人工改造的PCV2Cap蛋白、重组病毒及其应用的制作方法

文档序号：13126262阅读：1817来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人工改造的pcv2cap蛋白，还涉及含有此蛋白编码基因的重组病毒，还涉及人工改造的pcv2cap蛋白及重组病毒的应用。

背景技术：

猪圆环病毒1型和2型(pcv1和pcv2)非常小，直径只有17nm左右，呈球状，不具有囊膜。其基因组为单链环状dna，大约由1760个核苷酸构成，至少编码两个开放阅读框，分别是orf1和orf2。其中orf1编码rep蛋白，与病毒dna复制有关。orf2编码cap蛋白，与病毒粒子的装配相关。猪圆环病毒病(pcvd)在全球范围内广泛流行，给养殖业带来了巨大的经济损失。pcv2是导致该疾病的主要病原因子，对猪体进行pcv2疫苗免疫是较为有效的预防手段。

传统的疫苗种类包括弱毒苗和灭活苗，两者的制备都需要大规模地培养病原微生物，在生产应用上存在一定的风险。重组亚单位疫苗因不含有病原微生物及其遗传物质，所以不存在上述风险。杆状病毒-昆虫细胞表达系统(bevs)是一个高效的表达系统，能够表达具有生物活性的大分子蛋白质，已被广泛地用于生产病原微生物的抗原。近来，已有多种基于该平台的疫苗得到了商品化，比如merck的猪瘟苗porcilis和b.ingelheim的圆环苗杆状病毒的宿主范围较窄，不能够在脊椎动物体内复制，具有较高的安全性。bevs表达的蛋白容易自组装成病毒样颗粒，vlp能够被宿主细胞的tlrs和prrs识别，进而激活先天性免疫机制。此外，由于vlp具有规则的表面结构，所以能够有效地使b细胞表面的免疫球蛋白分子相互交联，进而诱导强烈的b细胞反应。vlps还有利于抗原递呈细胞(特别是树突状细胞)的抗原递呈作用，进而将抗原分子展示给免疫细胞。

cap蛋白是pcv2的主要免疫原性蛋白，具有多个表位。最近，研究人员使用了多种表达系统来表达cap蛋白，从而制备pcv2亚单位疫苗，比如大肠杆菌和重组病毒载体疫苗(杆状病毒和伪狂犬病毒)。尽管每种表达系统都具有独特的优势，但是也存在一些不足限制了重组亚单位疫苗的开发利用。比如大肠杆菌表达系统操作简单、产量高，但是表达的蛋白不能够正确的折叠和加工，而这些对抗原天然构象的形成是必不可少的。杆状病毒表达系统能够表达多种病毒的结构蛋白，进而形成病毒样颗粒(vlps)。目前国外已有两种基于杆状病毒表达系统的pcv2亚单位疫苗得到了商品化，应用效果良好。我国也已有采用该表达系统表达pcv2cap蛋白的研究报道，但其表达水平较低，疫苗生产成本较高。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中pcv2cap蛋白表达水平较低，疫苗免疫免疫效果不够理想的问题，本申请公开了一种人工改造的pcv2cap蛋白，还涉及含有此蛋白编码基因的重组病毒，还涉及人工改造的pcv2cap蛋白及重组病毒的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

表达人工改造的pcv2cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。

人工改造的pcv2cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。

含有、所述的表达人工改造的pcv2cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。

所述的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：

(1)以含有序列表中序列1的核苷酸序列的pcv2orf2基因为模板，以下述的引物对中的一对进行pcr扩展，pcr产物经纯化后酶切克隆入pfastbac载体，转化大肠杆菌dh5α，选取阳性质粒得到重组质粒；

(2)重组质粒转化感受态细胞dh10bac，培养，进行蓝白斑筛选，按bac-to-bac杆状病毒表达系统中的碱裂解法提取重组载体骨架bacmid，转染昆虫细胞，出现病变的昆虫细胞即为重组病毒；

所述引物对的核苷酸序列如下：

kozakandmutations:5’-cgctcgagatcaaaatggcctaccccc-3’,

kozakr:5’-agggtacctcacttggggttcag-3’。

或：kozaks:5’-cgctcgagatcaaaatgacctaccccc-3’，

kozakr:5’-agggtacctcacttggggttcag-3’。

所述的人工改造的pcv2cap蛋白或者所述的重组病毒在pcv2免疫疫苗中的应用。

从重组病毒中获取pcv2cap蛋白，制备成疫苗。

重组病毒细胞中加入pbs溶液得到细胞悬液，吹下细胞，对细胞悬液进行超声波裂解，得到含有pcv2cap蛋白的细胞裂解液，以cp974s水佐剂为基础，配制佐剂，将佐剂与等体积的细胞裂解液混合，制备动物免疫用疫苗。

