一种抗IL‑13Rα2和CD3双特异抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对il-13rα2和cd3的双特异性抗体的构建和制备方法，以及该抗体在疾病中的应用。

背景技术：

单克隆抗体广泛应用于癌症、炎症和其它疾病的治疗，由于这些抗体所针对的都是单一的靶标，很多患者不能充分响应单一的疗法，时常出现抗药性。双特异性抗体能够同时识别两个不同的抗原或抗原表位，可以作为一种媒介重新定向免疫效应细胞，如自然杀伤细胞和t细胞，加强对肿瘤细胞的杀伤功能。此外，双特异性抗体还可以定位于同一个细胞的两个不同的抗原，导致细胞信号的改变，包括癌症扩散信号或炎症信号。经过长时间的研究和发展，出现了多种形式的双特异性抗体，如双特异性微抗体、双链抗体、单链双价抗体和多价双特异性抗体等。这些双特异性抗体基本上分为两大类:含有fc的和不含有fc的。前者具有较好的溶解性、稳定性和半衰期，而fc介导的抗体依赖的细胞毒性作用(adcc)和补体依赖性细胞溶解效应(cdc)可以带来一些治疗所需的附加效应。相比之下，缺乏fc的双特异性抗体完全依赖其抗原结合能力发挥其治疗作用；另外fc蛋白可以延长药物蛋白（或多肽)在体内的半衰期，从而延长活性分子在体内的作用时间。

胶质瘤是颅内最常见颅内原发肿瘤，恶性程度高，治疗棘手，具有高致残率、高复发率、高死亡率特点。目前，胶质瘤缺乏根治手段，手术切除仍是治疗胶质母细胞瘤的首选方案，但由于胶质母细胞瘤呈浸润性生长，常没有边界，手术仍无法彻底切除，复发率100%。因此，胶质瘤的治疗常采用手术+放疗+化疗，以及生物治疗的综合治疗方案。尽管如此，高级别胶质瘤患者的平均生存期也仅为14.6月，患者的五年生存率小于5%；而不经过治疗的患者的平均生存期只有4.5个月，只有三分之一的患者生存期超过1年，五年生存率几乎为0，在所有癌症中排首位。因此，找寻并研发具有临床效果的药物成为胶质瘤的重要研究方向，也是急不可待的任务，目前研究的方向包括各种疫苗、抗体和新型t细胞治疗等。

il-13rα2最先是由caput等人在人caki-1肾癌细胞系中发现的，其编码基因主要定位于xq24，编码由380个氨基酸残基组成的跨膜受体蛋白，包括341个氨基酸残基组成的胞外区、一个仅仅只有17个氨基酸残基的胞内区和22个氨基酸残基组成的跨膜区。现有的研究证实在il-13rα2脑胶质瘤中特异性高表达，且胶质瘤的级别越高，其表达的强度越大，而在正常脑组织中不表达或极低表达，因此可用做胶质瘤靶向治疗级佳的靶点。

免疫细胞表面抗原分化簇3(cd3):cd3分子是t细胞膜上的重要分化抗原，是成熟t细胞的特征性标志，由6条肽链组成，以非共价键与t细胞抗原受体(tcr)组成tcr-cd3复合体，不仅参与tcr-cd3复合体的胞浆内组装，而且通过各多肽链胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，itam)传递抗原刺激信号。cd3分子的主要功能为：稳定tcr结构，传递t细胞活化信号，当tcr特异性识别并结合抗原后，cd3参与将信号转导到t细胞胞浆内，作为诱导t细胞活化的第一信号，在t细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。

双特异性抗体具有良好的效果和前景，能够同时结合肿瘤细胞和免疫细胞上的特异性抗原-抗免疫活性细胞cd16或cd3的部分，具有激活nk细胞或t细胞作用，而抗肿瘤的特异性抗原部分可以结合肿瘤细胞，将免疫细胞靶向到肿瘤细胞，提高局部nk细胞或t细胞浓度，从而使免疫效应细胞对肿瘤细胞起到特异性杀伤作用。现有技术中，还没有成功上市的il-13rα2和cd3双特异性抗体药物产品，该项技术有待研究。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明中提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体在抗il-13rα2的c-端增加了抗cd3的scfv序列，这种双特异抗体保留了抗il-13rα2抗体完整分子结构，同时增加了结合cd3抗原的能力，这样既保持了原有il-13rα2抗体在体内生物学活性，同时通过特异性识别两种不同的抗原，靶向免疫效应细胞到肿瘤细胞，从而增加了免疫效应细胞杀伤肿瘤细胞的效果。

