一种基于PCR技术扩增DBTNBT基因片段筛选产紫杉醇的内生真菌的方法与流程

本发明涉及pcr技术领域、植物内生真菌领域、植物提取物领域。

背景技术：

紫杉醇(药品名：taxol，通用名：paclitaxel)是一种具有的抗癌活性的紫杉烷类二萜化合物，1971年首次发现于短叶红豆杉(taxusbrevifolia)中。1992年，紫杉醇被美国fda批准上市。目前，全球需求量大，出现了紫杉醇的供应危机。由于红豆杉属植物中紫杉醇含量低，如果从红豆杉属植物中提取紫杉醇，将会造成国家一级保护植物红豆杉属植物的大规模砍伐和破坏，造成无法弥补的损失及生态环境的毁灭性破坏。因此，寻求代红豆杉替代品将是一条可行性途径。目前，已经发现内生真菌可产紫杉醇，因此，通过从红豆杉属植物中筛选产紫杉醇高产菌株，或通过诱变育种获得高产菌株，然后通过大规模发酵生产紫杉醇，将是解紫杉醇供应短缺的一条有效途径。

目前，产紫杉醇的内生真菌的筛选方法包括薄层层析，高效液相色谱，质谱和核磁共振等方法。有研究者试图建立基于pcr技术筛选紫杉醇生物合成途径的关键基因，这些基因包括紫杉二烯合成酶（ts）基因，10-去乙酰巴卡亭ⅲ-10-o-乙酰基转移酶（dbat）基因和巴卡亭ⅲ︰3-氨基-3-苯基丙酰转移酶（c-13苯丙氨基侧链coa乙酰基转移酶）（bapt）基因，但是，对紫杉醇生物合成途径的最后一个基因，即紫杉烷-c13-侧链-n-苯甲酰转移酶（3′-n-去苯甲酰-2′-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶）（dbtnbt）基因的pcr扩增却未见报道。目前，对这些基因的研究主要来自于红豆杉属植物，而对内生真菌中的基因知之甚少。对内生真菌中的ts基因，bapt基因和dbat基因的扩增并不能证明该真菌具有紫杉醇生物合成途径的最后一个基因dbtnbt。因此，只有通过扩增内生真菌中的dbtnbt基因，才能够表明内真菌可产紫杉醇，使之成为一个筛选产紫杉醇内生真菌的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种筛选产紫杉醇内生真菌的新方法。

本发明的目的通过以下方案予以实现：

一种筛选产紫杉醇的内生真菌的方法，是通过pcr扩增内生真菌中的dbtnbt基因，再经琼脂糖凝胶电泳检测，可检测到扩增的dntnbt基因片段，则表明该内生真菌可以产紫杉醇。

本发明具有如下有益效果：

1、与高效液相色谱（hplc）和质谱（ms）分析技术比较，基于成熟的pcr技术扩增紫杉醇生物合成途径的最后1个关键基因筛选产紫杉醇的内生真菌，具有操作简单，成本低，应用范围广的特点。

2、与扩增ts基因，bapt基因和dbat基因片段比较，扩增dbtnbt基因片段筛选产紫杉醇的内生真菌的可靠性更好。

附图说明

图1为内生真菌ya1高分辨质谱分析图。

图2为内生真菌sj22高分辨质谱分析图。

图3为内生真菌sk3高分辨质谱分析图。

图4为内生真菌yd4高分辨质谱分析图。

图5为hplc梯度检测紫杉醇(a)、巴卡亭ⅲ（b）和10去乙酰巴卡亭ⅲ(c)。

图6sj22菌株提取物经hplc分析含有与标样相似的保留时间的峰（a）。

图7sk3菌株提取物经hplc分析含有与标样相似保留时间的峰（a）。

图8为琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增的内生真菌dbtnbt序列片段（1:ya1；2:sj22；3:sk3；4:yd4；m:marker）。

具体实施方式

下面通过试验对本发明进行详细的说明。试验中所采用的4个内生真菌ya1，sj22，sk3和yd4经分子鉴定，ya1为黑孢霉属（nigrospora）的内生真菌，sj22为葡萄座腔菌属（botryosphaeria）的内生真菌，sk3为镰孢属（fusarium）的内生真菌，yd4为曲霉属（aspergillus）的内生真菌。

