适合无血清全悬浮培养的BHK细胞及其驯化方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种适合无血清全悬浮培养的bhk细胞及其驯化方法。

背景技术：

bhk细胞是叙利亚仓鼠肾细胞，其连续传代能力强，且对口蹄疫病毒(fmdv)较为敏感，适合口蹄疫病毒在其细胞内增殖，自从20世纪六七十年代起被广泛用于口蹄疫病毒疫苗的生产。我国从20世纪80年代初开始使用有血清培养基转瓶培养贴壁的bhk细胞进行口蹄疫病毒灭活疫苗的生产，然而存在副反应大、成本高、产量低、后期分离纯化困难、质量稳定性差等问题。为了解决上述有血清培养带来的诸多不利因素，推进以bhk细胞无血清高密度全悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活疫苗的新工艺开发，成为口蹄疫疫苗制造行业的迫切希望。

由于bhk原始细胞株为成纤维细胞，为贴壁依赖型培养株，贴壁特性较强，并且通常在培养过程中需添加动物血清才能正常生长，所以对其的无血清悬浮驯化过程较为复杂和困难。而目前已有的bhk悬浮细胞无代次控制、稳定性较差，且细胞密度难以突破1千万，对口蹄疫病毒的敏感性降低，尤其是无血清悬浮培养后上述问题更为突出，且细胞在长期使用过程中易出现结团、细胞形态变差等现象。因此，各企业和科研单位不得不根据各自的科研生产目的，在项目过程中自行对bhk细胞多次进行无血清驯化。针对上述情况，一项稳定通用的对bhk贴壁细胞进行无血清悬浮驯化的方法极具指导价值。

贴壁细胞的悬浮驯化是将从方瓶中消化下来的贴壁细胞进行低转速离心并用新鲜培养基连续传代培养的过程。而在目前已有的bhk无血清悬浮驯化方法中，一般都将经历从贴壁培养到低血清贴壁培养、再到低血清悬浮培养，直至最后得到无血清悬浮培养的bhk细胞。其中从方瓶的贴壁培养到摇瓶的悬浮培养通常都涉及到逐步降血清的步骤，使得整个驯化过程的实验步骤变得复杂、操作要求高，并且细胞结团严重、生长缓慢、密度低。整个驯化过程通常耗时较久，从而增加了更多不确定因素，成功率低，且细胞在逐渐适应由贴壁生长转变为悬浮生长的过程中形态和特性都将发生转变。此外，bhk细胞在悬浮传代过程中可能因表面与fmdv感染相关的受体丢失或表达量下降而丧失对fmdv的敏感性。驯化时间越长，细胞代次越高，细胞特性转变和敏感性降低的可能性就越大，尤其是bhk细胞。

因此，本领域迫切需要一种高效而快速对bhk细胞进行驯化，从而获得适用于无血清全悬浮培养的bhk细胞的方法。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种高效而快速对bhk细胞进行驯化，从而获得适用于无血清全悬浮培养的bhk细胞的方法，以及经驯化bhk细胞及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种对bhk细胞进行驯化的方法，所述方法包括步骤：

(a)提供一待驯化的bhk细胞，所述的bhk细胞为贴壁培养型bhk细胞；

(b)将所述待驯化的bhk细胞作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得经驯化培养的bhk细胞；和

(c)将上一步骤获得的经驯化培养的bhk作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得进一步驯化培养的bhk细胞，其中该步骤(c)重复n次，n为5-50的正整数，直至所获得的经驯化培养的bhk细胞为悬浮培养型bhk细胞；

