本发明属于生物领域，尤其是涉及一种结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒。
背景技术：
：结直肠癌(crc)是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60％。发病多在40岁以后，男女之比为2:1。大肠癌的治疗以手术切除癌肿为首选，辅之以放射治疗、化疗药物治疗及中医药治疗等；最近不少学者对早期大肠癌采用经内镜下切除治疗，也取得较好疗效。大肠癌根治术后，仍有50％的病例复发和转移，因此术前、术后化疗有可能提高根治术后5年生存率。抗癌药物首选氟脲嘧啶，其次为丝裂霉素和阿霉素。dna损伤修复和检查点控制缺陷可能导致基因突变和染色体不稳定，促进肿瘤发生。家族性腺瘤息肉病和林奇综合症，这是由基因突变引起的dna错配修复系统，占所有crc不到5％。dna损伤修复基因的异常甲基化变化是crc发展的一个重要机制。slfn基因产物已被证明参与细胞生物过程包括增殖、分化和免疫功能。slfn11通过使得同源重组修复的中间产物rpa-ssdna的不稳定，抑制同源重组修复和细胞周期检验点的持续激活，进而使得肿瘤细胞对基于诱导dna损伤的化疗药物十分敏感，促进肿瘤细胞的死亡。由于slfn11在不同肿瘤细胞中的表达量有很大差异，因此对不同病人肿瘤中slfn11的表达量进行前期检测将对确定不同病人的特定治疗方案，采取更加精准的医疗手段起到重要的临床意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明旨在提出一种结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒，以解决现有的技术难以实现对结直肠癌slfn11基因甲基化预后的检测的问题。为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测引物组，包括m-forward、m-reverse引物对及u-forward、u-reverse引物对；m-forward的碱基序列如seqidno：1所示，m-forward的碱基序列如seqidno：2所示，u-forward的碱基序列如seqidno：3所示，u-reverse的碱基序列如seqidno：4所示。甲基化是在dna甲基转移酶(dnamethyltransferase，dnmt)催化作用下，利用s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)提供甲基，在cpg二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的5号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。dna甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变dna的一级结构，却在细胞的发育、基因表达及基因组的稳定性中起着重要的作用。甲基化特异性的pcr(methylation-specificpcr，msp)，用亚硫酸氢盐处理基因组dna，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行pcr。如果用针对处理后甲基化dna链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。相对于现有技术，本发明所述的引物组具有以下优势：本发明所述的引物组能够实现对处理后甲基化dna链进行扩增进而得到扩增片段，进而能够判定该位点是否存在甲基化，对确定不同病人的特定治疗方案，采取更加精准的医疗手段起到重要的临床意义。上述引物组在制备用于检测结直肠癌slfn11基因甲基化状态的试剂中的应用。一种结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测试剂盒，包含以下任意一种或多种：1)seqidno：1～seqidno：4；2)seqidno：1～seqidno：4所示序列中每条序列的互补链；3)与seqidno：1～seqidno：4所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。使用上述引物组或试剂盒进行pcr时，其特征在于：反应体系如下：反应流程如下：使用上述引物组或试剂盒检测对顺铂敏感性的方法，包括如下步骤：s1：从样品中提取dna；s2：对步骤s1中的dna进行亚硫酸氢盐处理；s3：msp反应即使用权利要求1提供的引物对s2中得到的dna进行扩增；s4：将msp反应产物进行凝胶电泳检测，查看电泳结果。进一步的，msp反应的反应体系及反应流程如下：反应体系：反应流程：步骤s4中当检测得到扩增片段说明slfn11基因位点存在甲基化，即对顺铂不敏感；反之，步骤s4中当检测不到扩增片段说明被检测的slfn11基因位点不存在甲基化，对顺铂敏感。上述结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测引物组具有益之处本结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测试剂盒及检测对顺铂敏感性的方法也一应具有，在此不一一赘述。附图说明图1为电泳结果示意图。具体实施方式除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其中：m-forward、m-reverse、u-forward、u-reverse均由我公司设计并交由苏州金唯智生物科技有限公司采用现有方法合成；当然m-forward、m-reverse、u-forward、u-reverse也可采用其他现有方法合成。下面结合实施例来详细说明本发明。