全人源抗PDL‑1单链抗体B129及其应用的制作方法

本发明属基因工程，涉及全人源抗pdl-1单链抗体b129的筛选、鉴定和原核表达，及其在靶向药物制备中的应用。

背景技术：

噬菌体展示抗体技术可以制备全人源的抗体，是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组dna中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使异源分子展示于噬菌体表面。主要特点是将特定的分子的基因型和表达型同时出现在一个噬菌体颗粒内，通过dna测序可以获得特定展示蛋白的序列信息。

噬菌体抗体库技术模拟了人类b细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链可变区基因连接起来形成单链抗体(single-chainvariablefragment,scfv)，插入噬菌体载体上，使单链抗体scfv展示在噬菌体表面，再用特定的抗原筛选出特异性的噬菌体抗体，并用大肠杆菌表达可以表达大量单链抗体。

噬菌体可以表达抗体结合片段(fragmentantigenbinding,fab)、单链抗体(scfv)、双链抗体(diabody)和双特异性抗体(bispecificscfv,bsab)等。其中单链抗体scfv是目前报道最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区fv段组成。fv由重链可变区vh和轻链可变区vl通过连接肽(linker)连接构成scfv。所加的linker很重要，必须不影响fv的构象，目前最常用的是由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的序列(ggggs)3。将scfv基因克隆在丝状噬菌体载体piii基因先导序列和piii基因之间，以融合蛋白的形式被导入细菌膜间隙，并组装成scfv，在加入辅助噬菌体m13k07后，scfv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。pcantab-5e载体的特点是，在scfv基因后面含有一段编码tag尾肽(e-tag)的序列，在e-tag后面有一个琥珀(amber)终止密码子，位于scfv基因与piii基因之间，在抑制性细菌tg1中，这种琥珀密码子只有20％有效，所以在蛋白翻译过程中可以被通读而形成scfv-piii融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如hb2151，此终止子被识别，同时scfv基因在piii基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在长时间培养后释放于培养液中，形成可溶性表达。

单链抗体scfv具有结构简单、相对分子量小、穿透性强、免疫源性低等优点，是一种理想的载体。构建全人源抗体库目的是寻找一种能与特定白血病相关抗原(如pdl-1等)特异性结合的单链抗体scfv，这类特异识别肿瘤细胞的单链抗体本身或者其可变区序列，经过基因工程改造成其它的抗体形式后，可以作为抗肿瘤药物进行开发；其次可以作为药物载体，如偶联药物、毒素或放射性同位素，进行肿瘤靶向治疗。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种基因重组的全人源抗pdl-1单链抗体b129。是从已构建的全人源白血病噬菌体单链抗体库中筛选出能够特异结合于胞外区pdl-1蛋白的单链抗体。

本发明提供的一种全人源抗pdl-1单链抗体b129，具有结构简单、相对分子量32.6kda、穿透性强、免疫源性低等优点，是一种理想的药物运输载体。

所述全人源抗pdl-1单链抗体b129的dna序列如seqidno.1所示：

atggcccaggtccagcttgtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgataccagatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcaccgcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgaggatagcatcaaatgcctttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggtggtggaggatctggcggcggcggctccggtggtggtggatctgacatccggatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatccactgcaagtctagccagagtcctttctacagctccaataacaagaactacttagcttggtaccaacagaagccgggacagcctcctaaactcctcatttactgggcaacttcccgggaattcggggtccctgcccgattcagtggcgacgggtctgggacagatttcactctcaccatcgacagcctgcaggctgaagatgtgggggtttatttctgtcagcaatatttgagtctcccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa。

所述全人源抗pdl-1单链抗体b129的氨基酸序列如seqidno.2所示

maqvqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftsywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycariasnafdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggsdirmtqspdslavslgeratihckssqspfyssnnknylawyqqkpgqppklliywatsrefgvparfsgdgsgtdftltidslqaedvgvyfcqqylslpitfgqgtrleik。

该全人源抗pdl-1单链抗体b129含有完整的抗体重链可变区vh和轻链可变区vl，其重链可变区vhcdr1的氨基酸序列为：gysftsyw，重链可变区vhcdr2的氨基酸序列为:iypgdsdt，重链可变区vhcdr3的氨基酸序列为：ariasnafdi；其轻链可变区vlcdr1的氨基酸序列为：qspfyssnnkny，轻链可变区vlcdr2的氨基酸序列为：wat，轻链可变区vlcdr3的氨基酸序列为：qqylslpit。

本发明的另一个目的是提供所述的全人源抗pdl-1单链抗体b129本身及其可变区序列在制备白血病靶向治疗药物和药物载体中的应用。

本发明的优点是：(1)本发明的全人源单链抗体结构简单，是抗体重链可变区vh和轻链可变区vl由连接肽(ggggs)3连接而成，mw为30-34kd，且含有完整抗原结合部位；(2)本发明的单链抗体可以对pdl-1阳性的肿瘤细胞，如a549细胞，产生生长抑制作用；(3)本发明的单链抗体分子量小、穿透性强、免疫源性低，可作为药物或药物载体运输药物、同位素或毒素蛋白，可以治疗pdl-1阳性的癌症。