所述免疫疫苗为重组亚单位疫苗。

本发明的有益效果：

1)其中重组杆状病毒rbcapokm为研制pcv2亚单位疫苗奠定了重要基础。为了提高pcv2cap蛋白表达水平和抗原性，本发明根据昆虫细胞密码子的偏嗜性对cap蛋白的基因进行优化，设计了7种含cap蛋白的基因分子，构建重组病毒，筛选获得两株重组杆状病毒，能有效表达cap蛋白，具有良好的免疫原性，并能够自组装成病毒样粒子，为pcv2亚单位疫苗的研发打下了基础；

2)本发明构建成功的昆虫杆状病毒表达系统制备的pcv2亚单位疫苗，进行动物免疫试验。小鼠免疫试验表明，重组蛋白均可诱导产生高水平的elisa抗体和中和抗体。该重组cap蛋白具有较好的免疫保护效果，具有很好的开发和应用前景。

附图说明

图1为cap基因扩增，

图2为目的基因的扩增结果，

a:m.dl5000dnamarker；1.pvax-cap双酶切产物(bamhi和xhoi)；2.pvax双酶切产物(bamhi和xhoi)；b:m.100bpdnamarker；1.capompcr产物；c:m.100bpdnamarker；1.capo/bnlspcr产物；d:m.dl2000dnamarker；1.capokpcr产物；2.capokmpcr产物；

e:m.dl2000dnamarker；1.capoempcr产物；2.capo△nlspcr产物，

图3重组载体质粒的鉴定，其中

a:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbachtb-capo双酶切产物(bamhi和xhoi)；2.pfastbachtb双酶切产物(bamhi和xhoi)；m2.dl15000dnamarker.b:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbachtb-capom双酶切产物(bamhi和xhoi)；2.pfastbachtb双酶切产物(bamhi和xhoi)；m2.dl15000dnamarker.c:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbacdual-capo/bnls双酶切产物(xhoi和kpni)；2.pfastbacdual双酶切产物(xhoi和kpni)；m2.dl15000dnamarker.d:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbacdual-capok双酶切产物(xhoi和kpni)；2.pfastbacdual双酶切产物(xhoi和kpni)；m2.dl15000dnamarker.

e:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbacdual-capokm双酶切产物(xhoi和kpni)；2.pfastbacdual双酶切产物(xhoi和kpni)；m2.dl15000dnamarker.f:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbacdual-capo△nls双酶切产物(ecori和hindiii)；2.pfastbacdual双酶切产物(ecori和hindiii)；m2.dl15000dnamarker.g:m1.dl2000dnamarker；1.pfastbacdual-capoem双酶切产物(ecori和hindiii)；2.pfastbacdual双酶切产物(ecori和hindiii)；m2.dl15000dnamarker.

图4重组bacmid的pcr鉴定，其中

a:1,2:rbacmid-capopcr产物；m:dl5000dnamarker.b:1,2:rbacmid-capompcr产物(m13fandm13r).1,2:recombinantbacmiddnaamplifiedwithm13primers；m:dl5000dnamarker.c:1～4:rbacmid-capo/bnlspcr产物(m13fandm13r)；m:1kbdnamarker.d:1～2，5～6:rbacmid-capokpcr产物(m13fandkozaks)；3～4,7～8:rbacmid-capokmpcr产物；m:dl5000dnamarker.e:1～3:rbacmid-cap△nlspcr产物；m:dl5000dnamarker.f:1～4:

rbacmid-capoempcr产物；m.dl2000dnamarker.

图5重组杆状病毒感染sf9细胞的cpe

图6重组cap蛋白的sds-page分析，其中a:m,proteinmarker；1,rbcapo；2,rbcapom；3,rbcapok；4,rbcapokm；5,vbac-cap；6,lysatesofcells；b:m,proteinmarker；1,rbcapo/bnls；2,rbcapo△nls；3,rbcapoem；4,vbac-cap；5,lysatesofcells，

图7不同病毒感染的sf9细胞中重组cap蛋白的westernblot鉴定，其中a:1,rbcapo；2,rbcapom；3,rbcapok；4,rbcapokm；5,rbcapo△nls；6,rbcap/bnls；7,cellscontrol.b:1,rbcapoem；2,cellscontrol.

