一种胎盘血NK细胞的培养方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，具体而言，涉及一种胎盘血nk细胞的培养方法。
背景技术：
：nk细胞又称为自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，分布于外周血、肝脏及脾脏，少量分布于淋巴结及其他组织中，占外周血淋巴细胞的5％～15％，是重要的免疫细胞。nk细胞是身体初期防御的重要机构，具有强力的细胞毒活性。同时发挥免疫调节作用，快速提升免疫力和康复质量科学家在1975年首次鉴定到了nk细胞，这类细胞能够在缺少t、b细胞的情况下直接杀伤肿瘤细胞。与具有细胞毒性的cd8+t细胞不同，nk细胞杀伤肿瘤细胞时不需要预先致敏可以直接杀伤mhc阴性的肿瘤细胞，这使得nk细胞在过继细胞免疫治疗中被广泛应用。但nk细胞在外周血淋巴细胞中所占的比例较低，所以有必要建立一种nk细胞体外扩增技术，用于研究nk细胞的功能并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。目前人们对于脐带血的应用比较广泛，但对于胎盘血的应用很少。近年来，有人采用基因工程的方法在k562细胞上同时表达il-15、cd137l等分子,并以此细胞来刺激nk细胞的增殖。或者使用磁珠筛选cd56-细胞等方法培养nk细胞。上述方法在操作条件和成本上都较高，为nk细胞的临床使用造成了一定的困难。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种胎盘血nk细胞的培养方法，操作简便，成本低，可以得到大量满足临床使用标准的nk细胞，为胎盘血nk细胞的应用提供良好的基础。胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘血的采集量一般在150ml以上，最多可以采集250ml，可采集量高于脐带血。胎盘血中富含原始造血干细胞，其数量和质量与骨髓媲美，数量高于脐带血中造血干细胞含量。本发明利用胎盘血中提取的单核细胞，培养所需细胞，为胎盘血的应用提供了可能。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种胎盘血nk细胞的培养方法，包括以下步骤：包被有cd16单抗的培养容器中接种由胎盘血分离得到的pbmc细胞，培养，培养体系是以vivo-15基础培养基为基础添加以下成分：以培养体系的体积计，fbs50±2μl/ml，il-2500±10iu/ml，il-122.5±0.2ng/ml，il-1520±2ng/ml；培养4-4.5天，接种于包被有cd16单抗的培养容器中扩培，扩培培养体系是以gt-t581基础培养基为基础添加以下成分：以扩培培养体系的体积计，fbs50±2μl/ml，il-2500±10iu/ml，il-122.5±0.2ng/ml，il-1550±2ng/ml；所述扩培至少一次。本发明提供的胎盘血nk细胞的培养方法，特定选用在不同的基础培养基上添加相应的组分进行初始培养和扩培，操作简便，成本低，有效得到大量满足临床使用标准的nk细胞，为胎盘血nk细胞的应用提供良好的基础。进一步地，所述包被有cd16单抗的培养容器均采用以下方法制备：以培养面积为25cm2计，加入含有3±1μg的cd16单抗和1±0.2ml的d-pbs，包被3.5h～4.5h。该包被在细胞培养条件下进行。进一步地，包被有cd16单抗的培养容器中接种由胎盘血分离得到的pbmc细胞步骤中，pbmc细胞在培养容器中的密度为0.5×106个/ml-2.0×106个/ml。如在不同的实施例中，pbmc细胞在培养容器中的密度可以为0.5×106个/ml、1×106个/ml、1.5×106个/ml、2.0×106个/ml等等。进一步地，所述胎盘血采用ficoll密度梯度分离得到pbmc细胞。进一步地，每次扩培的倍数为2-5倍。如在不同的实施例中，每次扩培的倍数可以为2倍、3倍、4倍、5倍以及这些数值之间的任意一个数值的倍数等等。进一步地，每次扩培的倍数为2-3倍。进一步地，所述扩培的次数为2-4次。如在不同的实施例中，扩培次数可以为2次、3次、4次等等。进一步地，所述扩培的次数为3-4次。本发明发现，以3倍的扩培倍数扩培3次，能够有效的得到符合临床要求的nk细胞。进一步地，培养体系均以培养面积为25cm2计，培养体系的体积为5-9ml。如在不同的实施方式中，培养面积为25cm2，培养体系的体积可以为5ml、6ml、7ml、8ml、9ml等等。如在不同的实施方式中，培养面积为75cm2，培养体系的体积可以为15ml、20ml、22ml、25ml、27ml等等。如在不同的实施方式中，培养面积为175cm2，培养体系的体积可以为35ml、40ml、45ml、50ml、55ml、58ml、60ml、63ml等等。进一步地，每次扩培培养时间为3-3.5天。本发明中，培养条件均为37℃、5％co2，饱和湿度。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明提供的胎盘血nk细胞的培养方法，采用特定组分的培养基以及添加特定的营养因子，能有效的激发nk细胞的有效扩增，得到的nk细胞满足临床使用标准。