本发明提供了抗il-13rα2和抗cd3双特异抗体及其应用。

包含(a)完整的单克隆抗体，（b)单链抗体scfv和（c)连接子;所述(a)与il-13rα2抗原特异性结合并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成;所述(b)与免疫细胞抗原cd3特异性结合，所述(b)为两条单链抗体scfv;所述(b)为两条单链抗体scfv;所述(b)的两条单链抗体scfv分别通过所述(c)连接子linker与所述(a)的两条重链的c末端连接。

其中，所述双特异抗体中所述(c)连接子linker的氨基酸序列为(ggggx)n，x包含ser或ala，x优选ser；n为1-4的自然数n优选3。所述双特异性抗体(a)完整的单克隆抗体是由两条轻链和两条重链组成，每条重链和轻链之间通过二硫键连接，两条重链之间通过铰链区的二硫键连接。所述重链和轻链的可变区特异性结合肿瘤细胞表面il-13rα2抗原。

其中，所述(a)完整的单克隆抗体的重链恒定区为igg1、igg2、igg3或igg4中的一种，优选igg2。所述(a)完整的单克隆抗体的重链可变区中重链cdr1包含seqidno1、重链cdr2包含seqidno2重链cdr3包含seqidno3；所述(a)完整的单克隆抗体的轻链可变区cdr1包含seqidno4、重链cdr2包含seqidno5重链cdr3包含seqidno6。所述(b)单链抗体scfv的重链可变区的氨基酸序列为seqidno8,所述(b)单链抗体scfv的轻链可变区的氨基酸序列为seqidno9。所述(b)两条单链抗体scfv的氨基酸序列均为seqidno7。每个(b)单链抗体scfv是由重链可变区、（c)连接子linker和轻链可变区组成，所述重链可变区和轻链可变区特异性结合免疫细胞表面cd3抗原；所述（c)连接子linker的氨基酸序列为(ggggs)n，n为1-4的自然数，优选为(ggggs)3。

其中，构建双特异抗体的表达载体，其中所述双特异抗体可以构建到一个载体中，或者分别构建到两个不同的载体上。通过基因工程方法将构建好的载体转染到宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如293t细胞、nso细胞或其他哺乳细胞，优选为293t细胞。通过常规的免疫球蛋白方法，包含蛋白质a亲和层析和离子交换、疏水层析或分子筛方法获得所述双特异性抗体。所述双特异性抗体用于il-13rα2高表达或非正常表达的胶质瘤的治疗及其他il-13rα2过表达引起疾病的治疗。其中，所述完整的单克隆抗体为全长抗体。

本发明的双特异性抗体是采用四价抗体的形式，这种形式的四价抗体完整的保留了结合肿瘤抗原的抗体序列，具有较高的亲和力。同时四价双特异抗体可以更好的连接肿瘤细胞和效应细胞，从而更有利于发挥双特异抗体的生物学功能。相对于现在常用的bite双特异抗体形式，本发明中的分子还包括了fc片段；fc片段的存在可以延长药物分子在体内的半衰期，从而能够使药物分子更好的发挥作用，降低病人用药频率，减轻病人的痛苦。本发明用于高表达或非正常表达il-13rα2胶质瘤的治疗，以及其他il-13rα2过表达引起疾病的治疗。

附图说明

图1示例性示出了双特异抗体的分子示意图；

图2示例性示出了elisa法检测双特异分子与抗原的结合能力；

图3示例性示出了双特异抗体与u251细胞的结合；

图4示例性示出了双特异抗体介导的pbmc对u251的杀伤效果。

具体实施方式

下面给出实施例以对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均包括在本发明的范围内。

本发明中所用的抗il-13rα2抗体重链cdr1包含seqidno1、重链cdr2包含seqidno2重链cdr3包含seqidno3；所述(a)完整的单克隆抗体的轻链可变区cdr1包含seqidno4、重链cdr2包含seqidno5重链cdr3包含seqidno6。

seqidno1:hcdr1

srngms

seqidno2:hcdr2

tvssggsyiyyadsvkg

seqidno3:hcdr3

qgttalatrffdv

seqidno4:lcdr1

kasqdvgtava

seqidno5:lcdr2

sasyrst

seqidno6:lcdr3

qhhysapwt

所述(b)两条单链抗体scfv的氨基酸序列均为seqidno7;其中，seqidno7(抗cd3单链抗体氨基酸序列）:diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssggggsggggsggggsdiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk。

