一种山羊关节炎‑脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白p28及其制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白p28及其制备方法。

背景技术：

山羊关节炎-脑炎（caprinearthritis-encephalitis，cae）是由山羊关节炎-脑炎病毒(caprinearthritis-encephalitisvirus，caev)引起的山羊的一种慢性病毒性传染病。该病的主要特征是成年山羊呈缓慢发展的关节炎，间或伴有间质性肺炎和间质性乳房炎；2-6月龄羔羊表现为上行性麻痹的神经症状。本病感染率高，潜伏期长，感染山羊终生带毒，且没有特异的治疗方法，对畜群的生产性能特别是奶产量有重要影响，同时也妨碍了种用动物的正常贸易，被我国列为二类动物疫病，在国际贸易中，相关动物及产品入境时必须检疫。

山羊关节炎-脑炎病毒自1982年被crowford等人发现以来，已经遍布世界许多国家，其中，美国、挪威、英国、日本、墨西哥、巴西等国家尤为严重，血清学调查显示其阳性率超过了30%。我国在1987年从英国进口的萨能奶山羊中分离了山羊关节炎一脑炎病毒并命名为caev89-gb1026。目前，主要分布于甘肃、陕西、贵州、山东、黑龙江、辽宁、四川等地区。已经分离鉴定出5个不同的山羊关节炎-脑炎病毒株，分别为甘肃、陕西、四川、贵州和山东毒株，这些毒株的gag-pol基因序列相似在99.2%～99.9%之间，基因型为b1型，与瑞士、斯诺文尼亚等欧洲国家流行株基因型相同。

山羊关节炎-脑炎呈地方流行性，发病山羊和隐性带毒者为传染源。可以感染任何年龄、性别的山羊。caev感染对宿主具有特异性，山羊是本病的主要易感动物，其中奶山羊最易感，多呈慢性持续感染，潜伏期长，待该病发现时，整个羊群可能已经全部被感染。有国外引种历史的羊群和地区，caev感染的风险越高。主要传播途径为羔羊通过吸吮含病毒的初乳和常乳而进行传播，也可以通过易感羊与感染的成年羊长期密切接触而传播。

琼脂糖凝胶扩散试验（agid）是用于检测血清中caev抗体的最常用的方法，也是国际兽医组织(oie)推荐的检测方法。agid的常用抗原是全病毒抗原，而衣壳蛋白p28和囊膜蛋白gp135也可以用做agid的抗原，为血清学诊断标记蛋白。同时，由于elisa更敏感、更经济，且能够用于大规模的血清学筛查，在2004年被oie定为caev检测的标准方法。目前，常用于elisa抗原包括全病毒抗原和重组抗原，重组抗原中p28蛋白为重要的血清学诊断标蛋白，archambault等p28重组蛋白elisa进行山羊血清进行检测，显示其敏感性和特异性分别为96.9%和100%。

目前p28蛋白的重组表达方法主要以大肠杆菌表达为代表的原核表达，caev病毒感染哺乳动物上皮细胞，利用宿主的蛋白质表达系统进行翻译、表达，而原核细胞的蛋白表达系统与真核细胞差异较大，由于密码子的偏好差异和蛋白结构形成环境的差异使表达得到的蛋白在氨基酸序列、二级和三级结构上存在较大差异；此外，大肠杆菌表达已形成包涵体，不利于工业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的：本申请以caev病毒遗传物质rna的反转录产物dna序列为基础，根据毕赤酵母gs115表达蛋白中密码子的偏好、优化表达蛋白的稳定性、形成分泌表达等方面对p28蛋白的编码基因进行优化，将优化的基因克隆入ppic9k质粒构建重组质粒，并将线性化的重组质粒电激转化入毕赤酵母gs115中，筛选表达p28蛋白的单克隆菌落，经诱导表达确定为分泌表达，且与caev感染靶标动物刺激产生的抗体产生抗原-抗体反应。

本发明技术方案如下：一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白p28，包含经优化后的p28蛋白的核苷酸序列，如seqidno.1所示，一致性不小于95%的其它序列；以及包含经优化后的p28蛋白的氨基酸序列，如seqidno.2所示，一致性不小于95%的其它序列。

