本发明涉及制药
技术领域：
，具体地涉及一种丙氨瑞林的制备方法。
背景技术：
：丙氨瑞林是我国自行研制的一种促性腺激素释放激素(gnrh)的九肽类似物，用药初期可刺激垂体释放促黄体生成素(lh)和促卵泡素(fsh)，引起卵巢源性甾体激素短暂升高；重复用药可抑制垂体释放lh和fsh，使血中的雌二醇水平下降，达到药物去卵巢的作用，这种抑制作用可用于治疗子宫内膜异位症等激素依赖性疾病。现有资料并没有公开过丙氨瑞林的制备方法。技术实现要素：本发明的目的提供一种丙氨瑞林的固相制备方法，该方法能获得收率和纯度高的丙氨瑞林，反应简单可控，适用于工业生产。一种丙氨瑞林地制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)活化boc-pro：将boc-pro和cs2co3分别溶解，然后混合，制备得活化的boc-pro产物boc-pro-cs；(2)boc-pro固化：将boc-pro-cs与氯甲基树脂溶解，将boc-pro固化，制得boc-pro树脂；(3)接肽：将boc-pro树脂采用逐一偶联的方式依次连接boc-arg、boc-leu、boc-ala、boc-tyr、boc-ser-(but)、boc-trp、boc-his-(tos)、pglu，合成得到丙氨瑞林-树脂；(4)对丙氨瑞林-树脂进行胺解脱树脂，转化为醋酸盐，得到丙氨瑞林粗品；(5)丙氨瑞林粗品经hplc纯化、冻干得到丙氨瑞林成品。在本发明步骤(2)中，所述boc-pro树脂的替代度为0.8-1.1mmol/g，优选地为0.9mmol/g。优选地，在本发明步骤(3)中，所述接肽包括如下步骤：(3a)去boc保护基：将hcl/iproh和boc-寡肽-树脂分别溶解于有机溶剂1中，混合，抽干得组分1，将组分1与弱碱溶液溶解混合，抽干得组分2；优选地，所述弱碱溶液为三乙胺/二氯甲烷溶液，三乙胺与二氯甲烷溶液的体积比优选为10∶90；(3b)氨基酸单体活化：hoat和氨基酸单体溶解于有机溶剂2，再加入dcci溶液，过滤得活化的氨基酸单体过滤液；(3c)生成boc-寡肽-树脂：在活化的氨基酸单体过滤液中加入步骤(3a)中得到的所述组分2中，制得boc-寡肽-树脂。优选地，在本发明方法的步骤(3a)中，在接二肽至接七肽时，所述有机溶剂1为二氯甲烷。更优选地，hcl/iproh与二氯甲烷体积比为1∶1；再优选，步骤(3a)中，在所述混合后搅拌40min。优选地，在本发明方法的步骤(3a)中，接八肽和九肽时，所述有机溶剂1为二氯甲烷和巯基乙醇；更优选地，hcl/iproh、二氯甲烷与巯基乙醇体积比为5∶4∶1；再优选地，在所述混合后搅拌60min。优选地，在本发明方法的步骤(3b)中，所述有机溶剂2为dmf。优选地，在本发明方法的步骤(3b)中，还包括加入dcci溶液前，将hoat和氨基酸单体溶液的温度控制在-10-10℃之间，然后反应30min的步骤。优选地，在本发明方法的步骤(3b)中，所述dcci溶液为dcci的dmf溶液。优选地，在本发明方法的步骤(3c)中，反应温度控制在5-10℃之间。本文“boc-寡肽-树脂”，接二肽时，为boc-pro树脂；接三肽时，为boc-arg-pro树脂；接四肽时，为boc-leu-arg-pro树脂，依次类推。本文中基团“boc”为叔丁氧羰酰基，基团“dcci”为二环己基碳二亚胺；基团“hoat”为1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑；基团“iproh”为异丙醇，基团“pro”、基团“arg”、基团“ala”、基团“leu”、基团“tyr”、基团“ser”、基团“trp”、基团“his”为各氨基酸、基团“pglu”为焦谷氨酸。“boc-氨基酸单体”为boc-arg、boc-ala、boc-leu、boc-tyr、boc-ser、boc-trp、boc-his、pglu。本发明人经研究发现，丙氨瑞林的第6位氨基酸d-ala，ala的-r基团-ch3，其去质子化能力比其他的氨基酸如d-leu、gly的-r基团去质子化能力强。采用hoat+dcci活化羧基过程中，d-ala形成的高活性噁唑酮中间体比其他氨基酸的中间体不稳定，更容易发生消旋副反应。并且在在合成丙氨瑞林过程中，需要反复使用三乙胺中和洗涤除去复分解反应所生成的盐，以便释放出游离氨基；但三乙胺会去夺取非保护的氨基(保护基已经脱除)的手性碳原子上的质子，进而引发消旋副反应的发生。而d-ala的手性碳原子上的去质子化能力比其他氨基酸如d-leu、gly的强，更易发生消旋化副反应。