一种Ⅲ型鸭甲型肝炎病毒鸡胚化弱毒株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物病毒领域，具体涉及到一种ⅲ型鸭甲型肝炎病毒鸡胚化弱毒株及其应用。
背景技术：
：鸭病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(duckhepatitisavirus，dhav)感染引起的，主要危害雏鸭的一种严重的疾病。临床上可以导致感染鸭出现肝脏肿大、出血、坏死等症状，具有发病急、传播速度快、病程短及死亡率高等特点，主要感染5周龄以内的雏鸭。鸭甲型肝炎病毒(dhav)在分类学上属小rna病毒科(picornaviridae)，禽肝炎病毒属(avihepatovirus)。病毒粒子呈球形，呈二十面体对称，直径大小约22～30nm，无囊膜，主要由蛋白衣壳和核酸构成，基因组为不分节段的单股正链rna，分子大小约为7.7kb。到目前为止，已报道有3个不同血清型的dhav，分别为血清1型(dhav-1)、血清2型(dhav-2)和血清ⅲ型(dhav-3)，不同型的dhav之间的血清交叉反应目前尚不完全清楚，但dhav-1与dhav-3之间无交叉中和作用。dhav-2仅报道于台湾地区，与dhav-1与dhav-3之间的交叉反应目前未见有报道。技术实现要素：本发明为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种ⅲ型鸭甲型肝炎病毒鸡胚化弱毒株及其应用，本发明制备的鸭病毒性肝炎ⅲ型活疫苗，能有效的预防ⅲ型鸭甲型肝炎。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明提供的技术方案之一：一种ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)鸡胚化弱毒株hb80，保藏号为：cctccno：v201727；分类命名为：ⅲ型鸭甲型肝炎病毒；保藏时间是：2017年6月15日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心，其vp1基因核苷酸序列如seqidno.1所示。上述的，ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)鸡胚化弱毒株hb80，通过鸭胚分离、传代致弱并进行spf鸡胚适应获得的弱毒株。上述的，ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)鸡胚化弱毒株hb80，使用spf鸡胚进行培养，且在spf鸡胚上增殖稳定、纯净。上述的，ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)鸡胚化弱毒株hb80，耐受冻融，且在-20℃保存15个月病毒含量没有下降。上述的，ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)鸡胚化弱毒株hb80，在雏鸭体内连续继代5代不发生毒力返强。本发明提供的技术方案之二：前述保藏号为：cctccno：v201727的ⅲ型鸭甲型肝炎病毒鸡胚化弱毒株在制备鸭病毒性肝炎ⅲ型活疫苗上的应用。本发明提供的技术方案之三：一种用于预防鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，包括保藏号为：cctccno：v201727的ⅲ型鸭甲型肝炎病毒鸡胚化弱毒株和兽用生物制品可接受的冻干保护剂，经冷冻真空干燥制成。本发明具有以下优点：1、本发明制备的鸭病毒性肝炎ⅲ型活疫苗，能有效的预防ⅲ型鸭甲型肝炎。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明及其特征、外形和优点将会变得更明显。在全部附图中相同的标记指示相同的部分。并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本发明的主旨。图1为dhav-3hb80株pcr检测结果，其中m为dnamaker；1为阴性对照；2为dhav-3引物扩增hb80株结果。图2为dhav-3hb80株和其他几株dhavvp1的进化树。序列表说明：seqidno.1为本发明为本发明dhav-3hb80株vp1基因核苷酸序列，长度为720bp。具体实施方式在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。为了彻底理解本发明，将在下列的描述中提出详细的步骤以及详细的结构，以便阐释本发明的技术方案。本发明的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。