一种重组抗体及其制备方法与流程

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种重组抗体及其制备方法。

背景技术：

重组单克隆抗体包括传统的鼠源性单克隆抗体的人源化和全人源抗体。随着基因工程的不断发展和完善，重组抗体药物的研发得到迅猛的发展，已经有一百多个重组药物进入不同的临床研究阶段，主要用于肿瘤、过敏症、自身免疫性疾病、感染等。

重组单克隆抗体应用于抗肿瘤，可以提高治疗效果，并且降低治疗的副作用。

近年来，肿瘤治疗的主要靶点是：vegf、egfr、her2等，这些药物临床应用中取得不错的效果，但也存在一个共同的缺点：部分患者易产生耐药性或者说只有一部分受益，并且效果有限。产生这种耐药性的原因主要是部分患者体内的kras基因发生突变，突变的kras蛋白使gtpase一直处于活性状态，持续激活mapk信号。

因此，研发一种全新的重组单克隆抗体，可以高效抑肿瘤生长，从而减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题，因此抗体药物需要升级。抗体的可变区不同，抗体的免疫原性是不同的，会影响抗体的耐受速度和毒性，可直接影响药效。高亲和力的可变区抗体，可以减少药物使用剂量，从而降低药物量的需求，以降低使用费用。由于肿瘤细胞具有不同的抗原表位和相同抗原表位具有不同的结合力，因此，开发一种与肿瘤细胞抗原表位具有更高亲和力的抗体，将有助于获得非常好治疗效果的抗肿瘤药物。

技术实现要素：

本发明为解决目前肿瘤药物易产生耐药性以及效果有限的技术问题，提供一种重组抗体，所述的重组抗体可以显著抑制肿瘤的生长，从而达到更好的抗肿瘤的效果。

本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：

一种重组抗体，包括两条重链和两条轻链，重链可变区，包含以下重链cdr氨基酸序列：seqidno：1，seqidno：2，seqidno：3；轻链可变区，含有以下轻链cdr氨基酸序列：seqidno：4，seqidno：5，seqidno：6。

优选地，所述抗体重链恒定区序列为人iggl的重链恒定区，该抗体的轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列

一种核酸，其包含编码根据权利要求1中抗体的核苷酸序列，所述的序列重链为：seqidno：7，轻链为：seqidno：8所示。

上述重组抗体的制备方法，其由包含seqidno：7；seqidno：8所述的核苷酸序列编码而成。

上述重组抗体在制备抗肿瘤的药物中的应用。

一种药物组合物，其含有上述重组抗体。

优选地，所述的药物组合物，还包含药物学上可接受的载体。

优选地，所述的药物为抗癌药物。

有益效果：

本发明提供了一种全新的重组抗体，可以非常有效的抑制a431和huvec肿瘤细胞的增长，对huvec肿瘤细胞的抑制率是avastin的近4倍，具有非常显著的抑制效果。

附图说明

图1重组抗体抗肿瘤特性图

图2重组抗体重链可变区的核苷酸序列及其演绎的氨基酸序列，以下划线标出互补决定区的氨基酸残基cdr-hl(seqidno：1)，cdr-h2(seqidno：2)和cdr-h3(seqidno：3)。

图3重组抗体轻链可变区的核苷酸序列及其演绎的氨基酸序列，以下划线标出互补决定区的氨基酸残基cdr-l1(seqidno：4)，cdr-l2(seqidno：5)和cdr-l3(seqidno：6)。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

本发明的重组抗体的重链恒定区序列是人iggl的重链恒定区序列。该抗体的轻链恒定区序列是人κ抗体轻链恒定区序列。

如本文所用，术语“可变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。可变区包括来自“互补决定区”即“cdr”的氨基酸残基和/或来自“可变环”的残基(即以及重链可变区的残基)。

为了便于保存，可以通过将具有要求纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，制成冻干制剂或水溶液形式的抗体治疗用制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用剂量和浓度对接受者是无毒的，它们包括例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲液；包括维生素c和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(例如氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化己烷双胺、氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟苯甲酸甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环已醇、3-戊醇和间甲苯酚)；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白、亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖或其它糖，其中包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物（例如zn-蛋白质络合物）和/或非离子表面活性剂，例如吐温，pluronics或聚乙二醇。