进一步限定，优化后的p28蛋白的核苷酸序列，如seqidno.1所示，优化后的p28蛋白的氨基酸序列，如seqidno.2所示。

一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白p28的制备方法，包括下述步骤：

（1）caevp28基因的密码子优化及合成

根据毕赤酵母gs115表达蛋白中的密码子对caevp28蛋白的编码基因进行优化及合成，获得puc57-p28质粒；

（2）重组载体的构建

将上述puc57-p28质粒经notⅰ和ecorⅰ双酶切后与ppic9k连接，构建了重组表达质粒ppic9k-p28；

（3）毕赤酵母gs115阳性重组子的筛选

通过电激转化将线性化的重组表达质粒ppic9k-p28导入毕赤酵母gs115中；

（4）p28/gs115工程菌的诱导表达，获得p28蛋白。

有益效果：用该方法制备的caev血清学诊断标记蛋白p28反应原性好、便于工业化生产，为开发caev高通量血清学诊断方法提供抗原。

附图说明

附图1为caevp28基因序列的相似性和遗传偏离；附图2为优化后的编码p28蛋白的基因序列（5’-3’）及蛋白的氨基酸序列（c-n）；附图3为ppic9k-p28重组质粒的双酶切鉴定结果，其中，5：空白对照；6：ppic9knotⅰ和ecorⅰ双酶切结果；7：ppic9k-p28notⅰ和ecorⅰ双酶切结果；8：d15000marker；附图4为线性化ppic9k-p28转化gs115结果；附图5为p28/gs115菌株pcr鉴定结果，其中，m：markerc（生工）；pcr检测结果均为阳性；附图6为p28/gs115工程菌诱导表达时间的优化，其中，m：预染蛋白marker；1：表达前上清；2-6：p28/gs11工程菌诱导表达1-5天结果；附图7为p28和gp135蛋白表达定量图，其中，1-2：p28/gs115工程菌诱导培养上清（10倍浓缩）；m蛋白分子量marker(低)（takara）；附图8为p28/gs115重组菌株诱导表达和westernblotting鉴定结果，其中，m：预染蛋白marker；1：表达前上清；2-3：p28/gs115重组菌株表达结果；附图9为wb方法诊断caev感染羊结果m：预染蛋白marker；1：阴性血清样本；2、3：caev感染山羊阳性血清样本；附图10为agid方法诊断caev感染羊结果，其中，左、中、右三幅图中：左-1、中-2、右-3为caev感染山羊阳性血清样本；左-3和左-4、中-3和中-4、右-1和右-2为caev阴性血清样本；左-2、中-1、右-4为空白对照。

具体实施方式

实施例、1．caevp28基因的优化与合成

（1）caevp28基因的同源性分析

对genebank中已公开的我国分离的三株山羊关节炎-脑炎病毒（caev）（genebank：kt749879.1,kt749880.1，kt749881.1）编码p28蛋白的基因进行同源性分析。经序列比对分析表明，三株caev编码的p28基因序列差异较小，同源性在98.5%以上，与国际上公开的基因序列的同源性大于91%，见图1caevp28基因序列的相似性和遗传偏离。

（2）caevp28基因的密码子优化

根据毕赤酵母gs115表达蛋白中密码子的偏好、诱导表达蛋白的稳定性、形成分泌表达等方面对p28蛋白的编码基因进行优化，委托上海生物工程技术有限公司合成部进行全基因合成，最终获得了puc57-p28质粒，优化后的编码p28蛋白基因的序列（5’-3’）及表达蛋白的氨基酸序列（c-n），见图2，优化后的编码p28蛋白的基因序列（5’-3’）及蛋白的氨基酸序列（c-n）。

2.重组载体的构建

将puc57-p28质粒经notⅰ和ecorⅰ双酶切后与ppic9k连接，构建了重组表达质粒ppic9k-p28，经双酶切验证，出现预期条带，见图3ppic9k-p28重组质粒的双酶切鉴定结果；5：空白对照；6：ppic9knotⅰ和ecorⅰ双酶切结果；7：ppic9k-p28notⅰ和ecorⅰ双酶切结果；8：d15000marker

3.gs115阳性重组子的筛选

通过dtt-liac法制备毕赤酵母gs115电转化感受态、大量提取试剂盒提取毫克级质粒，通过saci酶切线性化后进行胶回收。通过电激转化（biorad真菌转化默认参数）成功将线性化的重组质粒导入毕赤酵母gs115中，涂布md平板，出现预期单一菌落，见图4，线性化ppic9k-p28转化gs115结果。毕赤酵母阳性重组子的筛选通过g418多拷贝重组子的筛选，选择分别耐受1mg/ml、2mg/ml、3mg/mlg418的单菌落进行pcr鉴定，出现预期的目的条带，表明目的基因实现了与酵母的同源重组，见图5p28/gs115菌株pcr鉴定结果，m：markerc（生工）；pcr检测结果均为阳性。

4.p28/gs115工程菌的诱导表达

对筛选的阳性毕赤酵母p28/gs115工程菌进行甲醇诱导表达（1%甲醇），经sds-page分析，目的蛋白在26kda附近出现预期目的条带；进一步对p28/gs115重组菌株进行甲醇诱导时间的优化（0、1d、2d、3d、4d、5d），结果显示p28/gs115重组菌株在第4天后表达量得到了高峰，见图6，p28/gs115工程菌诱导表达时间的优化，m：预染蛋白marker；1：表达前上清；2-6：p28/gs11工程菌诱导表达1-5天结果。

采用30%乙醇浓度（v/v）对表达上清进行10倍浓缩，使用takara的蛋白定量marker进行sds-page分析，利用bandscan5.0软件对目的条带的灰度值进行计算，结果表达p28蛋白的表达量高达145mg/l，见图7，p28和gp135蛋白表达定量图；1-2：p28/gs115工程菌诱导培养上清（10倍浓缩）；m蛋白分子量marker(低)（takara）。

