一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用与流程

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种圆褐固氮菌及其鉴定方法和应用。

背景技术：

微生物勘探技术的核心是油气指示微生物的鉴定。通常情况下勘探过程中所研究的目标微生物在环境中的相对丰度很低，因此需在传统的特异培养条件下刺激油气藏环境与非油气藏环境中烃类氧化细菌的快速繁殖。上述方法虽然可以获得微生物的数量信息，但是该数量信息事实上成几何倍数地高于原位环境中的微生物数量，不可避免地掩盖了油气藏与非油气藏环境中微生物数量上的差异，同时也无法获得不可培养微生物的信息。另外，油气微生物的生长除受烃类影响，还会受到周围环境的影响，如土壤的湿度、ph值、盐度或其中的关键离子、营养物质和扰动等。若微生物发育的相对强弱是由环境因素所引起，则会造成油气富集或贫乏的假象。

圆褐固氮菌属于细菌，菌体杆状、卵圆形或球形，无内生芽孢，革兰氏染色阴性，严格好氧、有机营养型，能固定空气中的氮素。包括固氮菌属、氮单孢菌属、拜耶林克氏菌属和德克斯氏菌属。在普光气田油气藏上方土壤中发现该菌占较大的丰度，为了进一步确定该菌与油气微生物勘探之间的关系，需对其典型菌株的获取及检测技术进行开发研究。

目前，圆褐固氮菌的常见检测鉴定方法有两种：1.生理生化鉴定，通过分离出的纯菌，对微生物生理生化进行定性研究，该方法周期长且对培养物纯度提出较高的要求；2.基因提取后进行16srdna的测序，该方法仍需获取纯培养物进行全基因提取，再通过通用16srdna引物获取保守序列进行测序。

因此，为了能够快速、准确获取油气田上方土壤中圆褐固氮菌的特征信息，急需对其典型菌株的获取及混合体系中的检测技术进行开发研究。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供了一种圆褐固氮菌及其鉴定方法，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，且所述圆褐固氮菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，因此该菌株可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。

本发明还提供了一种利用所述圆褐固氮菌指示油气藏上浮气态烃浓度的方法，该方法采用改进的引物对所述圆褐固氮菌的16srdna保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度。

为此，本发明第一方面提供了一种圆褐固氮菌，其16srdna的基因序列如seqidno.1所示。

根据本发明，所述圆褐固氮菌的菌株为sinopec12，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为cctccno：m2016110。

根据本发明，所述圆褐固氮菌的生物学特征为：在固体培养基上的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、中间凸起、粘稠状，显微镜下的细胞形态呈杆状、周生鞭毛、有荚膜，革兰氏染色反应呈阴性。

本发明中，所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；具体地，所述的甲醇固体培养基的组成如下(1l去离子水中)：

和/或，所述的丁醇固体培养基的组成如下(1l去离子水中)：

本发明中，所述甲醇固体培养基和乙醇固体培养基的ph值均为7-8；优选地，所述甲醇固体培养基和乙醇固体培养基的ph值均为7。

根据本发明，所述圆褐固氮菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述圆褐固氮菌的鉴定方法，其包括对待测菌株进行16srdna序列或16srdna的部分序列测序，并且所述待测菌株的16srdna序列或16srdna的部分序列与如seqidno.1的序列的一致性在95％以上，优选所述待测菌株的16srdna序列或16srdna的部分序列与如seqidno.1的序列的一致性在97％以上，更优选所述待测菌株的16srdna序列或16srdna的部分序列与如seqidno.1的序列的一致性在99％以上，最优选所述待测菌株的16srdna序列或16srdna的部分序列与如seqidno.1的序列的一致性在99.5％以上，则鉴定所述待测菌株为所述圆褐固氮菌。

本发明中，使用如seqidno:2(5’-aactgagacacggtccagactcctacgg-3’)和seqidno:3(5’-caaccctctgtaccgaccattgtagcac-3’)作为引物对，进行pcr扩增以获得的所述16srdna的部分序列，并将所述16srdna的部分序列进行测序来与如seqidno:1的相应序列比较以鉴定所述待测菌株。

在本发明的另一些实施方式中，所述方法还包括结合将待测菌株的生物学特性与本发明第一方面所述圆褐固氮菌的生物学特性的比较以对所述待测菌株进行鉴定。具体地，所述的生物学特性为：菌落在固体培养基上呈圆形、半透明、表面光滑、中间凸起、粘稠状，显微镜下细胞形态呈杆状、周生鞭毛、有荚膜，革兰氏染色反应呈阴性。所述的固体培养基为甲醇固体培养基或丁醇固体培养基；所述固体培养基的ph值为7-8。