实施例1

双特异抗体分子的表达载体的构建

选择plenticmvgfppuro（addgene#17448）作为表达载体去克隆和表达抗il-13rα2的轻链基因和抗il-13rα2重链-cd3的scfv融合基因，该载体包括筛选标记puromycin，含有两个cmv启动子及相应的结构单元。设计轻链及融合基因的引物并引入kozak序列、信号肽及相应的酶切位点，由擎科生物有限公司进行合成。以合成轻链重链质粒为模板，pcr扩增出相应的条带并与载体进行同源重组获得目的基因质粒。采用3质粒系统进行病毒包装，3质粒系统分别表达病毒载体包装所需的pspa和pmdg，及工程稳定的单链抗体构成的人工嵌合抗原受体。将3质粒按比例进行瞬时转染。总质量为7μg。将上述质粒加入至700μlopti-mem中混匀静止5分钟，随后加入21μl1μg/μl的pei，混匀后放置30min，将上述溶液加入至铺有293t细胞的培养皿中，轻轻混匀，置于37℃、5%co2培养箱中培养12h，换液后加入含10%fbs的dmem液体培养基10ml，继续培养48小时。收集转染后48h、72h后的细胞上清液，用0.45μm滤器过滤上清液，加入40%的peg8000病毒浓缩液（peg8000体积：上清液体积=1:3）混匀，4℃冰箱放置12小时后4000转/分钟离心30分钟。用300uldmem无血清培养基重悬，分装后-80℃保存。

实施例2

双特异抗体分子的表达与纯化

人胚肾细胞（hek293es悬浮细胞）在freestyle293expressionmedium(gibco，12338-026)中培养，细胞每隔一到两天传代一次，传代后细胞起始密度维持在0.2~0.6×10⁶/ml，细胞培养体积为摇瓶容积的15~35%，细胞培养瓶放在摇床（摇床转速：135rpm，温度：37°c，co2:5%)中培养。转染前一天，将处于对数生长期，生长状态良好的hek293es细胞，传代到细胞密度为0.5×10⁶/ml，放摇床(135rpm，37℃，5%co2)培养过夜，待第二天进行病毒感染。

b)四价双特异抗体的纯化

表达上清用0.22um滤膜过滤，利用亲和层析柱从表达上清中获得带有fc结构域的抗体。平衡缓冲液和洗脱缓冲液分别为50mmtris-hclo.15mnaclph7.0和0.1m柠檬酸-柠檬酸钠ph3.0。通过阳离子交换层析获得目标双特异抗体，阳离子交换柱为hitrapspff，通过平衡缓冲20mmpbph6.3平衡sp层析柱，用洗脱缓冲液20mmpb+lmnacl(ph6.3)进行洗脱，最后用pbs缓冲液进行换液浓缩。将所得抗体通过elisa检测其与il-13rα2、cd3结合能力，结果如图2所示。

实施例3

双特异抗体分子与过表达il-13rα2或cd3细胞结合情况：

本发明采用过表达il-13rα2的肿瘤细胞系(u251)来检测不同的双特异抗体与细胞表面il-13rα2的结合情况，采用相对应的抗体做阳性对照，用人的igg(hlgg)作为同型对照。用0.25%胰酶消化、离心收集u251细胞。同时稀释各种抗体，最高浓度为1um，3倍梯度稀释。将收集的细胞用pbs+1%bsa洗三遍，再加ros+1%bsa重悬细胞，然后铺细胞于96孔板中，每孔1×10⁶/ml个细胞，加入100ul稀释好的双特异性抗体，室温孵育1小时;离心去上清，用pbs洗细胞三遍，再用稀释好的alexa488标记的抗人igg-fc抗体重悬细胞，室温避光孵育1小时，pbs洗三遍，再用100ulpbs重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。结果用graphpadprism分析。结果显示（图3)，每种双特异抗体与u251的结合能力与其对应的抗体具有可比性，而hlgg与u251的结合力很弱。证明双特异抗体较好的保持了其母本抗体的特异结合细胞表面il-13rα2特异结合的活性。