图8不同病毒感染的sf9细胞内重组cap蛋白的ifa鉴定，其中

a:rbcapo；b:rbcapom；c:rbcapok；d:rbcapokm；e:normalcells，

图9vlps的电镜观察，

图10小鼠免疫后elisa抗体检测，

图11小鼠免疫后中和抗体检测，

图12小鼠免疫后淋巴细胞增殖反应的检测，

图13仔猪免疫后elisa抗体检测(s/p)，

图14仔猪免疫后中和抗体检测，

图15攻毒后仔猪体温的测定，

图16攻毒后各组猪相对日增重测定。

图17肺脏及淋巴结显微病变(he染色，100×)，其中

cph(1),ipcv2(2)andchallengecontrol(3)at28dpc，

图18ihc检测结果(400×)，其中

cph(1),ipcv2(2)andchallengecontrol(3)at28dpc。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1材料与方法

1.1材料

昆虫杆状病毒表达系统(baculovirusexpressionsystem,bevs)由本实验室保存，包括pfastbachtb、pfastbacdual质粒、dh10bac菌株、sf9昆虫细胞。大肠杆菌dh5α由本实验室保存，本实验中所用的限制性内切酶、t4dna连接酶、taq酶均购自takara公司。dna回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自鼎国公司。培养昆虫细胞的grace培养基、expressfive无血清培养基和fbs为gibco公司产品。转3染试剂lipofectamine2000购于invitrogen公司。hrp标记的羊抗小鼠igg和fitc标记的spa购自博士德公司。含有经密码子优化的pcv2wg09毒株orf2基因的pvax-cap质粒由本实验室构建和保存，pvax-cap质粒中含有序列表中序列1中的capo基因序列，是经过优化的，针对pcv2cap蛋白的单克隆抗体亦由本实验室制备和保存。

1.2方法

1.2.1pcv2cap基因片段克隆引物设计和合成

1.2.1.1序列优化的完整cap基因的获得(capo)

用质粒pvax-cap转化感受态dh5α。挑取单菌落于含有kna+抗性的液体lb培养基中，37℃振荡培养12h，收集菌体，提取质粒。利用限制性内切酶bamhi和xhoi对提取的pvax-cap质粒进行双酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切取目的条带并进行纯化。

1.2.1.2碱基突变的完整cap基因的扩增(capom)

根据质粒pvax-cap的碱基序列，设计如下引物，

pcv2-orf2-s:5’-attggatccacgaccatggcctaccctcgc-3’和

pcv2-orf2-a:5’-cgcgctcgagtcacttggggttcag-3’，扩增得到capom。

1.2.1.3缺失核定位信号并添加分泌信号肽的cap的扩增(capo/bnls)

根据质粒pvax-cap和蜜蜂分泌信号肽(honeybeemelittinsecretionsignalpeptide)的碱基序列，设计如下三个引物，s1:5’-cttgtttttatggtcgtatacatttcttacatctatgccaacggcatcttcaaca-3’,s2:5’-gcctcgagacgaccataaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcg-3’和a:5’-atttggtacctcacttggggttcaggg-3’，分两次扩增出capo/bnls。

1.2.1.4添加昆虫kozak序列的完整cap的扩增(capok，见序列表中序列2)

根据质粒pvax-cap和果蝇的kozak序列的碱基，设计如下一对引物，kozaks:5’-cgctcgagatcacaatgacctaccccc-3’和kozakr:5’-agggtacctcacttggggttcag-3’，扩增出capok。

1.2.1.5添加昆虫kozak序列和碱基突变的完整cap的扩增(capokm，见序列表中序列3)

根据质粒pvax-cap和果蝇的kozak序列的碱基，设计如下一对引物，

kozakandmutations:5’-cgctcgagatcacaatggcctaccccc-3’和

kozakr:5’-agggtacctcacttggggttcag-3’，扩增出capokm。

1.2.1.6添加ecori序列的去nls的cap的扩增(capo△nls)

根据质粒pvax-cap和ecori序列的碱基，设计如下一对引物，

s-ecori(nls):5’-gcgaattcatgggcatcttcaacacc-3’

和r-hindiii:5’-cgaagctttcacttggggttca-3’，扩增得到去除nls的cap，命名为cap△nls。

1.2.1.7添加ecori序列的碱基突变的完整cap的扩增

根据质粒pvax-cap和ecori序列的碱基，设计如下一对引物，s-ecori:5’-ggatccgaattcatggcctacccc-3’和r-hindiii:5’-cgaagctttcacttggggttca-3’，扩增得到capem。

1.2.2目的基因片段的扩增

以质粒pvax-cap为模板，利用前文所述的各对引物，通过pcr分别扩增各个对应的cap基因片段。

pcr反应体系为：上、下游引物各1μl，2×mix12.5μl；稀释质粒的模板1.0μl；taqdna聚合酶0.2μl；灭菌双蒸水补至25μl。循环参数：95℃5min；94℃45s,52-58℃45s，72℃45s，30次循环；最后72℃延伸10min。根据各对引物的tm值，确定不同的退火温度，一般计算公式为：tm＝4(g+c)+2(a+t)，退火温度＝tm值-(5～10℃)。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物，回收pcr产物，-20℃保存备用。

1.2.3pcr产物的克隆

1.2.3.1pcr产物的回收和纯化

pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖胶块，参照dna快速回收纯化试剂盒说明书回收目的片段。

1.2.3.2pcr产物酶切与纯化

酶切反应总体积为20.0μl。10×buffer2.0μl，pcr回收片段10.0μl，酶各0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl。37℃作用4.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。