一、试验方法

步骤1、高分辨质谱检测证明内生真菌具有产紫杉醇的能力。

内生真菌提取物的制备：将纯化的内生真菌接种于pda平板培养基上培养以活化菌株。活化后接种于装有250ml的yes（80g/l葡萄糖，10g/l酵母粉，5g/l蛋白胨，2.0g/l磷酸二氢钾，1.0g/l七水硫酸镁）液体培养基的500ml三角瓶中，置于aw-211c大容量恒温培养震荡器中，于28℃、150r/min下培养7d。过滤收集菌丝体，置于-18℃冰箱中冷冻。将解冻后的菌丝体置于研钵中研磨成匀浆，加入适量水和等体积的乙酸乙酯，萃取3次，合并3次上清液，置于旋转蒸发仪中，经80℃减压蒸发浓缩得浓缩提取液。

高分辨质谱检测：浓缩提取液中紫杉醇、巴卡亭和巴卡亭ⅲ的鉴定通过高分辨质谱进行分析检测。采用德国brucker公司的maxisimpact超高分辨质谱仪，高分辨质谱条件为喷雾压力：0.3bar，干燥温度：180℃，干燥压力：4.0l/min，喷雾电压：3500v，离子源：esi。

步骤2、hplc分析证明内生菌具有产紫杉醇的能力。

内生真菌提取物的制备：同步骤1。

hplc分析：为了在hplc分析时减少杂质的干扰和对结果的不良影响，在hplc分析前，需对内生真菌提取物样品进行初步纯化。用毛细点样管在硅胶分析板上点上标样和真菌提取液样品，以二氯甲烷∶甲醇（20:1，v:v）作为展层剂，经过展层后，均匀喷上5%的香草醛浓硫酸作为显色剂，在烘箱中经80℃烘烤至斑点出现，通过rf值确定样品中的紫杉醇在硅胶分析板中的位置。然后，在硅胶制备板上用移液器小心点样，展层条件跟分析板的条件一致，通过三用紫外分析仪在254nm的紫外灯下观察条带，通过rf值确定紫杉醇的位置，用刀片刮下，置于1.5ml的ep管中，加入色谱甲醇溶解，离心取上清液。为了充分回收可能存在的紫杉烷，重复加入色谱甲醇，离心和取上清液，重复两次，合并三次的上清液，将上清液放于通风橱中挥发并精确调整至1ml用于hplc分析。

hplc分析时，用0.22μm的微孔滤膜过滤上述上清液，得到的过滤液作为hplc分析的样品。紫杉醇标准品购自中国食品药品检定研究院，纯度为99.6%。同时为分析样品中是否含有巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ，使用巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ标样，两者购自上海同田生物技术股份有限公司，两者纯度均为98.0%。采用agilent1220高效液相色谱仪，色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(4.6mm×250mm,5μm)。hplc检测方法设置为流速为1.0ml/min，柱温40℃，检测波长227nm，进样量10μl，洗脱液不同比例的色谱甲醇和超纯水进行梯度洗脱，梯度洗脱时间和洗脱剂分别为：0~2min，35∶65;2~5min,55∶45；6~23min，65∶35；24~35min，100∶0；35~37min，100∶35~35∶65；37~40min，35∶65。

步骤3、pcr扩增产紫杉醇内生真菌的dbtnbt基因片段。

采用ctab-sds法提取真菌基因组的dna，进行提取步骤如下：（1）将真菌菌丝体用滤纸吸干表面水分，加液氮研磨，称取研磨物0.4g于离心管，往离心管中加入裂解缓冲液400µl，涡旋2min；（2）再加入1µl蛋白酶k（20mg/ml），在水浴锅中37℃保温；（3）30min后加入20%的sds溶液150µl，置于恒温水浴锅中65℃保温1.5h，每30min充分摇匀1次；（4）将反应液离心，14000r/min，室温，10min，收集上清液；（5）向沉淀中加入250µl裂解缓冲液，涡旋2min，在水浴锅65℃保温10min；（6）待裂解液充分反应，将反应液离心，离心条件为：14000r/min，室温，10min，收集上清液，合并两次上清液；（7）并用等体积氯仿抽提除蛋白质等杂质(上下颠倒，动作轻柔，但混合充分)，取上清液；（8）重复步骤7直到界面不再出现明显杂质为止；（9）加入2倍体积预冷乙醇，置于冰箱中﹣20℃下保存10个小时（过夜），离心14000r/min，10min，弃上清液得到dna；（10）往离心小管加入50µl灭菌双蒸水溶解dna，4℃保存，用于pcr扩增反应。

