遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重PCR引物系统、检测方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统、检测方法和应用。
背景技术：
：结直肠癌(colorectalcancer，crc)为结肠癌和直肠癌的总称，指大肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的癌变，是全世界第三大常见恶性肿瘤，其死亡率较高。研究发现35％的crc存在家族易感性，其中最常见的是遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，hnpcc)，此外，家族性腺瘤性息肉(familialadenomatouspolyposis，fap)和错构息肉综合征(hamartomatouspolyposissyndromes，hps)也比较常见。因此，开展对遗传性结直肠癌的易感基因的分析和研究对遗传性结直肠癌的发病机理和辅助早期诊断具有重要的应用价值。技术实现要素：基于此，有必要提供一种遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统、检测方法和应用。本发明解决上述技术问题的技术方案如下。一种遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统，包括第一多重pcr引物组合和/或第二多重pcr引物组合；其中，所述第一多重pcr引物组合含有112对pcr引物对，且该112对pcr引物对的序列分别如seqidno:1～seqidno:224所示；所述第一多重pcr引物组合含有113对pcr引物对，且该113对pcr引物对的序列分别如seqidno:225～seqidno:450所示。在其中一个实施例中，所述第一多重pcr引物组合中的各对引物等摩尔量混合。在其中一个实施例中，所述第二多重pcr引物组合中的各对引物等摩尔量混合。上述任一实施例所述的遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统可应用在制备检测遗传性直结肠癌的检测试剂中。一种遗传性结直肠癌易感基因检测用试剂盒，含有上述任一实施例所述的遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统。在其中一个实施例中，所述遗传性结直肠癌易感基因检测用试剂盒还包括dna提取试剂、pcr扩增试剂、和/或dna纯化试剂。一种遗传性结直肠癌易感基因的检测方法，包括如下步骤：使用上述任一实施例所述的遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统，以获取的基因组dna为模板进行多重pcr扩增；对多重pcr扩增的产物构建测序文库；对构建的测序文库进行高通量测序，并将测序结果比对到人类基因组参考序列上。在其中一个实施例中，所述构建测序文库依次包括：对多重pcr扩增的产物进行末端修复、末端加a、连接测序接头、文库扩增、对扩增后的文库进行纯化和片段筛选。在其中一个实施例中，所述人类基因组参考序列为hg19。在其中一个实施例中，所述遗传性结直肠癌易感基因的检测方法还包括对比对结果进行突变筛查分析和对筛选的突变进行功能注释的步骤。本发明经过研究发现，遗传性非息肉病性结直肠癌、家族性腺瘤性息肉和错构息肉综合征等具有家族易感性的癌症跟11个基因的家系突变有关，其中，遗传性非息肉病性结直肠癌的影响基因包括msh2、mlh1、pms2、msh6、epcam，其中mlh1占有害家系突变的50％，msh2占40％，msh6占7％～10％，pms2占<5％，epcam占1％，家族性腺瘤性息肉包括经典型fap和衰弱型fap，其影响基因包括apc、mutyh，错构息肉综合征包括幼年性息肉病、cowden综合征和peutzjeghers综合征，其影响基因包括bmpr1a、smad4、pten、stk11。本发明的遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统能同时检测结直肠癌相关的11个易感基因，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好，引物偏向性扩增的程度低，可提高检测效率，降低检测成本，并且可配合高通量测序技术，具有检测通量高、准确性和灵敏度高、重复性好等特点，对结直肠癌易感人群，尤其是具有结直肠癌家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。附图说明图1为具体实施例中293t-1文库2100结果；图2为具体实施例中293t-2文库2100结果。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1一、引物设计本实施例引物设计针对的目标区域为结直肠癌相关11个易感基因的编码外显子和外显子-内含子边界10碱基。因部分基因的最长编码外显子长达几千，单对引物无法扩增该长度的区域，且测序读长达不到该长度，所以需要将长度过大的外显子进行划分，分到多个pcr反应体系中进行。本实施例设计的遗传性结直肠癌易感基因检测多重pcr引物设计概况如表1所示。表1遗传性结直肠癌易感基因检测多重pcr引物设计概况二、实验材料本实施例涉及的细胞系293t来源于广州赛库生物技术有限公司，并按要求进行复苏、培养和传代。所有引物纯度达到电泳级(page)，不含杂带。主要试剂如：kodmuti&epi和2×pcrbufferforkod-muti&epi(toyobo，货号kme-101)、vahtsnanodnalibraryprepkitforillumina(诺唯赞，货号nd601-02)、vahtsdnaadaptersset1/set2forillumina(诺唯赞，货号n801-01)、vahtsdnacleanbeads(诺唯赞，货号n411-02)、hipureblood&tissuednakit(magen，货号d3018-03)等。主要仪器如：illuminanextseq500测序仪、agilent2100bioanalyzer、qubit荧光定量仪、pcr仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、移液器等。三、多重pcr扩增，文库构建和ngs测序将225对引物按设计方案混合成2个mix，以293t细胞系为标准品进行目标序列富集和文库构建，设2个重复，分别为293t-1和293t-2。(一).dna模板的多重pcr扩增1.引物加入灭菌纯化水溶解，终浓度为400nm。seqidno:1～seqidno:224所示的引物等物质的量混合，成为引物mix1，seqidno:225～seqidno:450所示的引物等物质的量混合，成为引物mix2。引物mix1/2的终浓度均为50nm。2.样本dna提取。使用hipureblood&tissuednakit，抽提293t细胞的dna。3.将同一待测样本分成a、b两管进行反应。扩增体系见下表2。表2试剂体积(μl)2×pcrbufferforkod-multi&epi10kod-multi&epi(1.0u/μl)0.4引物mix1/2(50μm)7.6dna样本(5ng/μl)2总体积20pcr扩增程序见下表3。表34.同一样本的pcr扩增产物等物质的量混合后，使用磁珠(来自vahtsdnacleanbeads(诺唯赞))进行纯化。(二).使用vahtsnanodnalibraryprepkitforillumina(诺唯赞)试剂盒，进行文库构建1.末端修复：把20μl的endprepmix和30μl的纯化后pcr扩增产物混合后，30℃孵育30min。2.使用磁珠对末端修复产物进行纯化。3.末端加a：把12.5μl的da-tailingmix和17.5μl的纯化后末端修复产物混合均匀后，37℃孵育30min，70℃孵育5min,4℃孵育5min。4.测序接头连接：往步骤3中的产物中加入2.5μl的ligationmix和2.5μl的dnaadapterx(来自vahtsdnaadaptersset1/set2forillumina(诺唯赞))，混合均匀后，30℃孵育10min。5.使用磁珠对接头连接产物进行纯化。6.文库扩增：使用纯化后的连接产物作为dna模板，进行pcr扩增。扩增体系见下表4。表4dna模板20μlpcrprimermix5μlamplificationmix225μl总体积50μl扩增程序见下表5。