不同cap片段采用对应的限制性内切酶，酶切体系如下：10×buffer2μl,内切酶10.5μl,内切酶20.5μl,pcr产物10μl,ddh2o7μl,总计20μl。

提取pvax-cap质粒，用限制性内切酶bamhi和xhoi对其进行双酶切，得到目的片段capo。再以pvax-cap质粒为模板，利用上文中的引物进行pcr扩增，分别得到对应的pcr产物。经1％琼脂糖凝胶电泳分析，pcr产物均在相应位置处出现特异性条带，与预期大小结果相符，如图2所示。然后切取含有目的片段的凝胶，回收纯化后备用。

1.2.3.3pfastbac载体的酶切与纯化

酶切反应总体积为20.0μl。10×buffer2.0μl，质粒5.0μl，内切酶各0.5μl，用无菌双蒸水补至总体积20.0μl，具体为：pfastbachtb用bamhi和xhoi双酶切，pfastbacdual分别用xhoi、kpni和ecori、hindiii双酶切。37℃作用4.0h，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。

酶切体系：10×buffer2.0μl，内切酶10.5μl，内切酶20.5μl，质粒5μl，ddh2o12μl，总计：20μl。

1.2.3.4目的基因克隆入pfastbac载体

通过酶切位点，将capo和capom基因分别克隆入供体质粒pfastbac^tmhtb中，将capo/bnls、capok、capokm、capoem和capo△nls基因分别克隆入供体质粒pfastbacdual中。16℃下过夜连接，将连接产物转化感受态dh5α细胞，再涂布含有氨苄青霉素的lb平板培养，37℃培养12h后挑取单个菌落培养，常规的碱裂解法提取疑似重组质粒。

连接体系：10×t4dnaligasebuffer1.0μl，t4dnaligase0.5μl，酶切目的基因7.5μl，酶切质粒载体1μl，总计10μl。

1.2.3.5连接产物的转化

将全部连接产物加入到dh5α感受态细胞，冰浴30min后42℃水浴中热激90s，然后迅速冰浴5min；加入800μllb液体培养基，37℃250rpm振摇培养50min；12000rpm离心30s后弃去大部分上清，剩余100μl上清重悬细菌沉淀，涂布于含50μg/ml氨苄青霉素的抗性平板上，37℃温箱中培养12h。

1.2.3.6重组质粒的小量提取

挑取连接产物转化后所涂布氨苄青霉素抗性平板上的单个菌落，接种于3ml的含50μg/mlamp的lb培养基中，37℃250rpm振荡培养12h，按axygen公司说明书提取质粒。

1.2.3.7重组质粒的酶切和测序鉴定

对提取的疑似阳性重组质粒进行双酶切鉴定，将鉴定正确的阳性质粒送由invitrogen公司进行测序鉴定。最后将鉴定正确的重组质粒pfastbachtb-capo、pfastbachtb-capom、pfastbacdual-cap/bnls、pfastbacdual-capok、pfastbacdual-capokm、pfastbacdual-capoem和pfastbacdual-cap△nls用于后续试验。双酶切鉴定体系如下：10×buffer2.0μl，内切酶10.5μl，内切酶20.5μl，质粒5μl，ddh2o12μl，总计20μl。

将capo和capom基因分别克隆入供体质粒pfastbac^tmhtb中，将capo/bnls、capok、capokm、capoem和capo△nls基因分别克隆入供体质粒pfastbacdual中。经pcr鉴定为阳性后，再进行双酶切鉴定，结果都切出与目的基因大小一致的片段(图3)。测序结果进一步表明，各个基因均正确克隆入载体，符合原有的阅读框。

1.2.4重组bacmid的构建与鉴定

1.2.4.1位点特异性转座

取冻存的dh10bac菌液接种于含50μg/ml卡那霉素的3mllb培养基中，37℃200rpm振荡培养12h；第二天取10μl新鲜菌液接种于新的含卡那霉素的lb培养基中，振荡培养。取3ml菌液制备感受态细胞，方法参见1.2.3.5。按照bac-to-bac表达系统说明书进行转化，将阳性质粒转化感受态细胞dh10bac，具体步骤如下：将1ul的重组质粒加入到100uldh10bac感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃水浴热激45s，迅速置于冰水混合物中冰浴2min，然后加入800ul的新鲜lb液体培养基，37℃200rpm振荡培养4h，然后取10μl菌液稀释于200μl无抗生素的lb液体培养基中，涂布含10μg/ml四环素、50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、100μg/mlx-gal和40μg/mliptg的lb平板。37℃温箱避光培养48h，至出现显著蓝白菌落。