一般来讲，利用微生物的16srdna序列或16srdna的部分序列对微生物进行鉴定具有例如如下优点：对未知样品进行快速种属分析；为生化鉴定提供指导信息；对于难以获得纯培养的细菌，如寄生菌等，使用16srdna鉴定是唯一可用的鉴定手段。

但是有的微生物由于种间差异小，单独依靠16srdna鉴定不能鉴定到种。需要其它鉴定方法补充，例如微生物的生物学特性。

本发明第三方面提供了一种如第一方面所述的圆褐固氮菌在指示油气藏上浮气态烃浓度中的应用。

根据本发明，所述的应用具体包括以下步骤：

a，提取油气藏上方土壤中微生物的全基因组，获得用于pcr扩增的模板；

b，设计引物对模板进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

c，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带的亮度，判断油气藏上浮气态烃的浓度；具体地，目标条带的亮度越强，油气藏上浮气态烃的浓度越高。

在本发明的一些实施方式中，所述引物为：

上游引物：5’-aactgagacacggtccagactcctacgg-3’(seqidno:2)；

下游引物：5’-caaccctctgtaccgaccattgtagcac-3’(seqidno:3)。

本发明中，用语“油气藏上方土壤”的含义为：油气藏中油气高丰度范围的垂直上方近地表1米内的土壤。

本发明的有益效果为：本发明从典型油气藏上方土壤中筛选到一株圆褐固氮菌sinopec12，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关，可用作油气微生物，指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。同时，该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的圆褐固氮菌sinopec12的16srdna保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。另外，该菌株可在污染的环境中存活，作为生物去污的接种介体。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1显示了本发明的圆褐固氮菌sinopec12基于16srdna的系统发育树。

图2为实施例1中pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；图中附图标记的含义如下：mmarker；1第1泳道；2第2泳道；3第3泳道。

菌种保藏

分类命名：圆褐固氮菌(azotobacterchroococcum)；菌株编号：sinopec12

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：cctcc

地址：武汉大学

保藏日期：2016年3月14日

保藏中心登记入册编号：cctccno：m2016110。

具体实施方式

为使本发明容易了解，下面将结合附图详细说明本发明。

为寻求一种准确、高效地判断油气藏上浮气态烃浓度的指示微生物，本发明经过不懈的研究探索，从油气藏上方土壤中筛选到一株菌株丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关的微生物菌种，经分离鉴定为圆褐固氮菌sinopec12(azotobacterchroococcumsinopec12)；该菌株在油气藏上方土壤中的丰度较高，无需扩增培养，通过改进的引物即可对土壤中的圆褐固氮菌sinopec12的16srdna保守序列进行扩增，根据扩增产物中目标条带的亮度，可准确、高效地判断油气藏上浮气态烃的浓度，解决了传统生理生化检测周期长，对样品培养物纯度要求高的不足。本发明正是基于上述发现作出的。

因此，本发明所涉及的圆褐固氮菌能准确、高效地判断油气藏上浮气态烃浓度，其采用以下筛选培养基(甲醇培养基或丁醇培养基)进行筛选和培养获得；其中，所述的甲醇培养基的组成如下(1l去离子水中)：

和/或，所述的丁醇培养基的组成如下(1l去离子水中)：

具体地，所述甲醇培养基的组成如下：kh2po41.0g/l，na2hpo4·12h2o2.9g/l，mgso4·7h2o0.32g/l，(nh4)2so43.0g/l，cacl20.2g/l，kno31.0g/l，甲醇2.0g/l；

所述丁醇培养基的组成如下：kh2po41.0g/l，na2hpo4·12h2o2.9g/l，mgso4·7h2o0.32g/l，(nh4)2so43.0g/l，cacl20.2g/l，kno31.0g/l，丁醇2.0g/l。

所述甲醇培养基和丁醇培养的ph值均为：7.0。

本发明所述圆褐固氮菌的筛选方法包括以下步骤：

(1)按照上述培养基组成配制培养基，经高温(121℃)高压(0.15mpa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。在液体培养基中加入2％(重量/体积)的琼脂，经过高温高压灭菌溶解后倒入到培养皿中冷却，制备出对应的固体培养基平板。

