一种利用CTAB筛选产生物表面活性剂菌株的方法与流程

本发明属于石油微生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种利用ctab筛选产生物表面活性剂菌株的方法。
背景技术：
：生物表面活性剂是微生物合成的具有双亲性的一类化合物，其结构同时具有亲水性和疏水性，具有很高的表面活性和生物活性。生物表面活性剂包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中性类脂衍生物等。与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂除了具有优良的表界面活性、化学稳定性和热稳定性以外，还具有抗菌、抗病毒、环境友好可降解等生物特性。已在石油的降解、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等领域得到广泛应用。目前国外主要在开发各类新型生物表面活性剂、寻找最适合成条件，表面活性剂结构的剖析与改性，物化性能测试以及室内驱油物理模拟等方面展开研究。相比之下，国内研究起步较晚，主要集中在生物表面活性剂产生菌的筛选和培养条件的优化等方面。研究生物表面活性剂产生菌的生长规律，探讨生物表面活性剂的特性及作用机理，对微生物采油技术的改进和完善以及原油的驱油降粘具有十分重要的理论和实际意义。而目前国内外筛选出的生物表面活性剂产生菌还不是十分丰富，且高效菌株比较少。因此，筛选生物表面活性剂产生菌尤其是高效菌株的筛选方法仍然令研究者感到困难，本发明通过发明人多年的实验和研究经验，归纳创新，提出了一套高效产生物表面活性剂菌的分离筛选方法，并采用实例比较此方法和其他方法筛选效率。技术实现要素：本发明的目的是解决分离筛选高效产生物表面活性剂菌株过程中存在的困难，提供一种高效分离和筛选产生物表面活性剂菌株的方法，能够快速分离与纯化到较高产量的产表面活性剂菌株。本发明提供一种利用ctab(十六烷基三甲基溴化铵)筛选产生物表面活性剂菌株的方法，该方法包括以下步骤：(1)取样：选取含菌水样，所述含菌水样含有产生物表面活性剂的菌株；(2)富集培养：将产生物表面活性剂激活剂与含菌水样混合、密封，并震荡培养，得到富集菌液；(3)ctab平板分离：将富集菌液进行稀释，涂布到含有ctab的平板上培养，直到平板上产生深蓝色晕圈的菌落；选取ctab平板上深蓝色晕圈内的单一菌落，接种到培养基中震荡培养；(4)菌株复筛和能力测定：将步骤(3)分离得到的菌株接种于产生物表面活性剂培养基中，震荡培养，得到菌株发酵液，测定发酵液的界面张力、临界稀释表面张力和排油圈；选择发酵液的界面张力小于0.5mn/m、发酵液稀释500倍后表面张力小于50mn/m、发酵液稀释10倍后排油圈大于5cm的菌株为备选高产生物表面活性剂菌株；(5)稳定性验证：将备选高产生物表面活性剂菌株按照步骤(4)的方法进行至少一轮摇瓶发酵验证，选择发酵液性能稳定的菌株，确定为高产生物表面活性剂菌株。本发明中，所述含菌水样可以为任何待测的含有产生物表面活性剂菌株的水样。优选地，所述含菌水样为油井采出液、油田污水或油田注入水。优选地，步骤(2)中，以待混合的每升样品计，所述产生物表面活性剂激活剂包括以下组分：油脂5～40g/l，甘油0.5～2g/l，硝酸盐2～4g/l，磷酸盐1～2g/l，硫酸盐0.1～0.5g/l，钼酸盐0.05～0.1g/l，调整产生物表面活性剂激活剂与样品的混合液的ph为7.0～7.2；进一步优选地，以待混合的每升样品计，所述产生物表面活性剂激活剂包括以下组分：豆油5～40g/l，甘油0.5～2g/l，nano32～4g/l，na2hpo40.5～1g/l，kh2po40.5～1g/l，mgso40.1～0.5g/l，namoo4·2h2o0.05～0.1g/l，调整产生物表面活性剂激活剂与样品的混合液的ph为7.0～7.2。根据本发明，步骤(2)中，所述震荡培养可以选择本领域的常规方法，所述震荡培养包括：在25～37℃，180r/min的摇床上震荡培养5-10天，选取油脂完全乳化，培养基整体成为乳白色的摇瓶为富集菌液。本发明利用ctab筛选产生物表面活性剂菌株，优选地，步骤(3)中，以平板培养基体积计，所述含有ctab的平板中ctab的含量为2×10-4～6×10-4g/l。平板中的其他组分可以为本领域制备平板的常规组分，优选地，步骤(3)中，以平板培养基体积计，所述含有ctab的平板按以下配方配制：甘油10～30g/l，硝酸盐1～3g/l，钙盐0.05～0.2g/l，磷酸盐1～2g/l，琼脂15～20g/l，亚铁盐2×10-3～6×10-3g/l，亚甲基蓝6×10-6～1×10-5g/l；进一步优选地，以平板培养基体积计，所述含有ctab的平板按以下配方配制：甘油10～30g/l，nano31～3g/l，cacl2·2h2o0.05～0.2g/l，na2hpo40.5～1g/l，kh2po40.5～1g/l，mgso4·7h2o0.4～0.6g/l，琼脂15～20g/l，还包括微量元素：feso4·7h2o2×10-3～6×10-3g/l，亚甲基蓝6×10-6～1×10-5g/l。