1.2.4.2重组载体骨架bacmid的提取

在培养48h后，将lb平板置于4℃冰箱中2-3h，使菌落充分变蓝，然后挑取平板上较大的散在白色单菌落，重新划线接种于新的蓝白斑筛选平板上，进行第二次蓝白斑筛选，37℃培养过夜，第二天挑取单个白色单菌落接种于含10ug/ml的四环素、50ug/ml的卡那霉素和7ug/ml的庆大霉素的液体lb培养基中，37℃250rpm振荡培养12h以上，按bac-to-bac杆状病毒表达系统说明书中改良的碱裂解法提取重组载体骨架bacmid。

1.2.4.3重组bacmid的pcr鉴定

在用pcr来鉴定重组bacmid时，以提取的bacmid质粒作为模板，m13通用引物和cap基因的上下游引物对各个重组bacmid进行pcr鉴定。pcr反应体系为：上、下游引物各1μl，2×mix12.5μl；稀释质粒的模板1.0μl；taqdna聚合酶0.2μl；灭菌双蒸水补至25μl。pcr循环参数参照bac-to-bac表达系统说明书进行：94℃4min，94℃45s，55℃45s，72℃4min，30次循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取5μlpcr产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确的重组bacmid用于后续转染实验。

用鉴定正确的重组载体质粒转化感受态dh10bac，经2轮蓝白斑筛选后，挑取白色菌落进行培养，提取质粒用通用引物m13以及基因上下游引物进行鉴定，扩增出特定大小的条带，与预期结果一致(图4)。

1.2.5重组杆状病毒的获得与扩增

1.2.5.1重组bacmid转染sf9昆虫细胞

重组bacmid的转染按照lipofectamine2000的使用说明来操作并稍加修改。

①转染前1天将2×105sf9细胞接种于24孔培养板，并加入500μl不含抗生素的完全培养基，使细胞分布均匀，于27℃过夜培养，以保证转染时细胞汇合达90～95％。

②分别将2μllipofectamine2000和6μlbacmid稀释于50μl无血清无抗生素的grace’s培养液中并轻轻浑匀，室温孵育5min，将它们轻轻混合均匀，室温孵育20min。

③吸去24孔板中的培养基，将复合物(总体积100μl)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。

④将细胞放入27℃培养箱孵育6h后，吸去转染混合液，直接加入2ml含10％fbs的grace’s完全培养基，27℃继续培养至sf9细胞出现明显病变。

1.2.5.2重组杆状病毒的获得与扩增

每天观察转染细胞的病变情况，在转染后5天可以看到sf9细胞出现明显病变，收获出现严重病变的sf9细胞和培养上清。500g离心5min收集上清，4℃避光保存，即为f1代重组病毒。细胞沉淀用于鉴定蛋白的表达。

将第一代重组病毒按1:10的体积比感染处于对数生长期的sf9细胞，27℃培养3天至细胞出现明显病变时，500g离心5min，去除细胞和大的细胞碎片，收集上清4℃避光保存，即为第二代病毒，用同样的方法获得第三代病毒。

用鉴定正确的重组bacmid转染sf9细胞，27℃培养4d，可以见到明显的细胞病变，主要表现为细胞变大变圆，与正常的sf9细胞差别明显(图5)。

1.2.6重组cap蛋白在sf9细胞中的表达与westernblot鉴定

用重组杆状病毒感染sf21细胞72h后，收集蛋白样品用于sds-page分析和westernblot鉴定。在图6a中可以看到，rbcapo、rbcapom、rbcapok和rbcapokm四个泳道可以观察到明显的目的蛋白条带，而wb结果表明，7种重组cap蛋白能与pcv2cap蛋白单克隆抗体发生特异性反应，而正常sf21细胞则没有反应(图7)。该结果表明，重组cap蛋白在杆状病毒系统中得到了高效表达，表达产物能被特异性抗体识别(pcv2cap蛋白单克隆抗体5h7)。1.2.7间接免疫荧光鉴定(ifa)

将各个重组毒接种于96孔板中的单层sf9细胞，同时设正常sf9细胞作为阴性对照。27℃培养2天，细胞出现明显病变前，弃培养上清液，pbs洗涤细胞后用预冷的80％丙酮固定，4℃作用10min。pbs洗涤2次，每次5min，加入1:500稀释的pcv2单克隆抗体，37℃孵育1h。pbs洗3次，每次5min，再加入1:200稀释的羊抗鼠igg-fitc，37℃孵育45min，pbs洗3次，于荧光显微镜下观察，记录结果。

重组杆状病毒感染sf9细胞48h后，用pcv2单克隆抗体3e5对其进行间接免疫荧光鉴定，观察结果表明，rbcapo、rbcapom、rbcapok和rbcapokm感染的细胞内可见亮绿色的荧光(图8中a、b、c、d中白色部分)，而正常的sf9细胞为阴性，没有特异性荧光(图8中e)。这进一步证明了pcv2cap蛋白在sf9细胞中得到了表达。

