一种水稻常用栽培品种香味基因badh2的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及水稻稻米香味控制基因badh2的snp分子标记、以及检测水稻稻米香味控制基因badh2的方法。

背景技术：

传统系谱法选育是水稻育种家们普遍采用的方法，通过育种家们的多年努力，培育和创制了大量高产、高抗和优质的水稻新品种。然而，结合表型鉴定的传统育种模式存在表型把控不准、遗传群体需求量大、人力成本高、育种周期长等缺陷，很难实现大规模商业化集成育种或材料遗传改良。伴随着分子生物学和生物信息学的发展，分子标记辅助选择育种(molecularassistedselectoin，mas)显现了巨大的技术优势，实现了遗传基础与目标性状的结合，选择含有目标基因的材料(单株)进行组配，实现了目标性状的精准改良，能有效回避传统育种方法的技术壁垒。

单个核苷酸变异(singlenucleotidepolymorphism，snp)在物种的基因组上广泛存在，包括：单个碱基的转换或颠换、单个碱基(片段)插入或缺失等形式，针对这些多态性位点逐步兴起了新一代的snp分子标记技术。针对控制目标性状的基因开发功能snp标记，将性状与基因型相关联进而实现高效、精准育种。现阶段，适用于snp检测的手段主要有凝胶电泳、荧光定量pcr和竞争性等位基因pcr(kompetitiveallelespecificpcr，kasp)。本发明所开发的标记适用于kasp方法检测snp位点，该方法已陆续应用于分子辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。

针对水稻稻米香味控制基因研究人员分离和克隆了badh2基因。该基因编码甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenasea)，能抑制水稻香米主要成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2-ap)的生物合成，当badh2基因功能缺失时，稻米中能积累2-ap，使水稻稻米具有香味。目前，香米受到广大消费者的青睐并体现出了巨大的商业前景，育种家们也致力于香稻品种的培育和材料遗传改良工作，目前主要育成品种包括：basmati系列、泰国香米系列、宜香系列和玉针香系列品种等。在香稻育种工作中，香稻的表型鉴定需要籽粒成熟后才能进行收种鉴定；同时，该基因为一个功能缺失型变异，在杂交配组过程中杂合型表现为非香味表型。这些因素都极大了限制了水稻稻米香味品质性状的育种和遗传改良进度，而且费时费力。因此，开发出适用于苗期高通量鉴定植株基因型的功能snp分子标记，助力大规模商业化分子育种具有广泛的应用前景和经济价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种常用水稻常见栽培品种香味基因badh2基因区间的snp分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种水稻稻米香味控制基因badh2的功能snp分子标记k_080503，其序列如seqidno.1所示，第62nt位点处的碱基为t或c。本发明经实验证实，上述分子标记位于香味控制基因badh2外显子区域，基因型与表型紧密相关。所检测47份材料中，含30份香稻，17份非香稻，其中非香稻品种(材料)不含badh2基因在标记k_080503测试位点碱基型为c，29份香稻品种(材料)含badh2基因在标记k_080503测试位点碱基型为t，1份香稻材料碱基型为c，经测试该材料为badh2基因其他位点的变异，为稀有变异。

本发明提供一种用于检测水稻稻米香味控制基因badh2的snp标记的引物及含有该引物的试剂盒，含有上述引物组合的试剂或试剂盒也在本发明的保护范围之内。

表1标记引物序列表

本发明提供了检测香稻品种(材料)的方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种用于检测水稻香味基因badh2的snp分子标记，针对基因内部的7号外显子区域存在的一个8bp的插入缺失，根据插入缺失序列末尾碱基设计snp标记，位于水稻第8号染色体第20382869位碱基处，该snp分子标记多态性为t/c。

本发明的上述snp分子标记可以通过两条特异性引物和一条通用引物检测得到，所述两条特异性引物的核苷酸序列如seqidno.3-4所述，所述通用引物的核苷酸序列如seqidno.5所述。