步骤(3)中，优选地，所述涂布到含有ctab的平板上培养包括：在25～37℃培养1～3天，直到平板上产生清晰且直径超过菌落的深蓝色晕圈的菌落。根据本发明，步骤(3)和(4)中，所述震荡培养可以为本领域的常规方法，优选地，所述震荡培养包括：在25～37℃，180r/min的摇床上震荡培养1～3天。步骤(3)中，所述培养基可以为常规的各种培养基，优选为lb培养基。所述lb培养基的配方为本领域技术人员公知：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l，水1l，调ph至7.0左右。根据本发明，步骤(4)中，测定界面张力采用界面张力仪；测定临界稀释表面张力的方法包括：将菌株发酵液进行不同倍数的稀释，再利用表面张力仪分别测定其表面张力；测定排油圈的方法包括：在培养皿底盖中，加入水，再滴加黏度低于10mpa·s的原油，形成油膜，然后向油膜中心滴入菌株发酵液，测量菌株发酵液形成的排油圈的大小。步骤(1)中，可选取不同油田有代表性的原油生产井，获得所述含菌水样。获得含菌水样后，如不立刻测定，需低温密封保存。根据本发明，该方法还包括：(6)菌种保存：将步骤(5)活化好的单菌制成甘油管，-80℃低温冷冻保存。根据本发明一种具体实施方式，其流程如图1所示，所述利用ctab筛选生产生物表面活性剂菌株的方法包括以下步骤：(1)样品收集与保存：选取不同油田有代表性的原油生产井，收集油井采出液，或者选取收集原油生产过程中产生的油田污水，或者选取油田注入水，作为含菌水样，记录采集位置，编号并低温密封保存。(2)富集培养：将产生物表面活性剂激活剂按比例添加到含菌水样中，纱布密封瓶口，得到产生物表面活性剂富集培养体系，在34℃，180r/min的摇床上震荡培养7天，选取豆油完全乳化，培养基整体成为乳白色的摇瓶为富集完成培养基，此时富集培养结束，产生物表面活性剂的微生物得到富集。产生物表面活性剂富集培养体系按以下方法配制：产生物表面活性剂激活剂配方是豆油20g/l，甘油1g/l，nano34g/l，na2hpo41g/l，kh2po41g/l，mgso40.2g/l，namoo4·2h2o0.05g/l，然后按比例将产生物表面活性剂激活剂添加到盛有100ml样品的250ml三角瓶中，ph调整为7.0～7.2，产生物表面活性剂富集培养体系准备完成。(3)ctab平板分离：取富集后得到的菌液，用无菌水分别稀释到10-6、10-7、10-8，将稀释后的菌液均匀涂布到ctab的平板上，34℃培养1～3天，直到平板上产生清晰且直径超过菌落的深蓝色晕圈的菌落。ctab平板按以下配方配制：甘油20g/l，nano32g/l，cacl2·2h2o0.1g/l，na2hpo40.9g/l，kh2po40.7g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，琼脂20g/l，微量元素2ml；ctab平板中微量元素的组成按以下配方配制：feso4·7h2o2g/l，ctab0.2g/l，亚甲基蓝0.005g/l。单菌分离：选取ctab平板上大的深蓝色晕圈的单一菌落，接种到lb的液体培养基中，lb培养基的配方为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l，纯净水或自来水1l，调ph至7.0左右。在34℃，180r/min的摇床上震荡培养1～3天，直到菌株生长的od600达到0.8以上，此时单菌分离完成，菌株活化完成。(4)产生物表面活性菌株的复筛和能力测定：将上述分离得到单一菌株用lb培养基活化好后，接种于复筛体系中，34℃，180r/min的摇床上震荡培养3天，测定单一菌株发酵液的界面张力、临界稀释表面张力和排油圈实验。测定界面张力采用界面张力仪；测定临界稀释表面张力的方法是：将发酵好的菌液进行500倍的稀释，再利用表面张力仪测定其表面张力；排油圈测定方法是：在直径90mm的培养皿底盖中，加入20ml纯净水或自来水，滴加200ml的黏度低于10mpa·s的原油，形成油膜，再向油膜中心滴入10μl的菌株发酵液，测量发酵液形成的排油圈的大小，如果排油圈的直径超过培养皿底盖的直径，则将发酵液稀释一定倍数以后继续测定；选择发酵液界面张力小于0.5mn/m，发酵液稀释500倍后表面张力小于50mn/m，发酵液稀释10倍后排油圈大于5cm的菌株为备选高产生物表面活性剂菌株。复筛体系的配制方法为：按照豆油10g/l，甘油1g/l，nano34g/l，na2hpo40.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，namoo4·2h2o0.05g/l，蒸馏水1l的配方配制复筛体系培养基，将100ml复筛体系培养基置于250ml的三角瓶中，纱布密封，121℃灭菌20min。