实施例4

双特异抗体分子介导的pbmc对效应细胞的杀伤作用

u251或293t细胞pkh26标记u251是一种过表达il-13rα2的胶质瘤细胞株；而u251则不表达il-13rα2。本实验采用u251作为实验细胞株;而293t作为阴性对照。取2×10⁶个细胞于1.5ml离心管中1500rpm离心5min，弃完全培养基，用无血清的培养基分别清洗细胞两次；用pkh26试剂盒中的diluentc溶液重悬细胞，然后加入等体积的2xpkh26染料液(配制比例：0.4μ1染料原液溶于100μι的diluent，混匀后室温放置1min。反应结束后，立即加入与管中溶液等体积的0.5%bsa-pbs溶液终止反应，再加入1ml相应的完全培养基稀释重悬细胞，1500rpm离心5min收集细胞沉淀。用完全培养基重悬后与细胞培养瓶中培养待用。

pbmc分离

在50ml管中加入20ml单个核细胞分离液；用全血稀释液将采集到的血液按1:1进行稀释处理，混匀后沿康宁管内壁匀速缓慢的铺至分离液上层，每管内加入稀释后全血体积为20ml;待各管加液完毕后放入提前预冷至22°c的离心机内，600g水平离心15min(加减速设置为1);离心完成后取出离心管，用移液器小心吸取置于分离液和血清间呈圆弧状分布的细胞层一单个核细胞(pbmc)，置于新的50ml管中；按照1:5比例在细胞液中加入细胞洗涤液，充分混匀后离心，弃上清，再重复洗涤一次，收集细胞沉淀，用rpmi-1640培养基重悬，培养于细胞瓶中待用。

cd3+t细胞磁珠分选

pbs(ph7.2,含0.5%bsa，2mmedta)，过滤除菌，同时避免产生气泡。离心去血小板(20度，200g，10-15分钟），然后30μm滤膜去除细胞团块。收集pbmc细胞：200g离心10分钟，弃上清。2×10⁷细胞重悬于60μ1buffer+20ylfcrblockingreagent中。加入20ul磁珠，混匀，2-8℃孵育15分钟；加入1-2mlbuffer，离心10分钟，弃尽上清；500μ1重悬。将分选柱置于分选架上，500μ1润洗;加入细胞悬液，收集未结合细胞；柱体顶端液体流尽后，500μ1洗三次；将分选柱从分选架上取下，置于收集管中，1ml快速冲洗，收集细胞，计数并观察活细胞比例。

双特异抗体效应功能检测

按照终浓度1um起，1:3倍比稀释，10梯度，2复孔；同时设立2个无药物对照孔，用培养基补足体积，将标记后的u251或293t细胞(2×10⁴个/孔/50μ1)与cd3⁺t细胞(2×10⁵个/孔/50μ1)，按照所需用量混匀后分至v-bottom96孔板各孔，同时设立以下三个流式对照孔:①无标记的293t细胞(2×10⁴个/孔)②pkh26标记后的细胞(2×10⁴个/孔）；③cd3⁺t细胞(2×10⁵个/孔）。培养18小时，孵育结束后按照1:50000的比例加入t0-pr03染料，37℃避光孵育1omin；同时设立一个流式对照④t0-pr03标记后的细胞。3000rpm离心5min后弃部分培养基上清，用0.5%bsa-pbs溶液重悬，流式检测。

计算公式：

细胞死亡率％=(1-pkh26+t0pr03-细胞数目（药物作用组）/pkh26+t0pr03-细胞数目（无药物作用组)）×100

结果分析

双特异抗体分子介导的pbmc对过表达il-13rα2的u251效应细胞有非常好的杀伤作用；而他们对应的抗体和hlgg则杀伤效果很弱。同时所有的双特异抗体对不表达il-13rα2的293t细胞杀伤效果都非常弱，且与同型对照hlgg类似（图4)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。