类产品(货号phc9484,thermofisherscientific)生物活性比较示意图，其中，图3-1是没有lif的蛋白表达系统的生物活性示意图，图3-2是利用细菌表达系统的同类产品(10ng/ml)的生物活性示意图，图3-3至3-6是实施例1中的蛋白表达系统在2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/l和20ng/ml的生物活性示意图，从图中可以看出，使用本发明的蛋白表达系统，干细胞较多，说明本发明所得到的lif蛋白表达系统生物活性较高，生物活性超出利用细菌表达系统同类产品的300％以上。如上所述，本发明提供了一种转录因子组合物，含有ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子，优选地，ell转录因子选自ell2或ell1中的一种，aff转录因子选自aff4或aff1中的一种，crtc转录因子选自crtc2或crtc1或crtc3中的一种。其中，所述组合物有ell2、aff4和crtc2。优选的，所述ell2、aff4和crtc2的比例为1:1-3:1-4，更优选的，所述ell2、aff4和crtc2的比例为1:1:1。其中，所述转录因子组合物选自于人源、鼠源、狗源或者猪源中的一种，优选的，所述转录因子组合物为人源的。本发明还提供了一种三重转录因子表达载体，其是将三重转录因子克隆到哺乳动物表达载体中而得到。本发明提供了一种dna分子，所述dna分子含有编码ell转录因子的碱基序列，编码aff转录因子的碱基序列和编码crtc转录因子的碱基序列，其中，所述编码ell转录因子的选自以下碱基序列中的一种：(a)碱基序列如seqidno.1所示；(b)与seqidno.1序列的同源性在90％以上的碱基序列，优选95％以上的碱基序列；更优选在99％以上的碱基序列；(c)编码seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；(d)在seqidno.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有调控基因转录活性的由(c)衍生的蛋白质。所述编码aff转录因子的碱基序列选自以下碱基序列中的一种：(a)碱基序列如seqidno.3所示；(b)与seqidno.3序列的同源性在90％以上的碱基序列，优选95％以上的碱基序列；更优选在99％以上的碱基序列；(c)编码seqidno.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；(d)在seqidno.4所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有调控基因转录活性的由(c)衍生的蛋白质。所述编码crtc转录因子的碱基序列选自以下碱基序列中的一种：(a)碱基序列如seqidno.5所示；(b)与seqidno.5序列的同源性在90％以上的碱基序列，优选95％以上的碱基序列；更优选在99％以上的碱基序列；(c)编码seqidno.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；(d)在seqidno.6所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有调控基因转录活性的由(c)衍生的蛋白质。本发明提供了一种重组表达载体，其是将转录因子组合物或三重转录因子克隆到含有cmv启动子的哺乳动物表达载体中而得到。本发明提供了一种重组表达载体的制备方法，其包含下述步骤：(1)将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因分别与载体连接，得到含有三重转录因子的重组载体；(2)将步骤(1)所得到的重组载体转化到受体细胞，筛选得到转录因子表达的载体；(3)将步骤(2)所得到的转录因子表达的载体进行dna测序，得到重组表达载体。在本发明优选的具体实施方式中，本发明提供了一种重组表达载体的制备方法，其包含下述步骤：(1)将编码ell转录因子、aff转录因子、crtc转录因子的基因和表达载体分别进行限制性内切酶酶切，之后再进行分离纯化。酶切后的ell转录因子、aff转录因子、crtc转录因子的基因和分别与酶切后的载体通过t4连接酶连接，得到含有三重转录因子的重组载体；(2)将步骤(1)所得到的重组载体与大肠杆菌感受态细菌混合，冰上孵育30分钟，然后通过热激法(在42度水浴锅中90秒中)的方式，把重组载体转化进入到细菌中去。之后，把转化后的细菌铺到含有氨苄的lb培养板上，在37度的培养箱中培养过夜。(3)对(2)中培养板上的细菌进行鉴定，筛选出含有转录因子表达载体的细菌克隆。具体步骤如下：挑选10个细菌克隆分别放入5毫升的含有氨苄的液体lb培养液中，于37度摇床上过夜。第二天，用invitrogen的小抽质粒试剂盒提取质粒，然后进行酶切(与(1)中的限制性内切酶酶切一致)。如果能够得两条片段(大片段的为载体，小片段为插入的转录因子基因)，则为阳性克隆。(4)将步骤(3)所得到的阳性克隆重组质粒送到测序公司进行dna测序，确认序列无突变。本发明提供了一种哺乳动物蛋白表达系统，其是通过将重组表达载体与目的基因表达载体共同转染到细胞株中表达得到，所述三重转录因子表达载体的总量与目的基因表达载体的总量的比为1：1-5。其中，所述细胞株为选自于人胚胎肾细胞293或者中国仓鼠卵巢细胞的一种。本发明提供了一种哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其包含下述步骤：(1)将三重转录因子表达载体和目的基因的表达载体总量比为1：1-5共同转染到细胞株中；(2)1-3天后收集细胞，得到所需的哺乳动物蛋白。