本发明涉及生物学和遗传学领域，尤其涉及一种大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根组织实时定量pcr分析中内参基因的筛选方法。
背景技术：
实时定量pcr(real-timequantitativepcr,qrt-pcr)是当前研究基因表达强有力的技术手段，具有灵敏度高、重复性好、定量准确等优点，被广泛应用于作物分子生物学和遗传学研究等领域。内参基因是qrt-pcr分析准确与否的关键因素，选择合适的内参基因是qrt-pcr研究的重要前提。植物中组成性表达的持家基因是植物维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分，或参与基本生化代谢过程，如肌动蛋白基因act、α/β微管蛋白基因tua/tub、甘油醛-3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapdh等。理论上，这些持家基因在不同细胞或不同生理状态下能够稳定的表达。因此，在大多数植物基因表达研究中，以它们作为稳定表达的内参基因。然而，作物不同组织、不同生长发育过程、不同环境等条件下持家基因的表达稳定性差异明显。因此，针对大豆高温、低磷、盐、衰老、干旱、铝、光周期等非生物胁迫和大豆疫霉诱导、大豆花叶病毒、紫斑病菌、根结线虫、天鹅绒豆毛虫侵害等生物胁迫，已开展了候选持家基因在不同组织的表达稳定性评价和适合特定条件的内参基因的筛选研究。
大豆胞囊线虫病是我国大豆生产上的重要病害。然而，大豆对胞囊线虫的相关基因表达研究均以actin或actin11为内参基因，尚未见栽培大豆或野生大豆在大豆胞囊线虫侵染下大豆持家基因表达稳定性评价的报道。本申请以高抗和高感野生大豆种质为试验材料，检测24个候选持家基因在不同大豆胞囊线虫侵染时期野生大豆根系中的基因表达情况，评价其表达丰度和表达稳定性，以期筛选出适合大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根系中基因表达研究的内参基因，用于探讨野生大豆对胞囊线虫的抗性机制。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根组织实时定量pcr分析中内参基因的筛选方法，以解决上述技术问题。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根组织实时定量pcr分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：供试材料为分别高抗和高感大豆胞囊线虫的野生大豆种子各30粒；
方法步骤为：
(1)供试材料的样品处理
将两份供试材料的种子各30粒用0.5％naclo溶液消毒3分钟后，用流动自来水冲洗4次；将消过毒的种子刻皮后种植在盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中；在27℃，9小时光照/15小时黑暗的条件下培养7天后，第一片三出复叶展开；将苗小心地拔出，并冲洗干净；
每份供试材料的植株分为6组，每组5个植株，其中3组为处理组，3组为对照组，处理组接种虫卵处理，对照组接种液为自来水；
将每组植株移到盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中，珍珠岩占塑料钵容积的2％，在处理组的根表面接种5ml新鲜的虫卵悬浮液，23000个卵/ml；对照组接种5ml的自来水，然后覆2cm厚的高温灭菌的珍珠岩；放置于27℃，9小时光照/15小时黑暗的条件下培养；
接种后9天，每份供试材料随机选取1个对照组和1个处理组，将每个塑料钵的植株轻轻拔出，并将根系冲洗干净；从5个植株的根系中随机取3个植株的根系快速放置于液氮中，剩余2株用于大豆胞囊线虫侵染状况的观察；供试材料剩余4组的植株分别轻轻拔出，将根表面的虫卵和线虫冲洗掉后重新移栽到盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中，放置在27℃，9小时光照/15小时黑暗的条件下继续培养；
分别在接种后15天和20天，每份供试材料随机选取1个对照组和1个处理组，将每个塑料钵的植株轻轻拔出，并将根系冲洗干净；从5个植株的根系中随机取3个植株的根系快速放置于液氮中，剩余2株用于大豆胞囊线虫侵染状况的观察；
(2)rna的提取和cdna的合成
将液氮中保存的根系样品，在液氮中研磨成粉末后，进行rna的提取，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，检测rna的浓度和纯度；进行cdna合成，反转录体系为40μl，其中含有14μlrna溶液；
(3)引物设计
选择24个持家基因；设计qrt-pcr引物序列，合成cdna；