其中，在步骤(b)和(c)中，所述无血清培养基含有以下成分：

(1)谷氨酰胺，浓度为2000-4000um；

(2)维生素vb12，浓度为1-2um；

(3)乙醇胺，浓度30-50um；和

(4)硒元素，浓度为0.05-0.2um。

在另一优选例中，所述的无血清培养基中，血清含量为≤0.1％(v/v)，较佳地≤0.01％(v/v)，更佳地为0％(v/v)。

在另一优选例中，所述的n为10-30、15-30、20-30、20-40、或15-45。

在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，各无血清培养基是相同或不同的培养基。

在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，各无血清培养基是主要成分基本相同的培养基。

在另一优选例中，所述的主要成分包括：碳源、氮源、和无机盐等。

在另一优选例中，所述的无血清培养基为基础培养基、无蛋白培养基、或化学成分确定的培养基。

在另一优选例中，所述的培养基中，硒元素来自有机化合物或无机化合物，较佳地来自亚硒酸或亚硒酸盐(如亚硒酸钠)。

在另一优选例中，在所述方法中，随着n的增大，硒元素的浓度是逐渐下降或不变的。

在另一优选例中，所述的悬浮培养型bhk细胞是在无血清条件下的悬浮培养型bhk细胞。

在另一优选例中，所述的悬浮培养型bhk细胞是在无血清条件下≥95％(如95-100％，或98-99％)细胞处于悬浮培养状态。

在另一优选例中，所述的悬浮培养型bhk细胞具有选自下组的一个或多个特征：

(i)细胞呈分散状；

(ii)细胞呈圆润、透亮状；

(iii)细胞生长状态稳定；

(iv)适合高密度悬浮培养。

在另一优选例中，所述的高密度指5×10⁶-5×10⁷细胞/ml(或更高)。

在另一优选例中，在步骤(b)的驯化培养过程中，包括：对种子细胞进行消化处理，然后将所述经消化的种子细胞接种于所述的无血清培养基。

在另一优选例中，在步骤(c)的一个或多个或全部的驯化培养中，包括对种子细胞进行消化处理，然后将所述经消化的种子细胞接种于所述的无血清培养基。

在另一优选例中，所述的消化处理在步骤(c)中当n≤20(较佳地n≤10)时进行。

在另一优选例中，所述消化处理中的处理条件包括：添加胰蛋白酶。

在另一优选例中，所述消化处理中的处理条件包括：添加胰蛋白酶后放置于36-38℃、4-6％co2和转速为200-250转/分钟培养箱中。

在另一优选例中，所述胰蛋白酶的用量为0.05％-1％，较佳地为0.1％-0.5％，更佳地为0.2％-0.3％，按混合物(或培养体系)的总重量计。

在另一优选例中，在驯化培养24h-48h后进行消化处理。

在另一优选例中，所述消化处理的时间为5-15min，较佳地为10min。

在另一优选例中，所述的消化处理后还包括：加入胰酶抑制剂或血清培养基停止消化。

在另一优选例中，在步骤(b)和(c)中，所述bhk细胞在带透气盖尖底离心培养反应管中进行培养。

在另一优选例中，所述各驯化培养包括：在36-38℃、4-6％co2和转速为200-250转/分钟下进行培养。

在另一优选例中，所述各驯化培养包括：种子细胞的接种量为1×10⁵-1×10⁶细胞/ml，较佳地为4×10⁵-1×10⁶细胞/ml，更佳地为5×10⁵-1×10⁶细胞/ml。

在另一优选例中，所述各驯化培养包括：培养体积为15-25ml，较佳地为20ml。

在另一优选例中，所述各驯化培养包括：培养时间为1-3天，优选为1-2天。

在另一优选例中，在步骤(c)中，还包括：对所述的经进一步驯化培养的bhk细胞进行分选处理，从而去除细胞团并获得悬浮的bhk细胞，并将所述悬浮的bhk细胞用作下一驯化培养的种子细胞。