实施例1重组抗体的制备

为表达本发明重组抗体，参照woodetal.,jimmunol.145:3011(1990)等的方法，在cho细胞，特异性结合cd20胞外区的单克隆抗体。用常规的分子生物学方法构建含抗体基因的表达载体（optichoantibodyexpresssystem购于invitrogen公司）。宿主细胞为cho-k1细胞(atccccl61)的一种衍生细胞系。构建高产稳定细胞系，步骤如下所述：宿主细胞悬浮生长于cd-cho培养基（gbico，ca），将处于对数生长期的宿主细胞离心，重新于悬浮生长于新鲜的cd-cho培养基，计数，调整细胞密度直到1.43×10⁸个/毫升，取400μl上述细胞悬液加入电击杯，然后加入已线性化的质粒20μg，用移液枪吸打使细胞与质粒混合均匀。将bio-rad电转仪参数设定为：电容：980μfd，电压：300v，电击转。正常电击时间为16-19毫秒。把电击后的细胞立即重悬于37℃预热的cd-cho培养基，每孔100μl分装于96孔板，2-3天后加入等量的筛选培养基(cd-chomedia+80μmmsx)。elisa测定96孔板细胞培养上清抗体的表达水平。表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板，待细胞生长到一定数量，把细胞转入6孔板，使每孔5ml培养基含4×105个细胞，测定细胞的抗体产量和产率。通常25个克隆被转到摇瓶做进一步评价。最后7-8个表达量最高的克隆进行亚克隆和进一步的表达检测。收获料液，通过低速离心使细胞和培养基分离，把离心上清高速离心进一步澄清。用蛋白a亲和纯化和离子交换纯化。

实施例2重组抗体抗肿瘤实验

选用人a431肿瘤细胞在裸鼠体内的生长抑制效果来评价的重组抗体抗肿瘤效果。简单描述如下：a431细胞(atcc，crl-7907)生长于含13%的胎牛血清和添有3mm谷氨酰胺的dmem培养基。收集a431细胞重悬于pbs，使100μl体积含有4×10⁸细胞，取5-6周龄的雌性裸鼠，在其右腋注射100μl上述细胞悬液。当肿瘤体积达到80-150mm³时开始分组给药，每组20只。缓冲液给药体积100μl，每三天一次总共给药8次，给药方式是腹腔注射。重组抗体按每公斤体重5mg抗体量的剂量每三天一次总共给药8次，给药方式是腹腔注射，注射体积为每次100μl。肿瘤体积每2天测定一次。最后一次给药并测定肿瘤体积大小后（第一次给药24天后），动物被立即以无痛至死，肿瘤被剥离并称重。在5mg/kg剂量下，重组抗体显著抑制了肿瘤细胞的生长，实验结果见图1，结果表明，重组抗体具有显著的抑制a431肿瘤细胞增殖的效果。

实施例3重组抗体体外抑制内皮细胞增殖实验

采用重组抗体对内皮细胞在体外的抑制评价其抗肿瘤效果。具体操作如下：在内皮细胞基本培养基(dmem,sigma)中，加入生长因子(bulletkit，lonza)和12%胎牛血清(购自sigma)，配制成内皮细胞生长培养基。当人脐静脉内皮细胞(huvec，atcc，catno：crl-1730)生长到致密单层时，以5×10⁴细胞/孔的密度接种于96孔板中，此时的分析培养液不加入生长因子。阳性对照抗体为avastin，重组抗体按一定稀释梯度加入，孵育1h后，加入重组抗体使其终浓度为10ng/ml。37℃，5%co2培养箱培养4天后。每孔中加入10μlmtt(invitrogen)继续培养24h。在激发波长540nm和发射波长620nm时，利用酶标仪测定细胞的增殖情况。每个处理设3次重复，每个重复测定两次。

结果，在重组抗体有效浓度下，抗体对人脐静脉内皮细胞的增殖有较好的抑制作用，阳性对照抗体avastin在三个剂量组（20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml）中对huvec细胞增殖的抑制率分别为25.0%，13.4%和12.3%，而本实验重组抗体在三个剂量组（20μg/ml，10μg/ml，5μg/ml）中对huvec细胞增殖的抑制率分别为80.3%，40.5%和27.0%，说明重组抗体比对照抗体avastin抑制内皮细胞增殖的作用显著，并均呈剂量依赖性。

综上所述，本发明的重组抗体具有与avastin抗体相当的免疫效力，并且与人抗原的结合亲和力更高、具有更高的特异性。

序列表

<110>广州市鲁诚生物科技有限公司

<120>一种重组抗体及其制备方法

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