综上所述，丙氨瑞林由于第6位氨基酸为d-ala，该氨基酸单体容易在丙氨瑞林肽段合成过程中发生消旋副反应，产生杂质，因此需要优化肽段合成中的反应条件，减少d-ala消旋副反应发生，提高反应收率和产品纯度。本发明通过对制备工艺的优化，解决了d-ala消旋副反应的问题，从而获得高收率的高纯产品。具体实施方式为了使本发明所解决的技术问题及技术方案的效果更加清楚地说明，结合以下实施例，对本发明做进一步地说明。下述实施例中，除非另有说明，所述的实验方法的具体条件通常按照常规条件或制造商建议的实施条件；所述原料及试剂均购自市售品；所述的比例、比率、百分比或份数均按照重量计算。实施例1活化boc-pro三口烧瓶内称取193.8g的boc-pro，溶于1200ml甲醇中。三口烧瓶内称取190.6g的cs2co3溶于1200mlh2o中，缓缓加入上述boc-pro溶液中，得到无色透明的boc-pro-cs溶液，其ph值为7.2。在40℃水浴中水泵减压浓缩，蒸去溶剂，得固体物；加入甲醇500ml，减压蒸干，再次加入甲醇500ml减压蒸干，得400g干燥的boc-pro-cs。实施例2boc-pro固化boc-pro-cs按照实施例1所述的方法制备。称取氯甲基树脂670g，boc-pro-cs400g加dmf2000ml，完全溶解后倒入三口烧瓶中。45℃水浴搅拌反应48小时，抽滤，树脂用dmf洗3次，再用纯化水洗至无cl-反应，用无水乙醇洗4次，甲醇洗2次。置于烘箱中40～45℃烘干，得boc-pro树脂干燥品。boc-pro的取代当量数为0.92mmol/g，反应收率为96％。实施例3boc-pro固化boc-pro-cs按照实施例1所述的方法制备。称取氯甲基树脂670g，boc-pro-cs300g加dmf1800ml，完全溶解后倒入三口烧瓶中。45℃水浴搅拌反应48小时，抽滤，树脂用dmf洗3次，再用纯化水洗至无cl-反应，用无水乙醇洗4次，甲醇洗2次。置于烘箱中40～45℃烘干，得boc-pro树脂干燥品。boc-pro的取代当量数为1.0mmol/g，反应收率为97％。实施例4boc-pro固化称取氯甲基树脂670g，boc-pro-cs400g加dmf3000ml，完全溶解后倒入三口烧瓶中。45℃水浴搅拌反应48小时，抽滤，树脂用dmf洗3次，再用纯化水洗至无cl-反应，用无水乙醇洗4次，甲醇洗2次。置于烘箱中40～45℃烘干，得boc-pro树脂干燥品。boc-pro的取代当量数为1.1mmol/g，反应收率为100.2％。实施例5接肽boc-pro树脂按照实施例4所述的方法制备。(1)接二肽(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷(10/90)洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；二氯甲烷洗涤3次至呈中性，抽干。接肽：boc-arg·hcl(·h2o)279.0克(295.92克)(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)(3b)氨基酸单体活化：hoat和dcci，分别用600mldmf溶解，先将氨基酸单体的溶解液与hoat的溶解液混合，冰浴搅拌反应30分钟，然后再加入dcci溶解液，继续搅拌反应30分钟后，过滤，得过滤液。(3c)生成boc-寡肽-树脂：过滤液倒入树脂中，密塞瓶口，5℃～10℃下反应3～6h。抽干溶剂，以二氯甲烷洗涤1次、无水乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。(2)接三肽去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：boc-leu(·h2o)208.8(225)克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)方法同接二肽。(3)接四肽去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：boc-d-ala171克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)方法同接二肽。(4)接五肽去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：boc-tyr253.44克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)方法同接二肽。