为了解我国鸭病毒性肝炎的流行情况，对湖北、江苏、山东等主要养鸭地区疑似鸭病毒性肝炎的病料进行rt-rcr鉴定，以区分流行株的基因型。采集临床样本65份，分别用dhav-1和dhav-3特异性引物进行rt-pcr检测。结果检出dhav-1阳性样品10份，占15.4％；dhav-3阳性样品49份，占75.4％；阴性样品6份，占9.2％。表明dhav-3是我国近年来主要流行的基因型。中国作为一个传统的养殖大国，随着科技的发展，养殖技术的进步，已经由传统的散户养殖逐渐发展成为集约化、规模化的大养殖场养殖模式，疾病的发生也由零星、散发变为集中爆发，因此，做好免疫防控工作是现代养殖业的重中之重。目前市场上并无预防dhav-3的商品化活疫苗，国内主要使用蛋黄抗体来预防，但是蛋黄抗体作用期短，在鸭养殖周期内需反复使用，带来很多问题。所以开发dhav-3活疫苗研究，迫在眉睫。参照图1-图2所示，本发明提供了一种ⅲ型鸭甲型肝炎病毒(dhav-3)鸡胚化弱毒株hb80，保藏号为：cctccno：v201727；分类命名为：ⅲ型鸭甲型肝炎病毒；保藏时间是：2017年6月15日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心。实施例1dhav-3hb80株的来源1.1病毒分离2008年，在湖北某鸭场3～20日龄北京鸭发生一种临床表现疑似鸭病毒性肝炎的疾病，死亡鸭肝脏肿大出血，有树枝状出血点或出血斑。无菌取病死鸭肝脏，加生理盐水研磨制成匀浆，冻融后离心10分钟，取上清液，过滤除菌。将滤液经尿囊腔接种10日龄鸭胚5枚，0.1ml/枚，37℃孵育。收获死亡鸭胚的尿囊液，按同样方法接种鸭胚传代2次。3代鸭胚全部死亡，且死亡时间一致，剖检死亡鸭胚可见胚体水肿、出血，肝出血或有白色坏死点。1.2中和试验鉴定取死亡鸭胚尿囊液稀释100倍，分别与等量dhav-1抗血清和等量dhav-3抗血清混合，作为血清中和组；另设病毒对照组，与等量无菌生理盐水混合，均置37℃作用1小时，每组经尿囊腔接种鸭胚10枚，0.2ml/枚；同时设空白对照组10枚。置37℃孵育，鸡胚存活情况见表1。结果表明，分离病毒为dhav-3病毒，命名为dhav-3hb株。表1血清中和试验鉴定结果组别接种物/剂量存活数/试验数dhav-1血清中和组鸭胚；0.2ml0/10dhav-3血清中和组鸭胚；0.2ml10/10病毒对照组鸭胚；0.2ml0/10空白对照组鸭胚；不接种10/101.3病毒的传代致弱将dhav-3hb株稀释10倍经尿囊腔接种鸭胚5枚，0.1ml/枚，37℃孵育，收获死亡鸭胚的尿囊液，按相同方法进行传代，至75代。同时收获第25、45、55和75代次鸭胚胎儿作为组织毒，各经颈部皮下注射10只2日龄鸭，0.5ml/只。接种后3日对雏鸭进行剖检，结果第55代组织毒接种雏鸭后，雏鸭全部健活，剖检无肉眼可见变化。试验结果见表2。试验结果表明，dhav-3hb株经鸭胚连续传代55代后对雏鸭安全。表2不同代次鸭胚组织毒接种雏鸭安全性试验代次肝脏肿大出血脾肿大肾出血第25代有有有第45代有有有第55代无无无第75代无无无1.4鸡胚适应性试验取dhav-3hb株第75代鸭胚组织毒，经绒毛尿囊膜接种spf鸡胚10枚，0.2ml/枚。收获死亡鸡胚的绒毛尿囊膜和胎儿，高速匀浆，记为第76代鸡胚组织毒；将第76代鸡胚组织毒按上述方法传至第80代，即为dhav-3hb80株。实施例2dhav-3hb80株vp1序列比对分析2.1rt-pcr取hb80株鸡胚组织毒，按照rna提取试剂盒操作说明书进行病毒rna提取，并按反转录试剂盒操作说明书进行反转录，然后取反转录产物进行pcr。所需引物序列如下，理论扩增长度为720bp。dhav-3f：5’-ggtgattccaatcagcttggcg-3’dhav-3r：5’-ttcaatttctagatggagctc-3’用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行鉴定，结果见图1，在约720bp处出现了特异性的dna条带。2.2序列测定将电泳出特异性条带的扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与gen-bank收录的其他dhav毒株的vp1基因序列进行比对，并分析遗传进化关系。结果见seqidno.1dhav-3hb80株vp1序列。hb80株vp1基因与dhav-3代表毒株在同一分支上，遗传关系较近。实施例3dhav-3hb80株的稳定性3.1增殖稳定性把已经鉴定好的dhav-3hb80株在spf鸡胚上连续传代10代，对第81代、85代、90代病毒含量、收获量和纯净性进行检测和统计，结果见表3。