本发明提供了用于检测水稻稻米香味基因badh2的snp分子标记的特异性引物组合，包括：

(1)两条特异性引物：

primerx：5’-aaccataggagcagctgaag-3’；(seqidno.3)

primery：5’-aaccataggagcagctgaaa-3’(seqidno.4)；

(2)一条通用引物：primerc:5’-ggttgcatttactgggagtt-3’(seqidno.5)。

本发明提供了上述snp分子标记在鉴定香稻品种中的应用，包括以下步骤：

(1)提取待测水稻基因组dna；

(2)以水稻基因组dna为模板，利用上述特异性引物组合进行kasp反应检测，在两条特异性引物5’-端分别连接fam-tail:5’gaaggtgaccaagttcatgct-3’和vic-tail:5’gaaggtcggagtcaacggatt3’通用荧光标签序列；

(3)若只检测到引物primery所连荧光序列对应的荧光信号，则待测水稻为含香味基因badh2，若只检测到引物primerx所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测水稻不含香味基因badh2或不属于育种常用栽培香味水稻材料，若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带badh2基因的杂合型。

步骤(2)中kasp检测中pcr条件为：94℃15min；94℃20sec，65-57℃1min，每个循环降低1℃，共10个循环；94℃20sec，57℃1min，共26个循环。

选择检测到引物primery所连荧光序列对应的荧光信号的水稻样品进行育种。

所述荧光序列可为本领域常规使用的荧光序列，优选两个荧光颜色差异大的荧光序列。在本发明的一个具体实施方式中，选择使用fam和vic荧光序列分别连接在两条特异性引物的5’端。

本发明提供了检测水稻香味基因badh2基因型的方法，是利用本发明所述的特异性引物组合对待检水稻的基因组dna进行kasp检测，在引物primerx和引物primery的5’-端分别连接不同的通用荧光标签序列；若只检测到引物primery所连荧光序列对应的荧光信号，则待测水稻为香味水稻材料，其基因型为t，若只检测到引物primerx所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测水稻不属于育种常用栽培香味水稻材料，其基因型为c；若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带badh2基因的杂合型。

步骤(2)中kasp检测中pcr条件为：94℃15min；94℃20sec，65-57℃1min，每个循环降低1℃，共10个循环；94℃20sec，57℃1min，共26个循环。

含有本发明所述特异性引物组合的辅助鉴定水稻香味基因badh2的试剂盒属于本发明的保护范围。

本发明提供了上述特异性引物组合或含有其的试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。

本发明提供了上述特异性引物组合或含有其的试剂盒在培育香味水稻中的应用。

上述应用的实质为该分子标记的检测方法。其中，pcr反应程序与体系可采用本领域常规技术，本发明对此不另作限定。

本发明提供了上述snp分子标记在水稻育种中的应用，利用该分子标记及检测方法，选择携带香味基因badh2的水稻样品辅助后续育种工作。

本发明提供了一种用于检测水稻香味基因badh2的功能分子标记，可用于badh2基因的鉴定及辅助选择育种，对促进badh2基因商业化分子育种的应用具有重要意义。

badh2基因为一个功能缺失型变异，变异位点的移码突变使badh2基因失去功能，不能催化2-乙酰基-1-吡咯啉的氧化，使水稻稻米产生香味。关于该基因的变异位点不止发明中提到的位点，但该位点与常用育种材料和绝大部分香稻商业品种基因型一致。本发明应用kasp技术对所寻找到的snp分子标记进行基因分型，可以快速、精确的检测badh2基因，大幅提高基因转育的效率。且检测过程不需要酶切、电泳及测序等，操作简便，利于高通量快速检测，彻底杜绝了pcr产物的气溶胶污染和eb对环境的污染、甲醛对人体的危害。

附图说明

图1为水稻稻米香味控制基因badh2的snp分子标记的开发测试结果。

图2为两个f2分离群体香味基因k_080503标记的基因型检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中使用的lgcsnpline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国lgc公司。

实施例1水稻稻米香味控制基因badh2的snp分子标记的开发

badh2基因位于水稻8号染色体上物理位置：20379794-20386061区间内。当基因外显子区间发生移码突变，基因功能丧失，水稻稻米产生香味。针对香稻和非香稻材料见的变异位点，本发明发现在badh2基因的7号外显子区间存在一个突变位点，该位点包括一个8bp的缺失和2bp的突变，提取位点左右两侧各50bp序列，进行引物设计。本发明涉及的用于检测上述snp分子标记的引物组合为：