(5)接六肽去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：235.44克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)方法同接二肽。(6)接七肽去保护基、洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：boc-trp274.44克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)(7)接八肽去保护基：9-10nhcl/iproh780ml+二氯甲烷624ml+巯基乙醇156ml，搅拌60分钟，抽干。洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：737.2克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)方法同接二肽。(8)接九肽去保护基：方法同接八肽。洗涤、中和：方法同接二肽。接肽：pglu115.44克(900mmol)hoat140.0克(1035mmol)dcci213克(1035mmol)洗涤：二氯甲烷洗涤1次、乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤2次、甲醇洗涤2次，抽干。干燥：树脂于50℃烘箱中干燥0.5小时以上，再置p2o5干燥箱中干燥至恒重，得丙氨瑞林树脂。实施例6步骤(3b)的优化实验实验a-c的boc-pro树脂按照实施例4所述的方法制备。实验a：预活化+过滤(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷(10/90)洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；二氯甲烷洗涤3次至呈中性，抽干。(3b)氨基酸单体活化：hoat和dcci，分别用600mldmf溶解，先将氨基酸单体的溶解液与hoat的溶解液混合，温度控制至0℃左右，搅拌反应30分钟，然后再加入dcci溶解液，继续搅拌反应30分钟后，过滤，得过滤液。(3c)生成boc-寡肽-树脂：过滤液倒入树脂中，密塞瓶口，5℃～10℃下反应3～6h。抽干溶剂，以二氯甲烷洗涤1次、无水乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。实验b：不预活化+仅过滤(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷(10/90)洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；二氯甲烷洗涤3次至呈中性，抽干。(3b)溶解：hoat、dcci、氨基酸单体用1800mldmf溶解，搅拌60分钟后，过滤，得过滤液。(3c)生成boc-寡肽-树脂：过滤液倒入树脂中，密塞瓶口，5℃～10℃下反应3～6h。抽干溶剂，以二氯甲烷洗涤1次、无水乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。实验c：预活化+不过滤(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷(10/90)洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；二氯甲烷洗涤3次至呈中性，抽干。(3b)氨基酸单体活化：hoat和dcci，分别用600mldmf溶解，先将氨基酸单体的溶解液与hoat的溶解液混合，温度控制至0℃左右，搅拌反应30分钟，然后再加入dcci溶解液，继续搅拌反应30分钟后，得过反应液。(3c)生成boc-寡肽-树脂：反应液倒入树脂中，密塞瓶口，5℃～10℃下反应3～6h。抽干溶剂，以二氯甲烷洗涤1次、无水乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。实验d：既不预活化，也不过滤(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷(10/90)洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；二氯甲烷洗涤3次至呈中性，抽干。(3b)溶解：hoat、dcci、氨基酸单体分别用600mldmf溶解，得溶解液；(3c)生成boc-寡肽-树脂：溶解液分别倒入树脂中，密塞瓶口，5℃～10℃下反应3～6h。