本次pcr扩增反应的引物为dbtnbt-f：aatggagaaggcaggctcatcaac，dbtnbt-r：atcacactttagttgcatatttgc。pcr扩增条件及体系如下：

ddh2o17μl

10×taqbuffer2.5μl

dntp(2.5mmeach)2μl(0.2mmfinal)

primerf（10µm）1μl(0.4µmfinal)

primerr（10µm）1μl(0.4µmfinal)

taq(2u/µl)0.5μl(1unitfinal)

dna模版1μl（50～200ng/µl）

pcr扩增程序为：①95℃预变性6min后进入循环，②94℃变性50s，③53℃复性40s，④68℃延伸1.5min;goto②，30cycle，⑤68℃延伸10min，4℃forever。

将pcr产物在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，检测条件为：110v，25min。通过与dnamarker比较条带的位置可以知道克隆的片段长度。

二、试验结果

1、高分辨质谱鉴定内生真菌提取物中的紫杉醇

对4个内生真菌ya1，sj22，sk3和yd4进行高分辨质谱分析，结果如图1，图2，图3和图4所示。

图1内生真菌ya1提取物中经高分辩质谱分析证明存在紫杉醇。上：样品的离子特征峰为[m+na]⁺=876.3206。下：在质谱数据库中分子式为c47h51no14的分子离子特征峰为[m+na]⁺=876.3202，两者质量仅相差0.0004。因此，可判断样品中存在分子式为c47h51no14的分子，即紫杉醇分子。

图2内生真菌sj22提取物中经高分辩质谱分析证明存在紫杉醇。上：样品的离子特征峰为[m+na]⁺=876.3187。下：在质谱数据库中分子式为c47h51no14的分子离子特征峰为[m+na]⁺=876.3202，两者质量仅相差0.0015。因此，可判断样品中存在分子式为c47h51no14的分子，即紫杉醇分子。

图3内生真菌sk3提取物中经高分辩质谱分析证明存在紫杉醇。上：样品的离子特征峰为[m+na]⁺=876.3197。下：在质谱数据库中分子式为c47h51no14的分子离子特征峰为[m+na]⁺=876.3202，两者质量仅相差0.0005。因此，可判断样品中存在分子式为c47h51no14的分子，即紫杉醇分子。

图4内生真菌yd4提取物中经高分辩质谱分析证明存在紫杉醇。上：样品的离子特征峰为[m+na]⁺=876.3206。下：在质谱数据库中分子式为c47h51no14的分子离子特征峰为[m+na]⁺=876.3202，两者质量仅相差0.0004。因此，可判断样品中存在分子式为c47h51no14的分子，即紫杉醇分子。

分析鉴定内生真菌株提取物中的紫杉醇

含有紫杉醇，巴卡亭ⅲ和10-去乙酰巴卡亭ⅲ的混和标样，经hplc分析，得到如图5的色谱图，其中，紫杉醇的出峰保留时间（retentiontime）为21.919min。在该条件下，对内生真菌sj22和sk3的提取物进行hplc分析，结果如图6和图7所示，sj22菌株提取物在21.900min含有1个检测峰，sk3菌提取物在21.896min含有1个检测峰。2个检测峰与紫杉醇标样分别相差0.019min和0.004min，两者非常接近，排除系统和人为造成的误差后，可判断这2个样品含有紫杉醇。

扩增紫杉醇生物合成途径的最后一个基因dbtnbt片段

通过ctab-sds法提取内生真菌基因组，根据从红豆杉克隆的dbtnbt基因设计扩增引物，通过pcr扩增内生真菌的dbtnbt基因片段，经琼脂糖凝胶电泳可检测到扩增的dntnbt基因片段，如图8所示，4个内生真菌ya1，sj22，sk3和yd4的dbtnbt序列（dbtnb基因）片段被扩增，这与高分辨质谱检测和hplc分析的结果是一致的，说明基于pcr扩增dbtnbt基因片段的方法可用于筛选和检测产紫杉醇的内生真菌。