在另一优选例中，所述的分选处理是在n≥5(较佳地n≥10)时进行。

在另一优选例中，在步骤(c)中，所述的消化步骤和分选处理可以先后、交替、或同时进行。

在另一优选例中，所述步骤(b)和步骤(c)的总时间为20-40天。

在另一优选例中，提供一待驯化的bhk细胞包括：于含10％血清的dmem培养基中复苏所述bhk细胞。

在另一优选例中，提供一待驯化的bhk细胞包括：将所述bhk细胞接种于血清培养中进行贴壁培养。

在另一优选例中，所述的方法还包括：

(d)将获得的悬浮培养型bhk细胞作为种子细胞，在无血清培养基中进行悬浮培养。

在另一优选例中，所述悬浮培养的条件包括：36-38℃、4-6％co2和在转速为200-250转/分钟的摇床培养箱内进行悬浮培养。

在另一优选例中，细胞的接种量为0.8×10⁶-1.2×10⁶细胞/ml。

在另一优选例中，所述悬浮培养的时间为1-2天/次，然后任选地进行传代培养，或更换培养液进行培养。

本发明的第二方面，提供了一种可无血清全悬浮培养的bhk细胞，所述bhk细胞利用本发明第一方面所述的方法驯化得到的。

在另一优选例中，所述的bhk细胞具有选自下组的一个或多个特征：

(i)细胞呈分散状；

(ii)细胞呈圆润、透亮状；

(iii)细胞生长状态稳定；

(iv)适合高密度悬浮培养。

在另一优选例中，所述的高密度指5×10⁶-5×10⁷细胞/ml(或更高)。

本发明的第三方面，提供了一种用于驯化bhk细胞的无血清培养基，所述的驯化是用于获得悬浮培养的bhk细胞，并且所述无血清培养基含有：

(1)谷氨酰胺，浓度为2000-4000um；

(2)维生素vb12，浓度为1-2um；

(3)乙醇胺，浓度30-50um；和

(4)硒元素，浓度为0.05-0.2um。

在另一优选例中，所述的用于驯化bhk细胞的无血清培养基是在常规的适合bhk细胞生长(包括悬浮生长、或贴壁生长)的培养基的基础上，添加上述终浓度的组分(1)、(2)、(3)和(4)而制备的。

在另一优选例中，所述的常规贴壁生长的培养基为dmem培养基，较佳地含5-20％血清的dmem培养基，更佳地含10％血清的dmem培养基。

在另一优选例中，所述血清选自下组：胎牛血清、小牛血清、或成牛血清。

在另一优选例中，所述的常规悬浮生长的培养基选自下组：gibco培养基、dmem/f12培养基、民海培养基、或1640培养基。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了驯化前在含有10％血清的dmem培养基中贴壁培养的bhk细胞。

图2显示了驯化后在无血清培养基中全悬浮培养的bhk细胞。

图3显示了驯化后在无血清培养基全悬浮培养的bhk细胞传代培养的密度生长曲线图。

图4显示了驯化后在无血清培养基全悬浮培养的bhk细胞批培养的密度生长曲线图。

图5显示了驯化前期bhk细胞传代培养的密度生长曲线图。

图6显示了驯化中期bhk细胞传代培养的密度生长曲线图。

图7显示了驯化后期bhk细胞传代培养的密度生长曲线图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种高效而快速驯化bhk细胞，从而获得适合无血清全悬浮培养的bhk细胞的驯化方法。该驯化方法采用一步直接降血清驯化法(即省略了血清梯度或依次下降的培养阶段)，并意外地发现，即使在无逐步降血清的情况下，通过改进培养基的配方，居然可以快速而高效地制得非常适合无血清悬浮培养的bhk细胞。在此基础上完成了本发明。

实验表明，本发明的方法驯化时间短、操作简单、成本低，细胞在转变为悬浮生长过程中形态和特性不易发生转变，成功率高，是一种稳定通用的bhk细胞无血清悬浮驯化的方法。此外，本发明开发的特定的无血清驯化培养基，副反应小，成本低，产量高，后期分离纯化简单，质量稳定性好。此外，本发明方法制备的bhk细胞生长状态稳定，对口蹄疫病毒的敏感性高，细胞分散，生长快，活细胞密度可达1.1×10⁷细胞/ml或更高，可以在非常高的密度下进行全悬浮培养，非常适合大规模生产。

术语

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

bhk细胞

bhk细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(babyhamstersyriankidney)。该细胞系于1961年由macphersonia、stokermgp建系，源自5只未辨性别的1天龄仓鼠肾，1963年进行了单细胞克隆。广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗，如口蹄疫疫苗。因原始的bhk-21细胞株为成纤维细胞，贴壁依赖性生长，生产生物制品时用10升和15升滚瓶贴壁单层培养，由于滚瓶表面积有限，很难到得足够多的细胞来表达相应病毒，也需要大面积厂房设施和众多手工操作。最常用的是bhk-21的一个亚克隆细胞，即克隆13或c13。

本发明方法制备的bhk细胞生长状态稳定，对口蹄疫病毒的敏感性高，细胞分散，生长快，活细胞密度可达1.1×10⁷细胞/ml或更高，可以在非常高的密度下进行全悬浮培养，非常适合大规模生产。

驯化培养基

本发明还提供了一种用于驯化bhk细胞的驯化培养基。在本发明中，对于合适的驯化培养基的组分并没有特别的限制，只要所述的驯化培养基适合bhk细胞的生长即可。

在优选例中，本发明的驯化培养基是在常规的适合培养bhk细胞的培养基的基础上，添加下述终浓度的组分：(1)谷氨酰胺，浓度为2000-4000um；(2)维生素vb12，浓度为1-2um；(3)乙醇胺，浓度30-50um；和(4)硒元素，浓度为0.05-0.2um而制备的。