(5)稳定性验证：将备选高产生物表面活性剂菌株按照上述(4)的方法和标准筛选进行3轮摇瓶发酵验证，选择发酵液性能稳定的菌株，确定为高产生物表面活性剂菌株。(6)菌种编号、保存：将活化好的单菌编号，并将在复筛体系培养基中活化好的单菌菌液和甘油按照8：2的比例混合均匀，置于甘油管中，-80℃低温冷冻保藏。本发明所具有的优点和有益效果是能够快速高效的分离与纯化到高产生物表面活性剂菌株，生物表面活性剂菌株在环境修复和微生物采油方面都具有广泛的应用，因此，该方法在油田开发和生物修复方面具有良好的应用前景。本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。图1为根据本发明一种优选实施方式的筛选产生物表面活性剂菌株的方法流程图。具体实施方式下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例1本实施例用于说明本发明的从江苏油田某区块油井采出液中高效分离筛选产生物表面活性剂菌的方法。实施例中，产生物表面活性剂激活剂配方：豆油20g/l，甘油1g/l，nano34g/l，na2hpo41g/l，kh2po41g/l，mgso40.2g/l，namoo4·2h2o0.05g/l。ctab平板按以下配方配制：甘油20g/l，nano32g/l，cacl2·2h2o0.1g/l，na2hpo40.9g/l，kh2po40.7g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，琼脂20g/l，微量元素2ml；ctab平板中微量元素的组成按以下配方配制：feso4·7h2o2g/l，ctab0.2g/l，亚甲基蓝0.005g/l。复筛体系的配制方法为：按照豆油10g/l，甘油1g/l，nano34g/l，na2hpo40.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，namoo4·2h2o0.05g/l，蒸馏水1l的配方配制复筛体系培养基，将100ml复筛体系培养基置于250ml的三角瓶中，纱布密封，121℃灭菌20min。该方法包括以下步骤：首先从江苏油田采集编号为w35的油井采出液，取100ml采出液置于250ml三角瓶中，按产生物表面活性剂配方比例添加营养，纱布密封，在34℃，180r/mind的摇床上震荡培养5天，富集产生物表面活性剂菌株，富集后的菌液分别稀释到10-6、10-7、10-8，分别吸取100μl涂布到ctab平板上，平板在34℃恒温培养箱中倒置培养2天，挑取ctab平板上大的深蓝色晕圈的菌落，共得到14株菌株，编号为w1～w14，分别提取w1～w14的dna，利用pcr扩增其16srdna序列，送到上海美吉生物技术有限公司进行16srdna序列测序，将测序结果提交到ncbi数据库进行比对，比对结果如表1所示，从表1中可以看出，分离得到的14株菌株分属于6个属10个种，通过分析查阅和调研，这10个微生物菌种，都具备高产生物表面活性剂的能力。表1筛选菌株16srdna序列比对结果菌株编号比对相似性菌株菌株编号比对相似性菌株w1pseudomonasstutzeriw8bacillussubtilisw2acinetobacterbaumanniiw9pseudomonasfluorescentw3bacillussubtilisw10sphingomonaspaucimobilisw4pseudomonasputidaw11pseudomonasstutzeriw5pseudomonasaeruginosaw12pseudomonasaeruginosaw6exiguobacteriumaurantiacumw13bacilluslicheniformisw7sphingomonaspaucimobilisw14geobacillusstearothermophilus将这10株菌株分别接种于5ml液体lb培养基中过夜培养，培养基浑浊后转移至3瓶平行的复筛培养基体系中，共30瓶复筛发酵体系，34℃恒温震荡培养3天，测定培养3天后的发酵液界面张力，稀释500倍后发酵液的表面张力和稀释10倍后发酵液的排油圈，其结果如表2所示，通过表2的综合评价，共得到8株生物表面活性产生菌符合本发明的筛选指标。表2生物表面活性产生菌筛选指标分析结果通过本发明的技术方法，从江苏油田油井采出液中，进行了产生物表面活性剂菌株的分离和筛选工作，获得10株有价值和潜力的不同产生物表面活性剂菌株，其中编号为w1、w3、w4、w5、w6、w7、w13和w14的8株菌的发酵液界面张力，临界稀释表面张力和排油圈的分析测试结果符合本发明的高效产生物表面活性剂的筛选指标。利用本发明的方法，可从10株有价值和潜力的不同产生物表面活性剂菌株中一次性分离筛选出8株实际具有高效的产生物表面活性剂的能力的菌株，成功率为80％。说明本发明提供的分离和筛选方法是一种高效的产生物表面活性剂的筛选方法。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。当前第1页12