抽干溶剂，以二氯甲烷洗涤1次、无水乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。用实验a、b和c的方法，分别用于接二肽ala和leu，分别生成boc-ala-pro-树脂和boc-leu-pro-树脂。接二肽ala的boc-d-ala、hoat和dcci的添加量为：171克(900mmol)boc-d-ala、140.0克(1035mmol)hoat、213克(1035mmol)dcci。接二肽leu的boc-leu(·h2o)、hoat和dcci的添加量为：208.8克(900mmol)boc-leu(·h2o)、140.0克(1035mmol)hoat、213克(1035mmol)dcci。表1：实验a-c的实验结果比较从表1的实验结果可以看出：(1)预活化和过滤都可以提高接二肽反应收率和产物纯度，二者合用时，boc-ala-pro-树脂和boc-leu-pro-树脂的收率分别达到95％和98％，产物纯度分别达到89％和92％；(2)实验a和实验b的实验结果显示，没有预活化步骤时，接二肽ala的反应收率和产物纯度低于接二肽leu的反应收率和产物纯度；有预活化步骤时，接二肽ala的反应收率和产物纯度与接二肽leu的反应收率和产物纯度相当。分析原因可能是：d-ala的手性碳原子上的去质子化能力比d-leu的强，当采用hoat+dcci活化氨基酸羧基过程中，d-ala形成的高活性噁唑酮中间体比d-leu的不稳定，使得d-ala的手性碳原子在羧基活化过程中比d-leu的手性碳原子容易发生消旋副反应，同理d-ala的手性碳原子在羧基活化过程中比其他氨基酸的的手性碳原子容易发生消旋副反应。预活化步骤可以降低氨基酸的手性碳原子在羧基活化过程消旋副反应，实验结果显示对d-ala，预活化尤为重要。(3)实验a和实验c的实验结果显示，过滤对接二肽ala和接二肽leu的反应收率和产物纯度影响相当。过滤可以提高反应收率和产物纯度，其原因是：活化羧基过程中dcc(二环己基碳二亚胺)与单体反应后产生大量不易溶解的副产物n,n'-二环己基脲(dcu)，若不过滤，则这些不溶解的副产物势必会干扰肽键的生产；过滤可以将副产物dcu提前滤除，明显提高合成产率。实验d中将单体氨基酸，活化剂，树脂三者同时加入一起进行反应，没有提前过滤掉副产物dcu，合成产率被显著降低。本发明所述的“预活化”是指“hoat、dcci和氨基酸单体分别用溶剂溶解，将氨基酸单体溶液与hoat溶液混合先反应，再加入dcci溶液，继续进行反应”的步骤。实施例7boc-pro树脂按照实施例4所述的方法制备。(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷(10/90)洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；二氯甲烷洗涤3次至呈中性，抽干。(3b)氨基酸单体活化：hoat和dcci，分别用600mldmf溶解，先将氨基酸单体的溶解液与hoat的溶解液混合，温度控制至t℃左右，搅拌反应b分钟，然后再加入dcci溶解液，继续搅拌反应30分钟后，过滤，得过滤液。(3c)生成boc-寡肽-树脂：过滤液倒入树脂中，密塞瓶口，温度w℃下反应a小时，抽干溶剂，以二氯甲烷、无水乙醇、dmf洗涤，抽干。表2：温度t对反应的影响(w＝5℃，a＝3小时)t(℃)b(分钟)收率纯度有关物质-1030568413-540548414030568512525528414103048801625(室温)25427226表2的实验结果显示，温度t不高于5℃时，收率大于50％、纯度84％左右和有关物质13％左右，优于温度t高于5℃时，但是温度t控制至低于-5℃的成本较高，因此优选温度t至-5-5℃。表3的实验结果显示，温度w不高于10℃时，收率大于55％、纯度大于82％、有关物质低于20％，优于温度w高于10℃时；但是温度不高于5℃，低至0℃时，反应时间a从3小时加倍至6小时，不利于提高反应的效率，因此优选温度w至5-10℃。表3：温度w对反应的影响(t＝0℃，b＝30min)w(℃)a(小时)收率纯度有关物质065482145356851210355841425(室温)3497620实施例8三乙胺量的筛选boc-pro树脂按照实施例4所述的方法制备。(3a)称取300mmol的boc-pro树脂，置10l反应釜中，二氯甲烷洗涤2～3次，抽干；去保护基：加入9-10nhcl/iproh约780ml+二氯甲烷约780ml，搅拌40分钟，抽干；洗涤：二氯甲烷洗涤1次，抽干；dmf洗涤1次，抽干；加入三乙胺/二氯甲烷洗涤，抽干；dmf洗涤一次，抽干；二氯甲烷洗涤至呈中性，抽干。