此外，本发明的驯化培养基中所含有的碳源、氮源、无机盐等可以是常规培养基中常规选用的种类和浓度。在另一优选例中，所述常规培养基中碳源、氮源、无机盐等的种类和浓度是不变或改变的。在另一优选例中，所述常规培养基为适合bhk细胞生长的培养基，包括bhk细胞悬浮生长或贴壁生长。在另一优选例中，所述常规培养基包括dmem培养基(较佳地含5-20％血清，更佳地含10％血清)、gibco培养基、dmem/f12培养基、民海培养基、或1640培养基。

本发明的方法

本发明提供一种快速而高效的无血清全悬浮bhk细胞的驯化方法。典型地，它包括以下步骤：

(a)提供一待驯化的bhk细胞，所述的bhk细胞为贴壁培养型bhk细胞；

(b)将所述待驯化的bhk细胞作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得经驯化培养的bhk细胞；

(c)将上一步骤获得的经驯化培养的bhk作为种子细胞，在无血清培养基中进行驯化培养，从而获得进一步驯化培养的bhk细胞，其中该步骤(c)重复n次，n为5-50的正整数，直至所获得的经驯化培养的bhk细胞为悬浮培养型bhk细胞；

其中，在步骤(b)和(c)中，所述无血清培养基含有以下成分：

(1)谷氨酰胺，浓度为2000-4000um；(2)维生素vb12，浓度为1-2um；(3)乙醇胺，浓度30-50um；和(4)硒元素，浓度为0.05-0.2um。

本发明的方法采用一部直接降血清驯化法，无需逐步降血清的步骤，显著缩短驯化时间和简化操作步骤，克服了已有的驯化方法操作复杂困难、驯化时间长等问题。并且本发明驯化出的bhk细胞不易结团，生长快且稳定性好，对fmdv的敏感性高，细胞密度高，可高密度全悬浮培养。而利用已有的驯化方法驯化出的bhk悬浮细胞无代次控制、稳定性差、细胞密度低、对fmdv的敏感性降低。

为了更好地理解本发明，本发明人提供具体的步骤供参考。应理解，本发明的权利要求所限定的保护范围并不受该具体步骤的限定。具体地，本发明方法包括步骤：

(1)将冻存的bhk细胞复苏于含10％血清的dmem的t75方瓶中贴壁培养，置于37℃、5％co2的培养箱中培养；

(2)培养2天至细胞单层铺满后弃除培养基，加入1ml0.25％胰酶将贴壁bhk细胞消化脱离方瓶表面，然后加入7ml含10％血清的dmem培养基，混匀并弃除6ml培养液，再加入18ml含10％血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2的培养箱中继续培养；

(3)重复步骤(2)传代3次，待贴壁的bhk细胞单层铺满后，加入1ml0.25％胰酶将bhk细胞消化脱离方瓶表面，然后加入7ml含10％血清的dmem培养基，转移至50ml带透气盖尖底离心培养反应管中，800-1500转/分钟离心5分钟后弃上清，以0.8-1.2×10⁶细胞/ml接种，加入15-25ml无血清培养基后重悬细胞，最优值为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(4)培养1天后，将该50ml带透气盖尖底离心培养反应管，800-1500转/分钟离心5分钟后弃上清，加入1ml物质a重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内消化5-15分钟，最优值为10分钟，然后加入1ml物质b，再加入8ml无血清培养基重悬细胞，取样计数，将细胞悬液离心传代至0.5-1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为15-25ml，最优值为20ml，重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(5)重复步骤(4)传代10-30次，直至bhk细胞生长1天无需胰酶消化处理仍呈较为分散状态，停止用胰酶消化处理，后每培养2天取样计数，将细胞悬液离心传代至0.5-1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为15-25ml，最优值为20ml，重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，如此传代5-15次，直至在连续3代培养2天bhk细胞密度可达2×10⁶细胞/ml以上；

(6)步骤(5)获得的bhk细胞每培养2天取样计数，将细胞悬液稀释传代至0.4-0.6×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为15-25ml，最优值为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，在连续3代培养2天bhk细胞密度可达2×10⁶细胞/ml以上，即得可无血清全悬浮培养的bhk细胞系。