5.p28/gs115重组蛋白反应原性鉴定

p28/gs115工程菌进行甲醇诱导表达（1%甲醇），使用westernblotting进行反应原性鉴定分析，一抗为自然感染caev山羊产生的阳性血清，二抗为hrp标记的兔抗山羊igg，结果显示p28重组表达蛋白与caev利用宿主蛋白合成系统合成的蛋白有一致的反应原性，见图8，p28/gs115重组菌株诱导表达和westernblotting鉴定结果；m：预染蛋白marker；1：表达前上清；2-3：p28/gs115重组菌株表达结果。

实际应用举例

实例1.使用免疫印迹方法诊断caev感染羊

山羊关节炎-脑炎病毒（caev）感染山羊后，刺激产生抗体，将p28/gs115工程菌诱导表达、纯化的p28重组蛋白作为抗原，使用免疫印迹方法（westernblotting）检测被检山羊血清抗体，可以用于cae的血清抗体诊断。

1.材料方法

1.1材料

血清：caev感染山羊血清样本3份，其中阳性样本2份，阴性1份；

抗原：p28/gs115工程菌诱导表达、纯化p28蛋白；

二抗：hrp标记的兔抗山羊igg（天根生物技术有限公司）。

1.2试验方法

根据科学出版社的第三版《分子克隆-实验指南》中“附录8分子克隆中的常用技术-免疫印迹”（p1723-1726）进行：

（1）纯化的p28重组蛋白进行sds-page电泳，上样量10μl(p28蛋白150ng)，电压150v，电泳40min；

（2）将聚丙烯酰胺凝胶转移至滤膜上；

（3）封闭，被检血清（50倍稀释）孵育60min，清洗；

（4）二抗孵育（1,000倍稀释），清洗；

（5）显色

2.结果

一抗为自然感染caev山羊产生的阳性血清，二抗为hrp标记的兔抗山羊igg，结果显示p28重组表达蛋白与caev利用宿主蛋白合成系统合成的蛋白有一致的反应原性，见图9，wb方法诊断caev感染羊结果；m：预染蛋白marker；1：阴性血清样本；2、3：caev感染山羊阳性血清样本。

实例2.琼脂糖凝胶扩散方法诊断caev感染羊

山羊关节炎-脑炎病毒（caev）感染山羊后，刺激产生抗体，将p28/gs115工程菌诱导表达、纯化的p28重组蛋白作为抗原，使用琼脂糖凝胶扩散方法（agid）检测被检山羊血清抗体，可以用于cae的血清学诊断。

1.1材料

血清：caev感染山羊血清样本10份，其中阳性样本3份，阴性6份；

抗原：p28/gs115工程菌诱导表达、纯化重组p28蛋白；

1.2试验方法

参考《snt1171.2-2003山羊关节炎-脑炎抗体检测方法-琼脂免疫扩散试验》进行，p28/gs115工程菌诱导表达、纯化重组p28蛋白5μg/孔。

2.结果

agid结果显示:p28重组表达蛋白与caev感染山羊阳性血清产生免疫沉淀线，与阴性血清无反应线，见图10，agid方法诊断caev感染羊结果；左、中、右三幅图中：左-1、中-2、右-3为caev感染山羊阳性血清样本；左-3和左-4、中-3和中-4、右-1和右-2为caev阴性血清样本；左-2、中-1、右-4为空白对照。

实例3.间接elisa方法诊断caev感染羊

山羊关节炎-脑炎病毒（caev）感染山羊后，刺激产生抗体，将p28/gs115工程菌诱导表达、纯化的p28重组蛋白作为抗原，使用间接elisa方法检测被检山羊血清抗体，可以用于cae的血清学诊断。

1.1材料

血清：经idexxmvv/caevp28抗体筛查试剂盒（产品编号:p00303-10）筛查，山羊阳性血清样本30份，阴性60份；抗原：p28/gs115工程菌诱导表达、纯化的重组p28蛋白；

1.2试验方法

建立了以p28/gs115工程菌诱导表达、纯化重组p28蛋白为抗原的caev血清学检测间接elisa方法，阴性对照和阳性对照使用idexxmvv/caevp28抗体筛查试剂盒配备的标准物。

1）p28/gs115工程菌诱导表达、纯化的重组p28蛋白（10ng/ml），100μl/孔，4℃过夜。

2）5%脱脂乳（pbs-t）封闭液孵育30min，200μl/孔，清洗。

3）100μl/孔加入被测血清（500倍稀释），孵育1h，清板。

4）100μl/孔加入3000倍稀释的hrp标记兔抗山羊二抗孵育1h，清洗。

5）100μl/孔加入opd，显色10min

6）50μl/孔加入h2so4终止液终止反应。

7）待检血清孔od值与阴性对照比值≥2.1者判为阳性。

2.结果

经idexxmvv/caevp28抗体筛查试剂盒筛查后，经建立的ielisa方法检测，30份山羊阳性血清样本中26份为阳性，4份为阴性；60份阴性样本全部为阴性。与idexxmvv/caevp28抗体筛查试剂盒相比：符合率为95.6%，特异性为100%，敏感性为86.7%。

sequencelisting

<110>新疆畜牧科学院

<120>一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白p28及其制备方法

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