(3b)氨基酸单体活化：hoat和dcci，分别用600mldmf溶解，先将氨基酸单体的溶解液与hoat的溶解液混合，温度控制至0℃左右，搅拌反应30分钟，然后再加入dcci溶解液，继续搅拌反应30分钟后，过滤，得过滤液。(3c)生成boc-寡肽-树脂：过滤液倒入树脂中，密塞瓶口，5℃～10℃下反应3～6h。抽干溶剂，以二氯甲烷洗涤1次、无水乙醇洗涤1次、dmf洗涤2次、二氯甲烷洗涤1次，抽干。表4：三乙胺用量对反应的影响表4对的实验结果显示，三乙胺/二氯甲烷的比例(体积比)为10∶90时，洗涤次数少，收率高，纯度高、有关物质含量低，因此优选三乙胺/二氯甲烷的比例(体积比)为10∶90。实施例9胺解3.1、胺解：将实施例5制备的丙氨瑞林九肽树脂分别置4只3l抽滤瓶中，每瓶加入约750ml无水甲醇，各加入乙基胺约1125ml，密闭。于室温振摇24小时，冷却下打开塞子，过滤，树脂用甲醇洗涤4次，合并滤洗液。3.2、浓缩：滤洗液40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，加甲醇溶解再减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，如此反复三次，成泡沫状，得浓缩物ⅰ。3.3、转醋酸盐：浓缩物ⅰ称重，以5倍体积甲醇溶解，50倍体积丙酮沉淀，过滤，滤饼用5倍体积50％醋酸溶解，40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，加甲醇溶解再减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，如此反复至少三次，至成泡沫状，得浓缩物ⅱ。3.4、沉淀：浓缩物ⅱ称重，以10倍体积甲醇溶解，50倍体积丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚洗涤3次，抽干。3.5、滤液可回收利用，重复2.3～2.5步骤。3.6、真空干燥：滤饼真空干燥，得丙氨瑞林粗品。cm纯化将3.6获得的丙氨瑞林粗品用ph6.0、0.05mol/l的乙酸钠溶液溶解(按1g粗品加入80～100ml溶液)，0.45μm膜过滤，上层析柱。上样完毕后用ph6.0、0.05mol/l的乙酸钠缓冲液洗涤至吸光值＜0.2，再用ph6.0、0.5mol/l乙酸钠缓冲液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，当吸光值od280上升在0.4时，开始收集，下降至0.4时停止收集。收集的洗脱液经hplc分析纯度(纯度应≥70％)，并计算含量。hplc纯化收集的预处理洗脱液经0.45μm膜过滤后上已经过溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)平衡好的制备型hplc柱。用溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)和溶剂b(0.5％乙酸、80％乙腈溶液)进行梯度洗脱，收集合并所有纯度≥98.5％的收集液即得丙氨瑞林中间体。浓缩6.1、丙氨瑞林中间体用1～2倍注射用水稀释后再吸附到hplc制备柱上，用溶剂c(0.1m醋酸铵溶液、ph＝5.0)洗涤，溶剂a(0.5％乙酸、5％乙腈溶液)洗涤，最后用溶剂d(0.5％乙酸、40％乙腈溶液)洗脱，收集有吸收值部分。6.2、旋转浓缩：上述的柱浓缩液，经40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08～-0.1mpa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。冻干7.1、溶解：将浓缩物加适量注射用水溶解，通过两个0.22μm过滤器过滤，再用注射用水冲洗过滤器。最终控制过滤收集液的浓度为8％～10％。7.2、进箱：过滤后的药液，倒入冻干盘中，进冻干箱冻干。7.3、冻干工艺条件为：预冻：导热油温度小于-40℃，保温2小时左右。升华：导热油升温速度约10℃/小时，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度不大于20pa。导热油温度达约38℃时，保温约18小时至干燥终点。7.4、出箱后即得丙氨瑞林原料。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12