(1)两条特异性引物：

primerx：5’-aaccataggagcagctgaag-3’；(seqidno.3)

primery：5’-aaccataggagcagctgaaa-3’(seqidno.4)

(2)一条通用引物：

primerc:5’-ggttgcatttactgggagtt-3’(seqidno.5)

在两条特异性引物5’-端分别连接fam-tail:5’gaaggtgaccaagttcatgct-3’和vic-tail:5’gaaggtcggagtcaacggatt3’通用荧光标签序列。对待测水稻材料进行kasp反应。

选取47份自然遗传材料进行进行验证，包括30份香稻和17份非香稻材料。材料标记分型结果显示：29份香稻基因型为t，17份非香稻材料基因型为g，仅一份香稻基因型为g。进一步经过实验证实，这份材料为badh2的另一个位点变异，将其归纳为稀有突变材料，不是常见栽培香稻品种和育种材料基因型。47份测试材料标记分型结果见表2，初步确定了标记与表型具有高度关联性。

若只检测到引物primery所连荧光序列对应的荧光信号，则待测水稻为含香味基因badh2，若只检测到引物primerx所连荧光序列对应的荧光信号，则判定待测水稻不含香味基因badh2或不属于育种常用栽培香味水稻材料，若同时检测到两种荧光，则判断水稻样品为携带badh2基因的杂合型。

表247份自然遗传材料snp标记测试结果

实施例2水稻稻米香味控制基因badh2的snp分子标记的应用

1、针对本发明所述的分子标记设计利用kasp反应可高通量的对水稻材料进行badh2香味基因检测，采用实施例1设计的引物组合。

2、采用简化ctab法，从水稻叶片中提取基因组dna。

(1)将水稻叶片冻干或烘干，取适量叶片放入2.0ml离心管中，加入两粒钢珠，于组织研磨仪上磨碎；

(2)加入750μlctab溶液，震荡匀浆，65℃震荡温浴0.5-1h；

(3)冷却至室温，在通风橱中加入750μl氯仿︰异戊醇(24︰1)颠倒3-4次混匀；

(4)12000rmp离心10min，取上清500μl转移至新的1.5ml离心管中；

(5)加入等体积异丙醇溶液轻摇混匀，于-20℃沉淀1小时以上，12000rmp离心10min，弃上清；

(6)加入1ml70％乙醇，轻弹沉淀，1000rmp离心3min，弃上清；

(7)加300μlh2o，溶解备用。

3、kasp反应测试：

kasp反应测试在lgcsnpline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入1.0-1.5μl的20ng/μldna样品，烘干后加入kasp反应混合液，反应体系见表3；pcr扩增在水浴热循环仪中完成，反应条件为94℃15min；94℃20sec，65-57℃1min，每个循环降低1℃，共10个循环；94℃20sec，57℃1min，共26个循环；反应完成后利用扫描仪pherastar对kasp反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。

表3香味基因badh2snp分子标记pcr扩增反应体系

实施例3snp标记的分离群体表型验证

对本发明中的标记进行表型验证，具体步骤如下：

1、参照实施例2中的方法，检测供体亲本玉针香与受体材料habataki、sasanishiki杂交的f2分离群体单株基因型；

2、在水稻成熟期收取纯合基因型单株种子并晒干，用砻谷机打米，获得糙米样品备用；

3、取2g糙米样品，放在50ml离心管中，加入10ml1.7％koh溶液，盖紧盖子，浸泡10min左右，期间颠倒混匀几次；

4、将离心管盖子打开，用鼻子轻轻嗅样品是否有香味散发出，实验对照包括双亲亲本材料、标准香味品种紫香糯和非香味品种广陆矮4号；

5、至少需3名嗅觉灵敏的人员同时进行测试，分别记录自己的判定结果，汇总三人的测试结果，对有不同意见的样品进行重复实验或找第四人进行鉴定。

两个f2分离群体单株表型鉴定结果与基因型分型结果高度对应，t碱基型单株具有香味，c碱基型单株无香味，再次验证了本发明的可行性和准确性(表4)。

表4两个f2分离群体香味基因snp标记k_080503的表型验证结果

注：“+”表示表型鉴定有香味；“-”表示表型鉴定无香味。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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<110>华智水稻生物技术有限公司

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