附图说明

图1是噬菌体抗体库的富集筛选过程示意图。

图2是elisa检测噬菌体scfv与pdl-1-ecd蛋白的结合活性。

图3a和图3b是b129阳性株基因序列图谱，其中图3a为vh片段序列(包括linker)，图3b为vl片段序列图。

图4是b129阳性株噬菌体单克隆对细胞株的抑制作用。

图5是scfv蛋白sds-page电泳图。

图6是scfv蛋白的免疫印迹分析图。

具体实施方式

本发明结合以下实施例及附图作进一步说明。

实施例1：噬菌体抗体库的筛选

实验方法：使用本实验室表达的肿瘤相关抗原胞外区(pdl-1-ecd)筛选本实验室建立的全人源白血病抗体库。用na2co3/nahco3将抗原稀释后，加入96孔elisa板，4℃包被过夜。次日，封闭液封闭1h，加入噬菌体抗体库，37℃孵育2h。tbs洗涤(第一轮5遍，第二轮10遍，第三、四轮10遍)。用甘氨酸-盐酸(ph2.2)洗脱并收集噬菌体，tris-hcl中和至ph7.0，侵染对数期e.colitg1，37℃静置20min，取10μl测滴度。其余转至20ml2×yt-a-g，37℃振摇培养至od600nm达到0.5，然后加入辅助噬菌体,37℃振摇1h，离心，沉淀重悬于200ml2×yt-ak，30℃振摇过夜，次日，收集噬菌体。图1为步骤说明图。

实验结果：噬菌体抗体库用靶抗原pdl-1-ecd经四轮“吸附、洗脱、扩增”的筛选，同时测定回收率(yield)，表明噬菌体的回收率不断增加，结果见表1。

表1、噬菌体抗体库的富集筛选结果

结果说明：经三轮筛选后,与靶抗原pdl-1-ecd结合的噬菌体的回收率(2.23x10^-4)是第一轮筛选回收率(5.92x10^-9)的265470倍，表明与靶抗原特异结合的噬菌体已经得到有效富集。

实施例2：抗体库多样性分析

实验方法：随机挑选筛选到的400个单克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司，进行插入区域的dna序列测序。将能正确编码氨基酸序列的单克隆dna序列翻译成氨基酸，经clustaix软件进行序列比对分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)。

实验结果：序列分析结果表明，有8株噬菌体单克隆的插入区域的dna可以正确编码氨基酸，氨基酸序列比对结果见表2，其中10号和38号和36号和46号两株噬菌体插入区域的dna序列完全相同。

表2、clustaiw序列比对分析结果

结果说明：筛选出的8株单克隆噬菌体中，除10号和38号和36号和46号四株噬菌体插入区域的dna序列完全相同，其余6株的序列各不相同。

实施例3：elisa鉴定抗体特异性

实验方法：挑选筛选三轮后获得的噬菌体单克隆，送测序。将含测序能通读的序列的单克隆，制备单克隆重组噬菌体。用pbs稀释抗原，加入到96孔培养板中，4℃包被过夜。取出后，用封闭液37℃封闭1h，将待测的单克隆重组噬菌体加入96孔板中，37℃温育2h。以pbs作为阴性对照，加入hrp/anti-m13抗体，37℃温育1h，加底物tmb-h2o2显色，酶标仪测定a450nm值。

实验结果：用单克隆噬菌体抗体做elsia验证，结果参见图2，其中b10-a200为筛选到的15株可通读序列，pbs和噬菌体lib为阴性对照组，a450nm值<0.2。b10/b38/b36/b46号噬菌体序列完全相同，b30，b31，b84，b129a450nm值在0.1-0.6之间。

结果说明：筛选到的15株噬菌体中，b129呈强阳性。其中，b10，b38，b36，b46号(序列完全相同)具有很好的与靶抗原的结合活性。

实施例4：阳性株展示的单链抗体的基因序列分析

实验方法：单链抗体的dna序列图谱见图3a和图3b，根据dna序列图谱，取阅读框序列输入vbase2数据库(http://www.vbase2.org/)，分析获得单链抗体结构分析图。

实验结果：分析结果如图3a为vh片段序列(包括linker)、图3b为vl片段序列图，图中可见重链和轻链分别具有fr1、fr2、fr3、fr4、cdr1、cdr2和cdr3结构域。