一种结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测引物组，包括m-forward、m-reverse引物对及u-forward、u-reverse引物对；m-forward的碱基序列如seqidno：1所示，m-forward的碱基序列如seqidno：2所示，u-forward的碱基序列如seqidno：3所示，u-reverse的碱基序列如seqidno：4所示。使用上述引物组检测对顺铂敏感性的方法，包括如下步骤：s1：从样品中提取dna。采用常规现有方法即可。本实例中从样品中提取dna具体为(1)取保存于-70℃癌组织的组织，用手术刀片将组织切下，确定组织量，不多于25mg；(2)将25mg组织切成小块，放入1.5ml离心管中，加入180μlbuferatl；(3)加入20μlproteinasek，震荡混匀，56℃孵育直到组织完全裂解；(4)短暂离心5s；(5)加入200μlbuferal，震荡混匀15s，70℃孵育10min，短暂离心5s；(6)加入200μl无水乙醇，震荡混匀15s，短暂离心5s；(7)将上述液体转入qiaampminispincolumn，8000rpm离心1min，弃废液；(8)加入500μlbufferaw1，8000rpm离心1min，弃废液；(9)加入500μlbufferaw2，14000rpm离心3min，弃废液；(10)全速离心1min；(11)将qiaampminispincolumn放入新的1.5ml离心管中，室温放置1min晾干，加入200μlbufferae，室温放置1min，8000rpm离心1min；(12)重复步骤(11)，检测dna浓度。上述短暂离心的速度为：8000rpm，全速离心的速度为：12000rpm。s2：对步骤s1中的dna进行亚硫酸氢盐处理。采用常规现有方法即可。本实例对步骤s1中的dna进行亚硫酸氢盐处理具体为(1)解冻亚硫酸氢盐反应所需的dna；加入800μlrnase-free的水溶解所需的亚硫酸氢盐，充分震荡混匀，直到完全溶解；亚硫酸氢盐优选为亚硫酸氢钠(本实例中亚硫酸氢钠浓度为3.6mol/l)。(2)按表1配制反应液，加到200μlpcr管中；表1componentvolumeperreaction(μl)dnasolution(1ng–2μg)variable*(maximum20μl)rnase-freewatervariable*bisulfitemix(dissolved),seestep185dnaprotectbuffer35totalvolume140其中dnasolution(1ng–2μg)variable*(maximum20μl)是指dnasolution的添加量可变，但是最多为20μl，且里面dna的含量在1ng–2μg；(3)盖上管盖，亚硫酸氢盐充分反应，室温放置；(4)使用pcr仪进行亚硫酸氢盐dna的转换，按表2设置程序；表2(5)将pcr管放置在pcr仪上，进行上述反应；(6)反应完成后，短暂离心5s，转入到新的1.5ml离心管中；(7)加入560μl包含10μg/mlcarrierrna的bufferbl到每个样本中。震荡混匀，离心5s；(8)将上述液体转入到epitectspincolumn中；(9)全速离心1min，弃废液；(10)加入500μlbufferbw，全速离心1min，弃废液；(11)加入500μllbufferbd，室温下放置15min；(12)全速离心1min，弃废液；(13)加入500μlbufferbw，全速离心1min，弃废液；(14)重复步骤(13)1次；(15)全速离心1min；(16)将spincolumn放入新的1.5ml离心管中，开盖56℃孵育5min；(17)将spincolumn放入新的1.5ml离心管中，加入20μlbuffereb,12000rpm离心1min。本实例中全速离心速度为：12000rpm；短暂离心速度为：8000rpms3：msp反应即使用权利要求1提供的引物对s2中得到的dna进行扩增。(1)选择基因：slfn11。(2)slfn11的引物序列如表3所示。表3(3)msp反应体系及流程反应体系如表4所示：表4其中eachprimer1μl(10um)即seqidno：1～seqidno：4分别加入1μl(10um)。eachdatp，dctp，dgtpanddttp2μl(2.5mm)即datp，dctp，dgtpanddttp分别加入2μl(2.5mm)。反应流程如表5所示：表5s4：将msp反应产物进行凝胶电泳检测，查看电泳结果。电泳结果如图1所示，当出现m时说明：slfn11存在甲基化，相应的基体对顺铂不敏感；当出现u时说明：slfn11为非甲基化，相应的基体对顺铂敏感。既m为slfn11基因甲基化，u为slfn11基因未甲基化。若slfn11基因甲基化，则m处显示条带，患者对顺铂不敏感；若slfn11基因没有发生，则m处不显示条带，患者对顺铂敏感。采用本申请提供的引物检测的灵敏度81.7％，特异性69.3％，检测准确度达99％。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>天津艾至恩医疗科技有限公司<120>一种结直肠癌slfn11基因甲基化预后检测引物组及试剂盒<130>azeyl1702<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1attattagtagcgtgacggttatc24<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2cgacaaatatacaaattaaaccgcg25<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tatattattagtagtgtgatggttatt27<210>4<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4atacaacaaatatacaaattaaaccaca28当前第1页12