本发明还提供了另一种哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其包含下述步骤：(1)将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因整合到目的基因中得到含有编码三重转录因子的基因的目的基因；(2)将含有编码三重转录因子的基因的目的基因与载体连接，得到含有编码三重转录因子基因的目的基因表达载体；(3)将步骤(2)所得到的表达载体转染到细胞株中，1-3天后收集细胞，得到哺乳动物蛋白表达系统。在本发明另一种具体的实施方式中，本发明提供了一种哺乳动物蛋白表达系统的制备方法，其包含下述步骤：(1)将编码ell转录因子、aff转录因子和crtc转录因子的基因的表达载体整合到细胞株的基因组，构建稳定细胞株，具体步骤包括(a)用转染试剂将三重转录因子表达载体转染到表达细胞株中；(b)第二天将细胞稀释，以1000个细胞/150毫米的细胞培养板的浓度培养2周；(c)随机挑选50个细胞克隆，用westernblot的方法检测ell转录因子、aff转录因子和crtc这三个蛋白的表达，挑选高表达的细胞株，此则为稳定细胞株。(2)将目的基因与载体连接，得到含有编码目的基因表达载体；(3)将步骤(2)所得到的表达载体转染到(1)中所得的稳定细胞株中，1-3天后收集细胞，得到所需哺乳动物蛋白。本发明提供了一种哺乳动物蛋白表达系统的纯化方法，其包含下述步骤：(1)收集哺乳动物蛋白表达系统细胞，加入裂解液，离心得到上清液；(2)将步骤(1)所述的上清液与标签混合，离心去除上清液，然后加入高盐洗涤液洗涤；(3)将步骤(2)所得的洗涤液离心，去除上清液，加入低盐洗涤液洗涤；(4)用带有标记的肽进行洗脱，然后离心得到上清液，所述上清液即为哺乳动物蛋白表达系统。其中，所述裂解液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(摩尔浓度优选为20mm，ph优选为7.9)、甘油(质量浓度优选为10％)、nacl(摩尔浓度优选为0.3m)、edta(摩尔浓度优选为0.2mm，ph优选为8.0)、乙基苯基聚乙二醇(质量浓度优选为0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)，所述裂解液的加入量为每1×107个细胞加入1-5ml的裂解液。其中，所述高盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(摩尔浓度优选为20mm，ph优选为7.9)、甘油(质量浓度优选为10％)、nacl(摩尔浓度优选为0.8m)、edta(摩尔浓度优选为0.2mm，ph优选为8.0)、乙基苯基聚乙二醇(质量浓度优选为0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)，所述高盐洗涤液的加入量为1-5ml。其中，所述低盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(摩尔浓度优选为20mm，ph优选为7.9)、甘油(质量浓度优选为10％)、nacl(摩尔浓度优选为0.15m)、edta(摩尔浓度优选为0.2mm，ph优选为8.0)、乙基苯基聚乙二醇(质量浓度优选为0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)，所述低盐洗涤液的加入量为1-5ml。在本发明一种优选的具体实施方式中，所述裂解液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,20mm，ph7.9)、甘油(10％)、nacl(0.3m)、edta(0.2mm，ph8.0)、乙基苯基聚乙二醇(np-40，0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)；所述高盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,20mm，ph7.9)、甘油(10％)、nacl(0.8m)、edta(0.2mm，ph8.0)、乙基苯基聚乙二醇(np-40，0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)；所述低盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,20mm，ph7.9)、甘油(10％)、nacl(0.15m)、edta(0.2mm，ph8.0)、乙基苯基聚乙二醇(np-40，0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)。在本发明优选的实施方式中，使用哺乳蛋白表达系统对重组人白血病抑制因子(lif)进行表达和纯化。下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例中所用到的原料的信息和设备分别如表1和表2所示。