(2)称取10g普光气田油气藏上方土壤样品，加入到100ml经灭菌的生理盐水中，充分震荡后静置。在超净工作台内取上清液100μl接种到筛选培养基中，在温度30℃、摇床转速200r/min下摇床培养3d。采用灭菌后的生理盐水将培养物分别稀释到10^-5、10^-6和10^-7后，分别取100μl稀释液在对应的固体筛选培养基上均匀涂板，然后置于30℃下培养。3d后可以在固体培养基表面观察到长出的单克隆菌落，用接种针挑取典型单克隆菌落采用划线培养法重新接种于固体筛选培养基中进行纯化培养，纯化三次后获得该菌株的纯培养物。

经观察发现该菌株在固体培养基上的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、中间凸起、粘稠状；该菌株在显微镜下的细胞形态呈杆状、周生鞭毛、有荚膜，革兰氏染色反应呈阴性。

(3)对上述纯培养物进行dna提取，pcr扩增并测序鉴定，然后通过16srdna克隆基因分析法进行测序，利用blast将所测得的序列与genbank/embl/ddbj数据库中已登录的序列进行同源性比较分析。利用生物信息学等方法分析勘探区典型油气藏上方土壤中物种丰度和相对组成特征，获得一株微生物丰度较高的新型菌株，该菌株经鉴定并命名为圆褐固氮菌sinopec12，其16srdna序列长度为1443kp，全长序列如seqidno.1所示。图1显示了本发明的圆褐固氮菌sinopec12基于16srdna的系统发育树。该菌株已于2016年3月14日，在中国典型培养物保藏中心(简称：cctcc)进行保藏，保藏编号：cctccno：m2016110。

经鉴定，所述圆褐固氮菌在油气藏上方土壤中的丰度与油气藏上浮气态烃浓度呈正相关。因此，本发明提供了一种上述圆褐固氮菌在指示油气藏上浮气态烃浓度中的应用。

根据本发明，所述的应用具体包括以下步骤：

a，提取油气藏上方土壤中微生物的全基因组，获得用于pcr扩增的模板；

b，根据圆褐固氮菌sinopec12的16srdna序列设计特异性引物，对模板进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；

所设计的上游引物为：5’-aactgagacacggtccagactcctacgg-3’；下游引物为：5’-caaccctctgtaccgaccattgtagcac-3’；该引物可对环境土壤样品dna进行pcr扩增，快速、准确鉴定土壤样品中是否存在该圆褐固氮菌；

c，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据目标条带的亮度，判断油气藏上浮气态烃的浓度；具体地，目标条带的亮度越强，油气藏上浮气态烃的浓度越高。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

实施例1：利用圆褐固氮菌sinopec12对油气藏上方土壤样品进行鉴定。

(1)根据圆褐固氮菌sinopec12的16srdna保守序列设计特异性引物。

设计的特异性引物的序列如下：

上游引物：5’-aactgagacacggtccagactcctacgg-3’；

下游引物：5’-caaccctctgtaccgaccattgtagcac-3’；

该特异性引物所扩增的目标条带的大小约为1000bp。

(2)提取土壤中微生物的全基因组。

称取油气藏上方土壤与背景土壤各0.5g，分别加至lysingmatrixetube中，用细胞破碎仪进行细胞破碎(速度4.5m/s，30s，4次)，破碎后的细胞按照spinkitforsoil(美国mpbiomedicals生物医学公司产品)的说明书进行后续的操作，获得土壤样品中微生物的全基因组，作为pcr扩增的模板。

(3)pcr扩增。

pcr扩增体系为：

0.2mlpcr管中按顺序加入以下试剂：

10×lapcrbufferii(含mg²⁺)5μl；

dntpmixture8μl；

模板dna1μl；

上游引物2μl；

下游引物2μl；

taq酶0.5μl；

加双蒸水至终体积为50μl。

pcr扩增程序为：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，57℃退火90s，72℃延伸1min，30个循环；

72℃延伸10min。

(4)琼脂糖凝胶电泳。

将上述pcr扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，其中油气藏上方土壤样品的扩增产物点加在第1和第2泳道，背景土壤样品点加在第3泳道，显色后获得的琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。目标条带进行胶回收并测序，测序结果表明，所扩增的1000bp左右的条带为引物设计时的目标保守序列。

结果分析：从图2可知，油气藏上方土壤样品中扩增得到目标条带，而背景土壤样品中没有扩增出目标条带，说明该菌株可用作油气微生物，能够特异性指示油气藏上方烃类渗漏高值区域。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。