表57.使用磁珠对扩增后的文库进行纯化和片段筛选。(三).文库质检和测序1.使用qubit荧光定量仪对文库浓度进行定量。2.使用agilent2100bioanalyzer对文库质量进行质检。3.使用nextseq500测序仪对样本文库进行测序。四、实验结果和数据分析测序数据分析使用bwa软件与人类基因组参考序列hg19进行比对，用gatk工具软件对比对结果进行突变筛查分析(筛查条件：1、比对质量大于20；2、测序深度大于100)，用annovar软件对筛选的突变进行功能注释。293t-1和293t-2高通量测序文库2100分析的结果如图1、2。由图1和图2可以看出，最后产生了高质量的测序文库，且文库的长度分布与各自的设计预期相符。上述文库在illuminanextseq500进行上机测序，测序模式为pe150。对于测序数据，经过生物信息分析，一方面统计数据指标用于评价序列富集效果，另一方面进行单核苷酸多态性(snp)和短插入缺失(indel)突变检测，评估遗传性结直肠癌易感基因检测的可行性。表6测序数据统计如表6所示，目标区域大小约为32kb，本实施例的两个文库293t-1和293t-2测序产生了超过310万条read序列，测序数据量分别为470mb和660mb。测序数据中超过95％的短序列能够比对上基因组，比对上基因组的数据中97％以上比对到了目标区域，证明了多重pcr序列富集的高度特异性。此外，本实施例对目标区域序列的富集效果达到了100％覆盖度，并且目标区域平均测序深度达1万倍以上。本实施例仅需在2个pcr反应体系进行，一方面减少了实验操作步骤，同时也将样本起始量降低到了20ng(如表1所示)。本实施例的遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统的设计目的是为了对遗传性结直肠癌进行基因检测，即分析遗传性结直肠癌易感基因上是否存在功能性的突变，包括单核苷酸多态性(snp)和短插入缺失(indel)。测序数据突变分析在293t-1、293t-2、中均检测到15个snp，未检测到indel，两个结果的一致性100％。经过对这15个snp的进一步分析，其功能分类均属于正常多态性。综上，本发明的遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统是一种高效、可靠的高通量测序扩增用pcr引物系统，其能同时检测结直肠癌相关的11个易感基因，提高检测效率，且降低检测成本，还具有检测通量高、准确性和灵敏度高、重复性好等特点，对结直肠癌易感人群，尤其是具有结直肠癌家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。sequencelisting<110>广州永诺健康科技有限公司，广州永诺生物科技有限公司<120>遗传性结直肠癌易感基因检测用的多重pcr引物系统、检测方法和应用<130>2017<160>450<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>1ggagagaggacaaggagaggat22<210>2<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>2tgaggctatatccacaggccta22<210>3<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>3ctcttggcttgagtagggttcg22<210>4<211>21<212>dna<213>homosapiens<400>4gtctgcaaaggagctctgctt21<210>5<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>5ccaggagtcttgggtgtcttat22<210>6<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>6gatgagagcctctactttgggg22<210>7<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>7ctaccatggagaagacgggtag22<210>8<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>8ggcctcaaaatttggcctcatt22<210>9<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>9ggctgggcctaactattcaaac22<210>10<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>10tcccttctttgtctcatgggtc22<210>11<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>11gctttacaaacagcggttgaca22<210>12<211>27<212>dna<213>homosapiens<400>12tcactagccttgtcaaaaatgaaattg27<210>13<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>13agcatatgcacatttttagaattcca26<210>14<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>14agagatgttcagtgagcagagaa23<210>15<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>15atctccttttgtttctgctaacgatc26<210>16<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>16tcacaaagtatctttttctgtggctt26<210>17<211>25<212>dna<213>homosapiens<400>17ctcactcgataatctggatgactca25<210>18<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>18aattctcagatccaggaagaggaaag26<210>19<211>27<212>dna<213>homosapiens<400>19ctgtccttattttggatatttctccca27<210>20<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>20aacacacatcacatacatacaagtca26<210>21<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>21tgagctccatttgtagttatagctgt26<210>22<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>22tccttttccctttatgtttcttagga26<210>23<211>24<212>dna<213>homosapiens<400>23ctggtagcattagactcagatggg24<210>24<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>24gcccacatgggttaatttgcttt23<210>25<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>25aagtgaccccataattccattaaagc26<210>26<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>26caatcaataccttgctctctcaatgg26<210>27<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>27atgcacttgggtagatcttatgaaca26<210>28<211>31<212>dn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