1.2.8病毒样颗粒(vlp)的形成

将获得的重组杆状病毒接种于sf9细胞，大量表达重组蛋白。接种后于27℃温箱培养96h，当细胞出现显著病变时，500g离心5min收集细胞。加适量pbs重悬细胞沉淀，于冰上超声裂解10min，4℃12000rpm离心15min收获上清。亲和层析法纯化上清中的cap蛋白。将收获的蛋白经磷钨酸负染后透射电镜观察，检测是否有病毒样颗粒的形成。

之前已有文献报道杆状病毒表达的pcv2cap蛋白能形成病毒样颗粒(vlp)，本研究对表达的重组蛋白(rbcapokm)进行亲和层系，然后进行透射电镜观察，可以见到病毒样颗粒的形成，大小约20nm(图9)。

1.2.9双抗体夹心elisa的测定

将获得的重组杆状病毒接种于sf9细胞，接种后于27℃温箱培养96h，当细胞出现显著病变时，500g离心5min收集细胞。加适量200μlpbs重悬细胞沉淀，再反复冻融3次，4℃12000rpm离心15min收获上清，用双抗体夹心elisa分析测定其抗原效价。

由表1中数据可知，重组杆状病毒rbcapokm在昆虫细胞中表达的重组cap蛋白具有较好的抗原性。

表1夹心elisa检测表达的重组cap蛋白

实施例2：不同重组蛋白小鼠免疫特性

2.1主要材料与实验动物

表达cap蛋白的重组杆状病毒rbcapo、rbcapom、rbcapok和rbcapokm均由本实验室构建并保存。highfive细胞(美国atcc)由本实验室保存；pcv2单克隆抗体3e5由本实验室制备并保存。isa15a佐剂为法国seppic佐剂。

5周龄清洁级icr小鼠70只，经间接elisa检测pcv2抗体阴性。

2.2疫苗制备

将相同滴度的重组杆状病毒(10^5.0tcid50/ml)接种highfive昆虫细胞，在感染后96小时收取发生病变的细胞。首先吸弃细胞培养上清，每瓶细胞(75cm2)加入1ml0.01mol/lph7.2pbs溶液，吹下细胞，再对细胞悬液进行超声波裂解，得到含有pcv2cap蛋白的细胞裂解液。用夹心elisa方法测定其cap蛋白含量，调整目的蛋白浓度为30μg/ml。将目的蛋白抗原和isa15a佐剂按4:1比例混合，以300r/min搅拌，充分混合10分钟，配置4种疫苗capo、capom、capok和capokm，保存于4℃备用。

2.3小鼠免疫试验

将60只清洁级小鼠随机分为7组，第1-4组为capo、capom、capok和capokm疫苗接种组，第5组为pbs对照组。小鼠适应2天后进行首免，免疫方法为背部皮下多点注射，疫苗免疫剂量是200μl。首免后14d进行加强免疫，加强免疫的剂量和方法与之前相同。首免后第28、42d，每组随机取5只小鼠眼球采血，分离血清，分别测定elisa抗体和中和抗体滴度；无菌摘取小鼠脾脏，加灭菌pbs研磨后分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应。

2.4elisa抗体检测

包被抗原为本实验室制备纯化保存的capc，此蛋白由大肠杆菌表达。用ph9.6碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5ug/ml，包被酶标板，100μl/孔，37℃作用2h后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μl的0.15％bsa封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用pbs倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标羊抗鼠igg(1:5000倍稀释)，100μl/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液tmb显色，最后用2mm的h2so4终止反应。结果判定：待检血清od450值/阴性血清od450值≥2.1为阳性。

结果见图10。capo、capom、capok和capokm疫苗首次免疫14天即可诱导产生pcv2抗体，首免后28天和42天，四个疫苗免疫组elisa抗体水平无明显差异(p>0.05)。同时，阴性对照组则未检测到pcv2特异性抗体。

2.5中和抗体检测

待检血清于56℃水浴30min进行灭活，12000rpm离心10min除菌后，吸出上清到灭菌的ep管中。再将处理好的血清用维持液进行倍比稀释，依次是1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，……与此同时，将增殖的pcv2用维持液稀释到200tcid50/0.1ml，然后与不同稀释度的血清等体积混合，37℃水浴作用1h。弃掉长有pk15细胞的96孔板中的营养液，用纯dmem洗涤细胞一遍，再将水浴作用后的血清病毒混合物加到孔中，每个血清稀释度设置3个重复，100μl每孔，37℃培养72h。同时设置阴性血清对照、阴性血清病毒对照和空白对照。72h后用间接免疫荧光法(ifa)测定血清中和抗体效价，以能够抑制50％pcv2感染的血清最大稀释度作为待检血清的中和抗体效价。

结果如图11。首免后28和42天，capok和capokm疫苗免疫组pcv2中和抗体水平明显高于capo和capom疫苗免疫组(p<0.05)。同时，阴性对照组则未检测到pcv2中和抗体。