(4)qrt-pcr
将已合成的cdna溶液稀释6倍作为qrt-pcr的初始浓度；20μlqrt-pcr反应体系包含10μl的sybrpremixextaqtm溶液，8μl的cdna溶液，0.38μm的上游引物和0.38μm的下游引物；
(5)数据分析
进行数据处理；对候选持家基因进行表达稳定性评价。
内参基因是实时定量pcr(real-timequantitativepcr,qrt-pcr)分析准确与否的关键，选择合适的内参基因是qrt-pcr研究的重要前提。在大豆方面，针对光周期、干旱、盐等非生物胁迫和大豆疫霉、根结线虫等生物胁迫，开展了适合特定条件的内参基因的筛选。然而，尚未见大豆胞囊线虫侵染下筛选内参基因的报道。本申请以高抗和高感hg0大豆胞囊线虫的野生大豆种质为试验材料，采用qrt-pcr技术检测了act11(glyma.18g290800)、tubulin_motif(glyma.19g194800)等24个候选持家基因在不同大豆胞囊线虫侵染时期(接种后9天、15天和20天)野生大豆根系中的基因表达情况，分析了其中23个持家基因的表达丰度，并利用bestkeeper、genorm和normfinder对其表达稳定性进行了评价。持家基因间的表达丰度不尽相同，而且有些持家基因在不同品种间或不同处理间(接种虫卵和接种水)也存在表达丰度的差异。23个持家基因的表达稳定性也不相同，综合来看，表达最不稳定的基因为cons9(glyma.10g152200)、cons2(glyma.17g138500)、cons1(glyma.15g270900)和tubulin_motif(glyma.20g136000)，本实验条件下它们不适宜作内参基因；其余持家基因相对稳定，本实验条件下可选择tubulin_motif(glyma.15g132200)，cons6/skip16(glyma.12g051100)或tubulin_motif(glyma.05g110200)作为内参基因，它们表达量较高，表达最为稳定，其ct平均值分别为25.7、26.5和25.0，标准偏差分别为0.540、0.575和0.490，genorm软件评价其稳定性的m值分别为0.698、0.715和0.727。该研究为野生大豆抗胞囊线虫相关基因的表达分析提供了参考。
本发明的有益效果是：
本发明以高抗和高感野生大豆种质为试验材料，检测24个候选持家基因在不同大豆胞囊线虫侵染时期野生大豆根系中的基因表达情况，评价其表达丰度和表达稳定性，以期筛选出适合大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根系中基因表达研究的内参基因，用于探讨野生大豆对胞囊线虫的抗性机制。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大豆胞囊线虫侵染下野生大豆根组织实时定量pcr分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：供试材料为分别高抗和高感大豆胞囊线虫的野生大豆种子各30粒；
1、方法步骤为：
(1)供试材料的样品处理
将两份供试材料的种子各30粒用0.5％naclo溶液消毒3分钟后，用流动自来水冲洗4次；将消过毒的种子刻皮后种植在盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中；在27℃，9小时光照/15小时黑暗的条件下培养7天后，第一片三出复叶展开；将苗小心地拔出，并冲洗干净；
每份供试材料的植株分为6组，每组5个植株，其中3组为处理组，3组为对照组，处理组接种虫卵处理，对照组接种液为自来水；
将每组植株移到盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中，珍珠岩占塑料钵容积的2％，在处理组的根表面接种5ml新鲜的虫卵悬浮液，23000个卵/ml；对照组接种5ml的自来水，然后覆2cm厚的高温灭菌的珍珠岩；放置于27℃，9小时光照/15小时黑暗的条件下培养；
接种后9天，每份供试材料随机选取1个对照组和1个处理组，将每个塑料钵的植株轻轻拔出，并将根系冲洗干净；从5个植株的根系中随机取3个植株的根系快速放置于液氮中，剩余2株用于大豆胞囊线虫侵染状况的观察；供试材料剩余4组的植株分别轻轻拔出，将根表面的虫卵和线虫冲洗掉后重新移栽到盛有高温灭菌珍珠岩的塑料钵中，放置在27℃，9小时光照/15小时黑暗的条件下继续培养；
分别在接种后15天和20天，每份供试材料随机选取1个对照组和1个处理组，将每个塑料钵的植株轻轻拔出，并将根系冲洗干净；从5个植株的根系中随机取3个植株的根系快速放置于液氮中，剩余2株用于大豆胞囊线虫侵染状况的观察；
(2)rna的提取和cdna的合成