在另一优选例中，所述的步骤(3)中有血清贴壁的bhk细胞经胰酶消化后直接移至无血清培养基，在50ml带透气盖尖底离心培养反应管中培养。

在另一优选例中，所述的步骤(4)中，物质a为0.1％-0.5％胰酶，最优值为0.25％胰酶，物质b为胰酶抑制剂或含血清的培养基。

本发明还提供无血清全悬浮bhk细胞在无血清培养基中进行悬浮培养的方法。通常，可以在常规的悬浮培养基中，在常规的悬浮培养条件下进行悬浮培养。

由于经过驯化，本发明的经驯化的bhk细胞非常适合高密度悬浮培养，例如在5×10⁶-5×10⁷细胞/ml(或更高)进行悬浮培养。

在另一优选例中，在所述的悬浮培养中，可采用成分与驯化培养基的成分相同或基本相同的培养基。

在一优选例中，本发明的悬浮培养包括以下步骤：

(1)从液氮罐中复苏一只可无血清全悬浮培养的bhk细胞于50ml带透气盖尖底离心培养反应管中，加入5-10ml无血清培养基，800-1500转/分钟离心5分钟后弃上清，最优值为1000转/分钟，加入15-25ml无血清培养基后重悬细胞，最优值为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(2)培养2天后，取样计数，若细胞密度低于2×10⁶细胞/ml，将细胞悬液离心传代至0.8-1.2×10⁶细胞/ml接种培养，若细胞密度达到2×10⁶细胞/ml以上，将细胞悬液稀释传代至0.8-1.2×10⁶细胞/ml接种培养；

(3)重复步骤(2)传代5-10次，可连续3代培养2天bhk细胞密度可达2×10⁶细胞/ml以上，后可一直稀释传代bhk细胞进行培养；

(4)bhk细胞在50ml带透气盖尖底离心培养反应管中批培养：将步骤(3)中的bhk细胞培养2天后，用无血清培养基将细胞悬液稀释传代至0.8-1.2×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为15-25ml，最优值为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，每24h取样计数。

本发明的主要优点在于：

1.本发明的驯化方法采用一步直接降血清驯化法(即省略了血清梯度或依次下降的培养阶段)，驯化时间短，操作简单，细胞在转变为悬浮生长过程中形态和特性不易发生转变，成功率高，是一种快速而高效的无血清悬浮bhk细胞的驯化方法；

2.本发明的驯化方法使用无血清培养基，副反应小，成本低，产量高，后期分离纯化简单，质量稳定性好。

3.本发明方法制备的bhk细胞生长状态稳定，对口蹄疫病毒的敏感性高，细胞分散，生长快，活细胞密度可达1.1×10⁷细胞/ml或更高，可以在非常高的密度下进行全悬浮培养，非常适合大规模生产。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实验材料：

(1)细胞株：叙利亚仓鼠肾细胞(bhk-21细胞)购自中科院上海生命科学院细胞库；

(2)dmem培养基，gibco；

(3)胎牛血清，biosun；

(4)胰蛋白酶，gibco。

实施例1.待驯化的bhk细胞的贴壁培养

(1)从液氮罐中取出一支购自中科院上海生命科学院细胞库的bhk-21细胞，在37℃水浴快速溶解，同时在无菌操作台中，在无菌离心管内加入10ml含10％血清的dmem培养基。待冻存管中的细胞液全部溶解后，于无菌操作台内，将冻存管中的细胞液转移至加好培养基的无菌离心管中。1000转/分钟离心5分钟后弃上清，加入20ml含10％血清的dmem培养基后重悬细胞，然后转移至t75方瓶中，置于37℃、5％co2的培养箱中培养；

(2)静置培养48h后，在显微镜下可看到细胞铺满单层(如图1所示)。于无菌操作台内，弃除方瓶内培养基，后加入1ml0.25％胰酶将贴壁bhk细胞消化脱离方瓶表面，然后加入7ml含10％血清的dmem培养基，混匀并弃除6ml培养液，再加入18ml含10％血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2的培养箱中继续培养；

(3)重复步骤(2)3次，待细胞铺满单层进行驯化。

实施例2.无血清全悬浮培养的bhk细胞驯化

(1)将实施例1中步骤(3)生长正常、铺满单层的细胞，在无菌操作台内，弃除方瓶内培养基，加入1ml0.25％胰酶将bhk细胞消化脱离方瓶表面，然后加入7ml含10％血清的dmem培养基，取样计数，后转移至50ml带透气盖尖底离心培养反应管中，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入20ml无血清培养基后重悬细胞，以1×10⁶细胞/ml接种，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(2)培养1天后，可看到bhk细胞培养液有大量细胞团，将该50ml带透气盖尖底离心培养反应管，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，加入1ml0.25％胰酶重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内消化10分钟，然后加入1ml胰酶抑制剂，再加入8ml无血清培养基重悬细胞，取样计数，将细胞悬液离心传代至0.5-1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为20ml，重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，如此传代12次。