2.6淋巴细胞增殖试验

将小鼠眼球采血，用颈椎脱臼法处死小鼠。无菌条件下，取出脾脏，并用剪子剪去与其相连的结缔组织和脂肪组织。将分离获得的脾脏放入200目的虑网膜中，加入3mlpbs后无菌研磨，将脾细胞悬液转移到含有淋巴细胞分离液的离心管中，2000rpm离心15min。用吸管吸取中间层的灰白细胞，放入另一只试管中，加红细胞裂解液5ml，混匀脾细胞，静置5min，待红细胞完全破碎，2000rpm离心10min，弃上清去除红细胞。加入5ml纯1640再次洗涤细胞沉淀，2000rpm离心10min，弃掉上清，用10％的1640稀释到5×10⁶个/ml，加入96孔板，100μl每孔。将pcv2作为刺激抗原，cona作为对照，终浓度10μg/ml，37℃下培养72h，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，每组3个重复，37℃下继续培养6h。弃掉96孔中的培养液，加入dmso，100μl每孔，振荡融解紫色结晶，测定波长570nm的od值，计算刺激指数(si＝刺激孔的od值/未刺激孔的od值)。

结果如图12。首免后28-42天，capo和capom疫苗免疫组均没有检测到pcv2特异性的淋巴细胞增殖；首免后28-42天，capok和capokm疫苗免疫组si值明显高于pbs组(p<0.05)，表明capok和capokm疫苗可诱导小鼠产生pcv2特异性的细胞免疫应答反应。

重组杆状病毒rbcapo、rbcapom、rbcapok和rbcapokm表达的cap蛋白亚单位疫苗，四种疫苗均可诱导小鼠产生pcv2elisa抗体和中和抗体，但capok和capokm疫苗中和抗体和细胞免疫水平明显高于capo和capom疫苗，capok和capokm重组蛋白疫苗体液免疫和细胞免疫水平相似，具有重要应用前景。

应用spss软件对实验数据进行统计分析，并比较各组数值的差异，其中p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。

实施例3仔猪免疫保护试验

筛选21头30日龄断奶仔猪，经检测pcv2和prrsv抗原抗体均为阴性，随机分为4组，每组5～6只，各组隔离饲养。第一组接种pcv2亚单位疫苗(rbcapkm)，第二组接种pcv2灭活苗，第三组不接种作为攻毒对照组，第四组不接种作为空白对照组。一免后21天进行加强免疫，免疫后注意观察免疫组仔猪是否有不良反应。二免后14天对免疫组和攻毒组仔猪进行攻毒，每头仔猪滴鼻攻毒3ml(pcv2sh，10⁵tcid50/ml)并刺激，具体方法是，攻毒后第4天和7天注射血蓝蛋白，2ml每头(1mg/ml)，同时腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml每头，攻毒第14天和21天腹腔注射巯基乙酸培养基，10ml每头。攻毒后每天上午测量所有仔猪的体温，并观察仔猪的临床表现。在一免后21天和35天采血，分离血清用于elisa抗体和中和抗体检测。攻毒后7、14、21、28天采血，分离血清用于病毒血症检测。二免后14天和攻毒后28天分别称量每头猪体重，计算相对日增重(rdwg)。攻毒后28天剖杀所有仔猪，观察每头猪肺脏和淋巴结等脏器病变情况，取淋巴结、肺脏于4％多聚甲醛中固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。

2.5.1elisa抗体检测

检测一免和二免猪血清中的pcv2特异性elisa抗体，二抗为spa-hrp，用封闭液稀释10000倍后使用。

根据小鼠免疫试验的结果，确定以cph免疫仔猪，并评价比较其与pcv2灭活苗的免疫保护效果。用间接elisa测定pcv2特异性抗体，结果以血清稀释100倍时的s/p值表示，具体结果见图13。首次免疫3周后，两个免疫组都有不同程度的pcv2抗体产生，其中灭活苗免疫组的抗体水平显著高于cph组；首次免疫5周后，两个免疫组的抗体水平继续升高，差异任然存在。

2.5.2中和抗体检测

为了鉴定疫苗的免疫效果，测定二免后血清中和抗体效价。

此外，还测定了首次免疫5周后的血清中和抗体效价，结果如图14所示，cph组平均血清中和抗体效价达到了1:102，而pcv2灭活苗组也达到了1:90，两者没有显著性差异。上述结果表明两种疫苗都能诱导机体产生一定水平的中和抗体，对机体产生保护作用。

2.5.3攻毒后仔猪临床表现及体温变化

首次免疫5周后，对两个免疫组和攻毒对照组进行攻毒，每天测量体温，连续三周，统计结果见图15。在相同时间点，各个组的体温没有明显的差异，也没有出现发热的现象(大于40℃)。但是从临床表现来看，攻毒组有两头猪出现消瘦、被毛粗乱和精神沉郁的现象，其中一头在攻毒后26天死亡。两个免疫组和空白对照组则表现正常，没有明显的临床症状。