(2)本发明提供的胎盘血nk细胞的培养方法，总体细胞增殖倍数多，均在80倍以上，得到较多量的满足临床使用标准的nk细胞，(3)本发明提供的胎盘血nk细胞的培养方法，操作简便，成本低，便于推广和应用。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例1培养得到的nk细胞表面标志物进行检测的结果图；图2为本发明实施例1培养得到的nk细胞另一个表面标志物进行检测的结果图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1一种胎盘血nk细胞的培养方法，步骤如下：1.1胎盘血nk细胞培养基1)基础培养基：vivo-15，gt-t581；2)添加物：fbs，il-2，il-12，il-15，cd16单抗；1.2胎盘血nk细胞方法1)包被：取t25培养瓶，加1mld-pbs，加3μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。2)pbmc分离：ficoll密度梯度法分离提取得到pbmc细胞。3)用vivo-15培养基调整细胞密度为约1×106/ml接种到包被过的t25培养瓶中，5ml/瓶。4)第0天加fbs250μl，加il-2：2500iu，il-12：12.5ng，il-15：100ng。5)第4天，包被1个t75培养瓶，加3mld-pbs，加9μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t75瓶，倒去包被液，将t25瓶中细胞转移到t75培养瓶中，补充15mlgt-t581培养基，使培养基总量为20ml，按最终培养体积补加il-2：10000u，il-12：50ng，il-15：1μg，fbs：1ml。6)第7天包被3个t75培养瓶，每瓶加3mld-pbs，加9μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t75瓶，倒去包被液，将之前t75瓶中细胞分别均匀的转移到3个t75培养瓶中，每瓶加14mlgt-t581培养基，按20ml培养基，体系分别加il-2、il-12、il-15和fbs。7)第10天包被3个t175培养瓶，每瓶加10mld-pbs，加30μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t175瓶，倒去包被液，将之前t75瓶中细胞分别均匀的转移到3个t175培养瓶中，每瓶加40mlgt-t581培养基，按60ml最终体积加入il-2、il-12、il-15和fbs。8)第14天收获细胞，统计细胞数量。得到的细胞进行流式检测，结果如图1和图2所示。统计的结果如表1所示。表1细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)405细胞总数扩增倍数81本发明提供的方法具有以下优势：1.通过本方法培养的胎盘血nk细胞，细胞可以增殖81倍，加大初始培养量，可以满足临床使用细胞数量。2.通过本方法培养的胎盘血nk细胞，流式检测结果(图1和图2)，cd3-cd56+nk细胞比例为36.42％，cd4+cd25+treg细胞比例为1.23％，nk细胞比例正常，免疫抑制细胞比例很低，满足临床使用标准。实施例2一种胎盘血nk细胞的培养方法，步骤如下：1.1胎盘血nk细胞培养基1)基础培养基：vivo-15，gt-t581；2)添加物：fbs，il-2，il-12，il-15，cd16单抗；1.2胎盘血nk细胞方法1)包被：取t25培养瓶，加1mld-pbs，加3μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。2)pbmc分离：用ficoll密度梯度分离提取pbmc细胞。3)用vivo-15培养基调整细胞密度为约0.6×106/ml接种到包被过的t25培养瓶中，5ml/瓶。4)第0天加fbs260μl，加il-2：2500iu，il-12：13.5ng，il-15：90ng。5)第4天，包被1个t75培养瓶，加3mld-pbs，加9μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t75瓶，倒去包被液，将t25瓶中细胞转移到t75培养瓶中，补充15mlgt-t581培养基，使培养基总量为20ml，按最终培养体积补加il-2：10000u，il-12：50ng，il-15：1μg，fbs：1ml。6)第7天包被3个t75培养瓶，每瓶加3mld-pbs，加9μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t75瓶，倒去包被液，将之前t75瓶中细胞分别均匀的转移到3个t75培养瓶中，每瓶加14mlgt-t581培养基，按20ml培养基，体系分别加il-2、il-12、il-15和fbs，同上。