图5为该步骤中bhk细胞传代生长曲线图，可以看出，此阶段细胞生长较为缓慢，且不稳定；

(3)步骤(2)得到的bhk细胞生长1天后呈较为分散的状态，将含有细胞液的50ml带透气盖尖底离心培养反应管静置2分钟，后用移液管将bhk细胞培养液中沉降下来的细胞团吸出并弃除，后取样计数，将细胞悬液离心传代至1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为20ml，重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，如此传代10次。

图6为该步骤中bhk细胞传代生长曲线图，此阶段细胞生长逐渐趋于稳定，且比生长速率有所上升；

(4)步骤(3)获得的bhk细胞每培养2天取样计数，将细胞悬液稀释传代至0.5-1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，如此传代10次，得到可无血清全悬浮培养的bhk细胞系。

图7为该步骤中bhk细胞传代生长曲线图，可以看出，此阶段细胞生长稳定，可以稳定传代培养。

如图2所示，在显微镜下可以看到驯化后在无血清培养基中悬浮培养型bhk细胞圆润、透亮、细胞分散。

实施例3.可无血清全悬浮培养的bhk细胞库的建立

(1)将实施例2中步骤(4)传代10次后获得的可无血清全悬浮培养的bhk细胞，生长2天后，取样计数，密度为4.9×10⁶细胞/ml，后扩培到5个50ml带透气盖尖底离心培养反应管中培养，接种密度为1×10⁶细胞/ml，最终培养体积为20ml，重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(2)培养2天后，取样计数，密度为5×10⁶细胞/ml，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，在5个50ml带透气盖尖底离心培养反应管中，共加入23.5ml无血清培养基和2.5mldmso，用移液管重悬所有细胞，并将所有重悬后的细胞液集中至一个50ml带透气盖尖底离心培养反应管中；

(3)在每个冻存管中加入1ml重悬过的细胞液，后在冻存管上标明冻存细胞名称、冻存密度、所用培养基、冻存操作人以及日期；

4)将装有bhk细胞的冻存管放置在冻存盒内，后放置在-80℃冰箱中保存，24小时后将装有bhk细胞的冻存管转移至液氮罐中，即生成可无血清全悬浮培养的bhk细胞库。

实施例4.可无血清全悬浮培养的bhk细胞在无血清培养基中的培养

(1)从液氮罐中取出一支可无血清全悬浮培养的bhk细胞，在37℃水浴快速溶解，同时在无菌操作台中，在50ml带透气盖尖底离心培养反应管中加入10ml无血清培养基。待冻存管中的细胞液全部溶解后，于无菌操作台内，将冻存管中的细胞液转移至加好培养基的50ml带透气盖尖底离心培养反应管中。1000转/分钟离心5分钟后弃上清，加入20ml无血清培养基后重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(2)培养2天后，取样计数，细胞密度为1.5×10⁶细胞/ml，将细胞悬液离心传代至1×10⁶细胞/ml接种培养，如此传代2次；

(3)上述步骤(2)传代2次后的bhk细胞培养2天后，取样计数，密度为3.2×10⁶细胞/ml，稀释传代至1×10⁶细胞/ml，最终培养体积为20ml，重悬细胞，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养；

(4)用无血清培养基按照上述步骤(3)的传代方式培养bhk细胞即可；

(5)bhk在50ml带透气盖尖底离心培养反应管中传代培养：将步骤(4)中的bhk细胞培养2天后，取样计数，然后用无血清培养基将细胞悬液稀释传代至1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，如此传代16次。

图3为该步骤中bhk细胞传代培养生长曲线图，结果表明，经过驯化后的bhk细胞传代生长稳定，且可长期传代；

(6)bhk在50ml带透气盖尖底离心培养反应管中批培养：将步骤(4)中的bhk细胞培养2天后，取样计数，密度为4.7×10⁶细胞/ml，用无血清培养基将细胞悬液稀释传代至1×10⁶细胞/ml接种培养，最终培养体积为20ml，置于37℃、5％co2、转速为220转/分钟的摇床培养箱内进行培养，每24h取样计数。

图4为该步骤中bhk细胞批培养生长曲线图，结果表明，经过驯化后的bhk细胞批培养最大活细胞密度可以达到1.1×10⁷细胞/ml。

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