结果说明：该阳性株展示的单链抗体scfv具有完整的抗原结合区，具有正确的单链抗体结构。

实施例5：噬菌体单链抗体对肿瘤细胞的特异抑制作用测定

实验方法：选用pdl-1阳性的肿瘤细胞株a549以及pdl-1阴性的肿瘤细胞株mda453，在37℃和5％co2的条件下培养至对数期；将细胞培养悬液，离心，弃上清，收集细胞；用细胞培养液悬浮细胞，并以5.0×10³-1.0×10⁴cells/孔的密度接种于96孔细胞培养板，在37℃和5％co2的条件下培养24h；将elisa鉴定阳性的3号噬菌体扩增，加入不同浓度的scfv，孵育48-72h，每孔设4个复孔，以只加pbs和pbs稀释的m13噬菌体的做阴性对照；加cck-8溶液，37℃孵育1h；在470nm波长下测定吸光度值，并计算细胞在不同浓度的scfv作用下的生长抑制率。

实验结果：见图4，单克隆噬菌体scfv可对a549细胞产生抑制作用，对a549细胞的抑制作用最高可达50％以上。用mda453细胞做阴性对照，仅有轻微抑制作用，与pdl-1阳性细胞有显著性差异(p<0.05)。

结果说明：所筛选得到的全人源抗pdl-1单链抗体b129可对pdl-1阳性的a549细胞产生明显生长抑制作用，而对pdl-1阴性的mda453细胞无明显抑制作用；表明其抑制作用具有明显的特异性。

实施例6：单链抗体scfv的可溶性表达

实验方法：取阳性克隆的重组噬菌体侵染对数生长期的e.colibl21，接种于sobag-嘧啶酸板上，30℃孵育过夜；挑取一个克隆，于2×yt-ag中，30℃培养过夜；次日将过夜菌液1：10加入50ml2×yt-ag中，30℃培养lh，离心，弃去上清，50ml2×yt-amp-iptg重悬沉淀，30℃，培养6～7h后，离心，沉淀用2.5ml含20％蔗糖的25mmtris-hcl(ph7.3)重悬，充分悬浮，冰浴30min；重新离心收集菌体，加入5ml双蒸水重悬，冰浴30min，离心后，上清即周质蛋白；对获得的蛋白质进行12％sds-page电泳分析。

实验结果：经iptg诱导，sds-page电泳检测，参见图5，m：为蛋白质分子量标准；b30/b36/b129为透析后的表达包涵体，均可见分子量33kd左右目的条带。

结果说明：经iptg诱导，单链抗体scfv细胞中表达；表明该单链抗体可以通过基因工程的方法，在原核体系中进行表达和制备。

实施例7：westernblot鉴定scfv蛋白

实验方法：与实施例6同法制备蛋白样品，并进行12％sds-page电泳后，取下电泳后的丙烯酰胺凝胶，转移至pvdf膜，100v恒压/转膜90min；取下pvdf膜，封闭液(tbst-5％脱脂奶粉)封闭pvdf膜，缓慢摇1h；稀释一抗rabbitanti-6×histagantibody，取出pvdf膜于封闭液中，缓慢摇1h，用tbst再洗涤5min×5次；封闭液稀释二抗goatanti-rabbitigg-fifcconjugate，缓慢摇1h，用tbst洗涤5min×5次；化学发光ecl显色，拍照记录结果。

实验结果：经westernblot检测，见图6，b30，b36，b129均有分子量mw33kd的条带。

结果说明：用westernblot方法进一步证明，单链抗体scfv可以在细胞周质和全细胞中表达，在培养物上清中也有少量表达。

综上所述，我们从全人源抗体库中筛选得到了一种能特异与pdl-1分子特异结合的单链抗体，经dna序列测定、elisa分析和电泳鉴定证明其结构正确，并可以经大肠杆菌表达；在培养的pdl-1阳性的肿瘤细胞中，可以引起特异的抑制作用，该单链抗体本身或者其可变区序列经过基因工程等方法改造成其它的抗体形式后，可以作为抗肿瘤药物或药物载体，如偶联药物、毒素或放射性同位素，进行pdl-1阳性的靶向治疗。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>全人源抗pdl-1单链抗体b129及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>741

<212>dna

<213>人工序列(unknown)

<400>1

atggcccaggtccagcttgtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggggagtctctg60

aagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcggctgggtgcgc120

cagatgcccgggaaaggcctggagtggatggggatcatctatcctggtgactctgatacc180

agatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagccgacaagtccatcagcacc240

gcctacctgcagtggagcagcctgaaggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagg300

atagcatcaaatgcctttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcaggt360

ggtggaggatctggcggcggcggctccggtggtggtggatctgacatccggatgacccag420

tctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatccactgcaagtctagc480

cagagtcctttctacagctccaataacaagaactacttagcttggtaccaacagaagccg540

ggacagcctcctaaactcctcatttactgggcaacttcccgggaattcggggtccctgcc600

cgattcagtggcgacgggtctgggacagatttcactctcaccatcgacagcctgcaggct660

gaagatgtgggggtttatttctgtcagcaatatttgagtctcccgatcaccttcggccaa720

gggacacgactggagattaaa741

<210>2

<211>247

<212>prt

<213>人工序列(unknown)

<400>2

metalaglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslyspro

151015

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210215220

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225230235240

glythrargleugluilelys

245