7)第10天包被3个t175培养瓶，每瓶加10mld-pbs，加30μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t175瓶，倒去包被液，将之前t75瓶中细胞分别均匀的转移到3个t175培养瓶中，每瓶加40mlgt-t581培养基，按60ml最终体积加入il-2、il-12、il-15和fbs，同上。8)第14天收获细胞，统计细胞数量。经统计和检测，细胞总数以及nk细胞扩增倍数同实施例1基本一致。本方法培养的胎盘血nk细胞，流式检测结果，nk细胞比例正常，免疫抑制细胞比例很低，可以满足临床使用标准。实施例3一种胎盘血nk细胞的培养方法，步骤如下：1.1胎盘血nk细胞培养基1)基础培养基：vivo-15，gt-t581；2)添加物：fbs，il-2，il-12，il-15，cd16单抗；1.2胎盘血nk细胞方法1)包被：取t25培养瓶，加1mld-pbs，加3μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。2)pbmc分离：用ficoll密度梯度分离提取pbmc细胞。3)用vivo-15培养基调整细胞密度为约2×106/ml接种到包被过的t25培养瓶中，5ml/瓶。4)第0天加fbs250μl，加il-2：2500iu，il-12：12.5ng，il-15：100ng。5)第4天，包被1个t75培养瓶，加3mld-pbs，加9μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t75瓶，倒去包被液，将t25瓶中细胞转移到t75培养瓶中，补充15mlgt-t581培养基，使培养基总量为20ml，按最终培养体积补加il-2：10000u，il-12：50ng，il-15：1μg，fbs：1ml。6)第7天包被3个t75培养瓶，每瓶加3mld-pbs，加9μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t75瓶，倒去包被液，将之前t75瓶中细胞分别均匀的转移到3个t75培养瓶中，每瓶加14mlgt-t581培养基，按20ml培养基，体系分别加il-2、il-12、il-15和fbs。7)第10天包被3个t175培养瓶，每瓶加10mld-pbs，加30μgcd16单抗，放入37℃培养箱包被4h。取出t175瓶，倒去包被液，将之前t75瓶中细胞分别均匀的转移到3个t175培养瓶中，每瓶加40mlgt-t581培养基，按60ml最终体积加入il-2、il-12、il-15和fbs。8)第14天收获细胞。经统计和检测，细胞总数以及nk细胞扩增倍数同实施例1基本一致。通过本方法培养的胎盘血nk细胞，流式检测结果，nk细胞比例正常，免疫抑制细胞比例很低，可以满足临床使用标准。对比例1与实施例1不同的是，vivo-15培养基的初始培养以及gt-t581培养基的扩培中，额外的组分只添加il-2。统计以及检测不同的细胞数，结果如下。表2细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)105细胞总数扩增倍数21对比例2与实施例1不同的是，vivo-15培养基的初始培养以及gt-t581培养基的扩培中，额外的组分只添加il-2和il-12。统计以及检测不同的细胞数，结果如下。表3细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)115细胞总数扩增倍数23对比例3与实施例1不同的是，vivo-15培养基的初始培养以及gt-t581培养基的扩培中，额外的组分只添加il-15和il-21，il-21的浓度为500iu/ml。统计以及检测不同的细胞数，结果如下。表4细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)150细胞总数扩增倍数30对比例4与实施例1不同的是，vivo-15培养基的初始培养以及gt-t581培养基的扩培中，额外的组分只添加il-2、il-15和il-21，il-21的浓度为500iu/ml。统计以及检测不同的细胞数，结果如下。表5细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)245细胞总数扩增倍数49对比例5与实施例1不同的是，整个培养过程中，基础培养基均为vivo-15培养基。统计以及检测不同的细胞数，结果如下。表6细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)265细胞总数扩增倍数53对比例6与实施例1不同的是，整个培养过程中，基础培养基均为gt-t581培养基。统计以及检测不同的细胞数，结果如下。表7细胞总体扩增信息0天胎盘血pbmc总数(×106)5第14天收获细胞总数(×106)240细胞总数扩增倍数58从上述内容可以看出，本发明提供的胎盘血nk细胞的培养方法，能有效的扩增nk细胞，方法简便，更好的满足临床的需求。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12