表1所用到的原料的信息原料纯度厂家hepes1mthermofisher公司edta>98％sigma公司np-40/sigma公司nacl>99％sigma公司proteaseinhibitorcocktail>98％罗氏公司(roche)flagbeads>98％sigma公司flagpeptide>98％sigma公司人胚胎肾细胞/atcc公司中国仓鼠卵巢细胞/atcc公司人白血病抑制因子/thermofisher公司bamhi/thermofisher公司noti/thermofisher公司hindiii/thermofisher公司t4连接酶/罗氏公司(roche)银染试剂盒/thermofisher公司表2所用到的实验设备名称型号生产厂家离心机5417ceppendorf公司细胞培养箱3131thermofisher公司细菌培养箱imc18thermofisher公司pcr仪4484073thermofisher公司不锈钢水浴锅89032-189vwr公司漩涡式震荡器444-0203vwr公司轨道式摇床standard1000vwr公司滚筒式混合器444-0501vwr公司凝胶成像系统geldocxr+bio-rad公司电源164-5050bio-rad公司电泳槽164-0300bio-rad公司实施例一(一)重组表达载体的制备及蛋白表达量的比较(1)将编码ell2转录因子、aff4转录因子和crtc2转录因子的基因分别进行聚合酶链式反应(94℃,30秒/56℃，30秒/68℃，2分钟，循环30次)，电泳分离纯化分别得到编码ell2转录因子、aff4转录因子和crtc2转录因子的基因；将所得到的编码ell2转录因子和aff4转录因子分别用bamhi和noti两个酶进行酶切，将crtc2转录因子的基因用hindiii和noti两个酶进行酶切，然后分别与载体用t4连接酶进行连接，得到含有编码ell2转录因子、aff4转录因子和crtc2转录因子的基因的重组载体，所述转录因子的蛋白质摩尔比例为1:1:1；其中ell2的碱基序列如seqidno.1所示；aff4的碱基序列如seqidno.3所示；crtc2的碱基序列如seqidno.5所示；(2)将步骤(1)所得到的重组载体转化到受体细胞，筛选得到转录因子表达的载体；(3)将步骤(2)所得到的转录因子表达的载体进行dna测序，得到重组表达载体。(二)人白血病抑制因子(lif)表达载体的制备将lif和含有巨细胞病毒启动子的表达载体分别用hindiii和bamhi进行酶切，得到露出粘性末端的lif和巨细胞病毒载体，然后用t4连接酶将lif与表达载体连接，得到人白血病抑制因子(lif)表达载体。(三)表达量的比较将人白血病抑制因子(lif)表达载体与不同的转录因子表达载体组合表达载体共同转染到中国仓鼠卵巢细胞中，两天后收集细胞，对表达量进行比较，结果见图1。第一道是lif在一般的表达系统中的量，第二道是lif在含有ell2/aff4的表达系统中的量，第三道是lif在含有ell2/aff4/crtc2的表达系统中的量。我们清楚的看到，lif在含有ell2/aff4/crtc2三重转录因子的情况下，表达量最高。实施例二(一)人白血病抑制因子的蛋白的制备(1)将上述所得到的重组表达载体与lif表达载体共同转染到中国仓鼠卵巢细胞中，所述重组表达载体的总量与lif表达载体的总量的比例为1:2；(2)两天后收集细胞，得到人白血病抑制因子(lif)的蛋白。(二)人白血病抑制因子(lif)蛋白的纯化(1)收集上述所得到的lif蛋白表达系统，加入裂解液，所述裂解液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,20mm，ph7.9)、甘油(10％)、nacl(0.3m)、edta(0.2mm，ph8.0)、乙基苯基聚乙二醇(np-40，0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)，所述裂解液的加入量是1×107个细胞中加入1ml裂解液，在冰上放置15分钟，在转速为15000rpm下离心10min，得到上清液；(2)将步骤(1)所得到的上清液与flagbeads混合，在4°孵育90min,所述上清液与flagbeads的体积比为20:1；然后在转速为5000rpm下离心30s，去除上清液，最后加入高盐洗涤液洗涤，所述高盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,20mm，ph7.9)、甘油(10％)、nacl(0.8m)、edta(0.2mm，ph8.0)、乙基苯基聚乙二醇(np-40，0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)，然后在转速为5000rpm下离心30s，去除上清液，重复2次，所加入的高盐洗涤液的体积为1ml；(3)采用与步骤(2)相同的方法，用低盐洗涤液进行洗涤，重复3次，所述低盐洗涤液包含4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes,20mm，ph7.9)、甘油(10％)、nacl(0.15m)、edta(0.2mm，ph8.0)、乙基苯基聚乙二醇(np-40，0.5％)和蛋白酶抑制剂混合物(proteaseinhibitorcocktail)，所使用的低盐洗涤液的体积为1ml；(4)用终浓度为0.5mg/ml的flagpeptide(溶在低盐洗涤液)在室温下洗脱25min，所述的洗脱体积与flagbeads的体积比为4:1，然后进行离心，得到上清液，所述上清液即为纯化的人白血病抑制因子(lif)的蛋白表达系统。将实施例一中纯化好的蛋白表达系统进行蛋白电泳，然后用thermofisher公司的银染试剂盒进行染色，测定结果见图2，对蛋白浓度进行估算，其纯度大于95％。实施例三生物活性的验证采用小鼠胚胎干细胞进行生物活性验证的实验，实验结果见图3。由于人和鼠lif具有很高的同源性，人源的lif被验证对于鼠源的胚胎干细胞也起作用，及抑制鼠源胚胎干细胞的分化，让其保持不断分裂增殖的能力。我们用含ell2/aff4/crtc2三重转录因子的表达系统所产生的lif能够较thermofisher公司的lif在相同浓度下有着更高的活性，体现为产生了更多胚胎干细胞(因为更多的胚胎干细胞能够分裂增殖)，从图3中可以看出，使用本发明的蛋白表达系统的胚胎干细胞较多，说明本发明的蛋白表达系统能够促进干细胞生长且抑制干细胞分化的生物活性。综上所述，本发明所制备得到的蛋白表达系统与利用细菌表达系统所产生的同类产品进行对比的实验中，表现出高活性，能够在极低浓度下促进胚胎干细胞生长的活性。