基于纳米金的复合超分子水凝胶作为生物医药材料的应用的制作方法

本发明涉及一种水凝胶的制备方法及应用，更具体地说，涉及一种丙烯酰胺和丙烯酰基甘氨酰胺复合多巴胺-金纳米粒子的共聚物(paam-pnaga-aunps-pda)水凝胶的制备方法及应用，具有高度稳定性、温敏性，热塑性和光热转化性等功能，作为乳腺癌术后填充材料，在近红外光调控下防止乳腺癌的复发和转移。

背景技术：

水凝胶是以水为分散介质，亲水性而又不溶于水的且能够吸收大量水分(通常含水量大于总质量的50％)具有交联结构的高分子聚合物材料。因为聚合物链间的物理交联和化学交联作用而不会溶解于水中，只能溶胀且保持一定的形状，同时，还具有良好的水渗透性，生物相容性，作为人体植入物可以减少不良反应。因而水凝胶作为优良的生物医用材料得到广泛应用。刺激-响应性水凝胶可通过刺激来改变水凝胶结构或性质，从而达到多功能响应的目的，是现阶段研究热点。近红外响应型水凝胶是一种有具有广泛应用前景的刺激-响应性水凝胶，能够通过精确控制光源的辐照强度、辐照时间及照射位点实现多方面的响应目的。

近红外刺激响应性水凝胶是受到近红外光照射后可发生体积转变或相转变的智能水凝胶，该水凝胶属于光刺激响应型水凝胶，光刺激响应型纳米水凝胶可在光辐照的情况下作用于人体特定部位，因其不直接接触刺激部位，避免介入式损伤的性质，可以作为远程控制释放系统(liw,wangj,renj,qux.3dgrapheneoxide-polymerhydrogel:near-infraredlight-triggeredactivescaffoldforreversiblecellcaptureandon-demandrelease.adv.mater.2013,25,6737-6743)。传统光刺激响应型水凝胶含光活性基团如偶氮苯、螺吡喃、三苯甲烷等的光响应性聚合物，这些活性基团受到光照后构型发生变化或形成带电荷的基团，导致聚合物分子链的构象或亲疏水性发生变化，引起纳米水凝胶发生体积相转变(lim-h,kellerp.stimuli-responsivepolymervesicles.softmatter.2009,5,927-937)。然而，引发这类光刺激响应性纳米水凝胶发生体积相转变的光为紫外光或蓝光，这些波长较短的光会对生物组织或细胞产生一定的伤害，在临床应用中受到很大限制。而传统近红外响应材料的报道集中在氧化石墨烯、纳米金、碳纳米管、聚化咯等，但这些材料由于细胞毒性，光热转换效率低等问题限制了其在生物医学领域的应用(zhangz,wangj,niex,etal.nearinfraredlaser-inducedtargetedcancertherapyusingthermoresponsivepolymerencapsulatedgoldnanorods.j.am.chem.soc.2014,136,7317-7326)。

丙烯酰基甘氨酰胺(naga)，由于其聚合物分子链的侧链上带有两个酰胺基团，分子间产生强烈的氢键作用，从而形成的物理交联网络使得凝胶具有很好的力学强度和韧性，并且由于这种由双酰胺基团形成的氢键可以在较高温度下实现破坏和重建，将亲水性单体丙烯酰胺与naga共聚之后，凝胶具有高临界溶解温度，可以发生凝胶-溶胶转变，赋予了超分子凝胶的温敏性和可注射性能。金纳米粒子具有优异的光学性能，当入射光的波长与自由电子的振动频率发生共振耦合时，就会产生表面等离子体共振(lspr)，在紫外可见光谱上显示强的吸收峰(liz-marzánl,tailoringsurfaceplasmonsthroughthemorphologyandassemblyofmetalnanoparticles.langmuir,2006,22,32-41.)。通过控制粒子的大小、形状、组成、结构、自组装及其包覆层，金纳米粒子均可表现出不同的光学性质。近年来，通过对贻贝粘附于固体表面现象的研究，聚多巴胺作为一个新型涂层材料被广泛应用于生物医学领域。正因为聚多巴胺表面含有丰富的官能团，使得其在细胞成像、自由基清除、药物输送、肿瘤的诊断和光热治疗等诸多方向发挥了一定的功能(liu,y,aik,lul.polydopamineanditsderivativematerials:synthesisandpromisingapplicationsinenergy,environmental,andbiomedicalfields.chem.rev.2014,114,5057-5115.)。多巴胺包覆的金纳米粒子通过改变光折射率和吸收光的协同效应，大大提高了光热转换效率，而聚多巴胺可以通过迈克尔加成反应将纳米粒子固定在凝胶网络中，提高了纳米粒子在凝胶中的稳定性。