结果显示，用dhav-3hb80株连续传代10代，胚死亡时间比较一致，病毒含量稳定，表明dhav-3hb80株在spf鸡胚上增殖稳定。表3dhav-3hb80株传代结果3.2冻融稳定性将dhav-3hb80株置-20℃反复冻融3次，同时设置对照组，不进行冻融，同时测定病毒含量，结果见表4。结果显示，dhav-3hb80株在-20℃反复冻融3次，病毒含量没有显著下降，表明dhav-3hb80株耐受冻融。表4dhav-3hb80株-20℃反复冻融3次病毒含量测定结果3.3保存稳定性将dhav-3hb80株置于-20℃保存，于保存后0、3、6、12、15个月分别进行病毒含量测定，结果见表5。结果显示，dhav-3hb80株置-20℃保存15个月，病毒含量没有明显下降。表5dhav-3hb80株保存稳定性保存时间(月)0361215病毒含量(deld50/0.1ml)107.17107.32107.0107.0107.17实施例4dhav-3hb80株的安全性4.1对雏鸭的安全性试验取dhav-3hb80株毒种，用无菌生理盐水稀释10倍，经颈部皮下注射1日龄雏鸭20只，0.5ml/只，另设空白对照组20只。连续观察14日，雏鸭均健活，精神及食欲正常，结果见表6。表6疫苗接种临床观察结果分组毒种稀释倍数健活数/试验数临床症状免疫组1020/20精神、食欲正常空白对照组/20/20精神、食欲正常4.2毒力返强试验将dhav-3hb80株毒种接种1日龄雏鸭，0.5ml/只，接种后3日取5只剖检，采集肝脏混合研磨，将其作为第1代回归病毒液接种1日龄雏鸭5只，如此共传5代。将第5代回归病毒液接种雏鸭10只，至7日剖检并进行组织病理学检测。试验结果：将dhav-3hb80株在雏鸭上连续继代5代，所有代次雏鸭均健活，无临床症状；对继代鸭进行剖检和病理组织学检测，肝、脾、肾、胰、脑等脏器无病理变化和病理组织学损伤。表明dhav-3hb80株不发生毒力返强。实施例5dhav-3hb80株免疫原性检验取dhav-3hb80株毒种，用无菌生理盐水稀释500倍，经颈部皮下接种1日龄鸭15只，0.5ml/只。另取15只作攻毒对照。7日后，用强毒进行攻击，观察7日，雏鸭存活情况见表7。免疫组存活14只，攻毒对照组存活2只，疫苗对雏鸭的保护率为93.3％。表7疫苗免疫原性测定结果分组试验数(只)毒种稀释倍数存活数/试验数保护率免疫组1550014/1593.3％攻毒对照组15/2/1513.3％以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。序列表<110>上海创宏生物科技有限公司<120>一种ⅲ型鸭甲型肝炎病毒鸡胚化弱毒株及其应用<141>2017-09-14<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>720<212>dna<213>鸭甲型肝炎病毒(3型)<400>1ggtgattccaatcagcttggcgatgatgaaccagtgtgttttctcaactttgagactgca60aatgtgccaatacaaggggagtcacacactttggtgaaacatctttttggtcgtcaatgg120ctggttcgtactgttcaacatactagtgaggtacaagagttggatttgccagtacctgac180cagggtcacgcatctctgttgcgcttctttgcctacttctctggagaagtgattctgacc240attgtcaataatggaacaacaccatgcatggttgcacactcttatacaatggacaatctc300acttctgaatatgctgtcactgccatggggggtattcttatcccagcaaactctgccaag360aatattaatattccattttattctgttacacctttacgccccacacgacccatgccagca420tttcaggggggtggtttgacttttggcaggttgtatatttggacacaatcaggaagcgtt480tctgtttttatgggcctccacaagccagctttattttttccactgcctgcaccaacttac540acaacacacacacagttgaataacattgaaaccatgaatctgcataatcaatcagatcag600ccagactgccacctgtgtaagatttgcaagaaaatgaagaaatggtctcgcaatcatcgc660ccatttcgcttctgtttgagacttaaaacacttgcctttgagctccatctagaaattgaa720当前第1页12