将液氮中保存的根系样品，在液氮中研磨成粉末后，采用takaraminibestplantrnaextractionkit根据其说明书进行rna的提取，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，用nanodrop2000检测rna的浓度和纯度；使用takaraprimescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser进行cdna合成，反转录体系为40μl，其中含有14μlrna溶液；
(3)引物设计
选择24个持家基因(表1)；利用oligo6.0软件设计qrt-pcr引物序列，由华大基因(北京)合成cdna；
表1持家基因及其qrt-pcr引物序列
(4)qrt-pcr
将已合成的cdna溶液稀释6倍作为qrt-pcr的初始浓度；qrt-pcr在基因有限公司ecotm荧光定量pcr仪上进行，操作参照takarasybrpremixextaqtmⅱ(tlirnaasehplus)的试剂盒说明书进行；20μlqrt-pcr反应体系包含10μl的sybrpremixextaqtm溶液，8μl的cdna溶液，0.38μm的上游引物和0.38μm的下游引物；反应程序为：50℃2min；95℃30s；(95℃5s，60℃30s)×40个循环；95℃15s；55℃15s；95℃15s；每个样品设置2个重复；
(5)数据分析
采用excel2016进行数据处理；采用genorm、bestkeeper和normfinder对候选持家基因进行表达稳定性评价。
2、结果与分析
2.1rna质量及纯度检测
将提取的12份样品的rna溶液进行了1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，发现28srrna和18srrna谱带均清晰，rna完整性好；用nanodrop2000检测rna的纯度和浓度表明，核酸最大吸收波长吸光值a260/蛋白和酚类物质最大吸收波长吸光值a280介于1.70-2.01之间，纯度较好，浓度变化范围为55.0-99.7ng·μl-1；因此，提取的rna可用于cdna合成。
2.2引物的扩增效果和扩增特异性
利用合成的24个持家基因的引物，以稀释了6倍的cdna为模板，进行了qrt-pcr检测。除持家基因actin(glyma.08g182200)出现了非特异扩增外，其它持家基因的qrt-pcr扩增效果均理想，扩增特异性高。
2.3持家基因的表达丰度分析
利用ct值评价持家基因的表达水平。ct值越高，其表达量越低，其表达丰度越低；反之，则表达丰度越高。ct值在样品间的变化反映了基因在样品间表达量的差异。对23个持家基因的表达丰度分析发现，持家基因间的表达丰度不尽相同。本试验中gapdh和act11(glyma.18g290800)表达丰度较高，平均ct值分别为21.6和22.7；而tubulin_motif(glyma.20g136000)和ukn2(glyma.06g038500)表达丰度较低，平均ct值分别为31.4和29.2；其它基因的表达丰度介于它们之间。持家基因在不同品种间或不同处理间也存在表达丰度的差异，而且不同持家基因表达丰度的差异程度也不尽相同。如在抗、感野生大豆间，cons9(glyma.10g152200)的ct值相差最大，达8.1，tua5(glyma.05g157300)相差1.2，而cons10(glyma.05g207500)、cons6/skip16(glyma.12g051100)和cons2(glyma17g14750)相差值均为0；在不同处理(接种虫卵和接种自来水)间，cons2(glyma.17g138500)ct值相差最大，为1.9，cons17(glyma.04g047900)相差0.7，而tubulin_motif(glyma.15g132200)和tubulin_motif(glyma.19g194800)相差值均为0。可见，持家基因在不同野生大豆品种，不同处理(接种虫卵和接种自来水)条件下，其表达丰度表现不同，其稳定性是相对的。
2.4持家基因的表达稳定性评价
为了明确大豆胞囊线虫侵染下23个持家基因在野生大豆根系的表达稳定性，本申请借助bestkeeper、genorm和normfinder软件分析了持家基因ct值，并根据软件要求，将ct值。
2.4.1bestkeeper评价持家基因的稳定性
bestkeeper软件是采用持家基因在不同品种、不同处理及不同取样时期ct值的标准差和变异系数来评价基因表达的稳定性，标准差和变异系数均较小时，基因的表达稳定性较好，标准差和变异系数较大，基因的表达稳定性较差。一般地，标准差大于1时，说明该基因的稳定性差。23个持家基因中，20个基因表达较稳定，其ct值的标准差为0.405-0.863，变异系数为1.43％-3.05％。表达最稳定的2个持家基因为hdc(glyma.08g050200)和tubulin_motif(glyma.19g194800)，其ct标准差分别为0.405和0.440，变异系数分别为1.43％和1.52％；而最不稳定的持家基因为cons9(glyma.10g152200)、cons2(glyma.17g138500)和cons1(glyma.15g270900)，其ct标准差均大于1，分别为4.029、1.400和1.309，ct的变异系数分别为13.78％、5.53％和4.69％。