并且与加入ell2和aff4的蛋白表达系统相比较，本发明所制备的蛋白表达系统的表达量提高7倍，说明这种组合(ell2/aff4/crtc2)能极大地增强cmv启动子，从而提高目的基因的表达。以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>杭州阿诺生物医药科技股份有限公司<120>三重转录因子及其在哺乳动物蛋白表达系统的应用<130>pct170001<160>6<170>dnamanversion5.1<210>1<211>1921<212>dna<213>人工序列<400>11atggcggcgggggggacagggggcctgcgggaggagcagcgctatgggctgtcgtgcgga61cggctggggcaggacaacatcaccgtactgcatgtgaagctcaccgagacggcgatccgg121gcgctcgagacttaccagagccacaagaatttaattccttttcgaccttcaatccagttc181caaggactccacgggcttgtcaaaattcccaaaaatgatcccctcaatgaagttcataac241tttaacttttatttgtcaaatgtgggcaaagacaaccctcagggcagctttgactgcatc301cagcaaacattctccagctctggagcctcccagctcaattgcctgggatttatacaagat361aaaattacagtgtgtgcaacaaacgactcgtatcagatgacacgagaaagaatgacccag421gcagaggaggaatcccgcaaccgaagcacaaaagttatcaaacccggtggaccatatgta481gggaaaagagtgcaaattcggaaagcacctcaagctgtttcagatacagttcctgagagg541aaaaggtcaacccccatgaaccctgcaaatacaattcgaaagacacatagcagcagcacc601atctctcagaggccatacagggacagggtgattcacttactggccctgaaggcctacaag661aaaccggagctacttgctagactccagaaagatggtgtcaatcaaaaagacaagaactcc721ctgggagcaattctgcaacaggtagccaatctgaattctaaggacctctcatatacctta781aaggattatgtttttaaagagcttcaaagagactggcctggatacagtgaaatagacaga841cggtcattggagtcagtgctctctagaaaactaaatccgtctcagaatgctgcaggcacc901agccgttcagaatctcctgtatgttctagtagagacgctgtatcttctcctcagaaacgg961cttttggattcagagtttattgatcctttaatgaataaaaaagcccgaatatctcacctg1021acgaacagagtaccaccaacactaaatggtcatttgaatcccaccagtgaaaaatctgct1081gcaggcctcccgctgccccctgcggctgctgccatccctacccctccaccgctgccttca1141acctatctgcccatctcacatcctcctcagattgtaaattctaactccaactcccctagc1201actccagaaggccgggggactcaagacctacctgttgacagttttagtcaaaacgatagt1261atctatgaggaccagcaagacaaatatacctctaggacttctctggaaaccttaccccct1321ggttccgttctactaaagtgtccaaagcctatggaagaaaaccattcaatgtctcacaaa1381aagtccaaaaagaagtctaaaaaacataaggaaaaggaccaaataaaaaagcacgacatt1441gagactattgaggaaaaggaggaagatcttaagagagaagaggaaattgccaagctaaat1501aactccagtccaaattccagtggaggagttaaagaggattgcactgcctccatggaacct1561tcagcaattgaactcccagattatttgataaaatatatcgctatcgtctcctatgagcaa1621cgccagaattataaggatgacttcaatgcagagtatgatgagtacagagctttgcatgcc1681aggatggagactgtagctagaagatttatcaaactagatgcacaaagaaagcgcctttct1741ccaggctcaaaagagtatcagaatgttcatgaagaagtcttacaagaatatcagaagata1801aagcagtctagtcccaattaccatgaagaaaaatacagatgtgaatatcttcataacaag1861ctggctcacatcaaaaggctaataggtgaatttgaccaacagcaagcagagtcatggtcc1921tag<210>2<211>601<212>dna<213>人工序列<400>21maaggtgglreeqryglscgrlgqdnitvlhvkltetairaletyqshknlipfrpsiqf61qglhglvkipkndplnevhnfnfylsnvgkdnpqgsfdciqqtfsssgasqlnclgfiqd121kitvcatndsyqmtre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