2.5.4攻毒后仔猪体重的变化

攻毒前和剖杀前，称量每一头猪的体重，计算相对日增重，以此评价疫苗的免疫保护效果。具体结果见图16，免疫组的相对日增重分别达到了0.0137和0.0135，而攻毒组只有0.009,说明在攻毒之后两种疫苗都对仔猪产生了免疫保护作用，促进了仔猪的生长。

2.5.5病理变化观察

试验结束后，剖杀所有猪，观察淋巴结和肺脏的病变情况。空白对照组和cph组的肺脏正常，攻毒对照组的肺脏出现间质增宽、出血和实变的现象，ipcv2组也有轻微的症状。除了攻毒组的淋巴结出现水肿外，免疫组和空白组都正常。

完成组织切片后，进行病理学观察，结果如图17所示。与免疫组相比，攻毒组出现了明显的间质性肺炎的症状，主要表现为肺泡壁增厚、间质增宽和肺泡缩小(图17中a3)，cph组和ipcv2组则较为正常或者只有轻微的症状。攻毒组淋巴结的淋巴滤泡边界模糊，淋巴细胞缺失(图17中b3)，免疫组则基本正常。

上述病理观察结果表明，cph疫苗和灭活苗类似，能够减轻由pcv2感染导致的肺脏和淋巴结病变。

2.2.6免疫组化

采用pcv2单克隆抗体对淋巴结组织进行免疫组化检测，检测结果见图18。攻毒组淋巴组织中存在较多的棕黄色细胞，而免疫组则没有特异性的着色细胞，表明cph和ipcv2能够在很大程度上减轻pcv2在淋巴结中的增殖，从而对免疫猪提供保护作用。

本研究用杆状病毒表达pcv2cap蛋白，经鉴定可以形成vlps，以此制备疫苗并免疫小鼠和仔猪，评价其应用前景。小鼠首免2周后即可检测到pcv2特异的elisa抗体，首免4周后抗体达到了较高水平，首免6周后抗体水平继续攀升。中和抗体的产生规律与elisa抗体类似，在首免4周和6周后，均能检测到高水平的中和抗体的存在。这表明制备的疫苗具有良好的抗原性，能够刺激小鼠产生高水平的体液免疫应答。在细胞免疫应答方面，结果与体液免疫有相同的趋势，与对照组存在差异。

仔猪免疫保护实验进一步验证了该亚单位疫苗的效果。首免3周后即可检测到elisa抗体，2免2周后抗体水平进一步升高，与此同时，中和抗体水平达到了1:102，高于ipcv2组的1:90。攻毒实验结果表明，亚单位疫苗和灭活苗都能为攻毒仔猪提供免疫保护。

综上所述，本研究经过pcv2cap蛋白抗原分子设计，成功构建了高效分泌表达的重组杆状病毒。制备的pcv2cap蛋白亚单位疫苗可以诱导机体产生pcv2特异性的elisa抗体和中和抗体，对pcv2攻毒产生保护作用，比传统的灭活苗更加优异，显示出良好的开发应用前景，从而为国内pcv2新型疫苗的研究奠定了基础。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>江苏南农高科技股份有限公司

<120>人工改造的pcv2cap蛋白、重组病毒及其应用

<160>16

<210>1

<211>723

<212>dna

<213>猪圆环病毒（porcinecircovirus）

<400>1

ggatccacgatgatgacctacccccgccgccgcttccgccgccgccgccaccgcccccgc60

agccacctgggccagatcctgcgccgccgcccctggctggtgcacccccgccaccgctac120

cgctggcgccgcaagaacggcatcttcaacacccgcctgagccgcaccatcggctacacc180

gtgaagaagaccaccgtgcgcacccccagctggaacgtggacatgatgcgcttcaacatc240

aacgacttcctgccccccggcggcggcagcaaccccctgaccgtgcccttcgagtactac300

cgcatccgcaaggtgaaggtggagttctggccctgcagccccatcacccagggcgaccgc360

ggcgtgggcagcaccgccgtgatcctggacgacaacttcgtgaccaaggccaacgccctg420

acctacgacccctacgtgaactacagcagccgccacaccatcacccagcccttcagctac480

cacagccgctacttcacccccaagcccgtgctggaccgcaccatcgactacttgcagccc540

aacaacaagcgcaaccagctgtggctgcgcctgcagaccaccggcaacgtggaccacgtg600

ggcctgggcaccgccttcgagaacagcatctacgaccaggactacaacatccgcatcacc660

atgtacgtgcagttccgcgagttcaacctgaaggacccccccctgaaccccaagtgactc720

gag723

<210>2

<211>723

<212>dna

<213>prt

<400>2

ctcgagatcacaatgacctacccccgccgccgcttccgccgccgccgccaccgcccccgc60