2.4.2genorm评价持家基因的稳定性
genorm根据m值的大小来评价基因的稳定性。m值越小，基因表达越稳定。本研究中表达最不稳定的3个持家基因为cons9(glyma.10g152200)、cons2(glyma.17g138500)和cons1(glyma.15g270900)，其m值分别为1.061、0.769和0.703。表达最稳定的2个为tubulin_motif(glyma.15g132200)和tubulin_motif(glyma.05g110200)，m值为0.223；其次为cons6/skip16(glyma.12g051100)(m值为0.240)。
使用多个内参基因进行校准可以获得更为准确的实时定量pcr数据。利用genorm软件计算的标准化因子配对差异(vn/n+1)可以来确定内参基因的数目。本实验条件下，同时选择2个持家基因作为内参基因，其标准化因子配对差异v2/3为0.074，小于0.15，因此，同时选择持家基因tubulin_motif(glyma.15g132200)和tubulin_motif(glyma.05g110200)作为内参基因即可获得较为准确的实时定量pcr数据。
2.4.3normfinder评价持家基因的稳定性
与genorm相似，normfinder评价持家基因的稳定性需要将基因的ct值转化为相对表达量，然后根据基因表达稳定指数m来评价基因的稳定性。m值越小，基因表达越稳定。本研究中表达最稳定的基因为cons6/skip16(glyma.12g051100)(m值为0.050)，其次为tubulin_motif(glyma.15g132200)(m值为0.051)和tubulin_motif(glyma.05g110200)(m值为0.064)。表达最不稳定的持家基因为tubulin_motif(glyma.20g136000)(m值为0.315)、cons2(glyma.17g138500)(m值为0.285)和cons9(glyma.10g152200)(m值为0.268)。
本申请选用的候选持家基因主要是与细胞结构相关的肌动蛋白(act11，gmβ-actin、act2/7和actin)、微管蛋白(tubulin_motif、tua5等)、atp结合元件(cons4)及f-box蛋白(cons6/skip16)等。尽管它们是组成性表达的持家基因，但是在大豆胞囊线虫侵染条件下，其在野生大豆根组织中的表达丰度及表达稳定性存在明显的差异。前人研究也表明，大豆不同组织、不同生长发育过程、不同环境等条件下持家基因的表达稳定性差异明显。可见，为获得可靠的实时定量pcr结果，有必要针对特定试验条件开展稳定表达内参基因的筛选。
本申请选用了3个常用的分析内参基因稳定性软件bestkeeper、normfinder和genorm，对23个大豆候选持家基因的表达稳定性进行评价。尽管这3个软件对候选持家基因的表达稳定性排序不一致，但其表达稳定性评价结果相关性高达0.75(bestkeeper与normfinder)、0.86(bestkeeper与genorm)和0.98(normfinder与genorm)。综合考虑，23个候选持家基因中，tubulin_motif(glyma.20g136000)、cons1(glyma.15g270900)、cons2(glyma.17g138500)和cons9(glyma.10g152200)是表达稳定性最差的持家基因，而cons6/skip16(glyma.12g051100)、tubulin_motif(glyma.15g132200)、tubulin_motif(glyma.05g110200)、tub4(glyma.03g124400)和ukn2(glyma.06g038500)表达稳定性较好。本实验条件下，开展实时定量pcr研究时，可采用cons6/skip16(glyma.12g051100)、tubulin_motif(glyma.15g132200)或tubulin_motif(glyma.05g110200)作为内参基因，或同时选择tubulin_motif(glyma.15g132200)和tubulin_motif(glyma.05g110200)2个持家基因作为内参基因组合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。