乳腺癌是现今最常见的女性恶性肿瘤之一，其发病率每年都保持上升趋势，且乳腺癌已居全球女性癌症发病率首位(siegelr,maj,zou,zcancerstatistics.cacancerjclin,2014,64,9-29)。虽然，近年来随着现代医学的发展，乳腺癌手术切除术显著降低了乳腺癌的死亡率，但是乳腺癌的复发和转移问题仍然未能有效的解决，成为了临床治疗工作上最大的困难和挑战。目前，临床上的术后治疗方式仍然是以口服药物为主，其低作用率和药物的副作用都未能达到有效的治疗效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供基于纳米金的复合超分子水凝胶作为生物医药材料的应用，以丙烯酰基甘氨酰胺(naga)和丙烯酰胺(aam)为单体，负载多巴胺-金纳米粒子的纳米复合超分子水凝胶，这种基于纳米金的复合超分子水凝胶除了表现出水凝胶的一些固有属性，还具有良好的生物相容性、温敏性，可注射性和光热转换性。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

基于纳米金的复合超分子水凝胶，由共聚水凝胶和多巴胺包覆的金纳米粒子组成，其中：共聚水凝胶由丙烯酰胺、丙烯酰基甘氨酰胺在水相中共聚形成，且水相中分散多巴胺包覆的金纳米粒子，通过水相中共聚以使多巴胺包覆的金纳米粒子分散固定在共聚水凝胶中。

在进行制备时，将丙烯酰胺，丙烯酰基甘氨酰胺、引发剂和多巴胺包覆的金纳米粒子在水相中均匀分散，通过引发剂引发将丙烯酰胺和丙烯酰基甘氨酰胺上碳碳不饱和键进行聚合，在绝氧条件下通过自由基聚合反应制备共聚水凝胶并使多巴胺包覆的金纳米粒子分散固定在共聚水凝胶中。

丙烯酰胺、丙烯酰基甘氨酰胺的质量比为(1—3)：(5—10)，优选(1—2)：(5—6)。在水相中，固含量为10—25％，优选15—20％(即丙烯酰胺、丙烯酰基甘氨酰胺的投料质量与水质量的比例，mg/mg)。

进行制备水凝胶时，引发剂用量为两种共聚单体质量之和的3％-10％，优选5—10％，引发剂选择高分子聚合领域中常用的水相条件下的热引发剂，如过硫酸铵(aps)、过硫酸钾(kps)，或者光引发剂，如2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(irgacure1173)。选择热引发剂，则需要首先利用惰性气体(如氮气、氩气或者氦气)排除反应体系中的氧，以避免其的阻聚作用，然后根据引发剂的活性和用量，将反应体系加热到所用引发剂的引发温度之上并保持相当长的时间，如1h以上或者更长(1-5h)，以促使引发剂能够长时间产生足够多的自由基，引发反应体系持续发生自由基聚合反应，最终制备本发明的水凝胶。选择光引发剂，其中引发剂选择了光引发剂2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮(irgacure1173)，选用透明密闭的反应容器，在紫外光照射的条件下引发自由基聚合，由于光引发效率高于热引发，因根据所选引发剂的活性和用量调整照射时间时，照射时间可短于热引发的加热时间，如20分钟或者更长(30min-1h)，相对于热引发这样可以使得实验时间大大减少。

多巴胺包覆的金纳米粒子粒径为10—20nm，多巴胺包覆的金纳米粒子在水相中的质量百分数为1—10wt％，优选2—5wt％。

多巴胺包覆的金纳米粒子通过种子生长方法进行制备，以柠檬酸钠为还原剂和原料氯金酸反应制备纳米金，经离心弃上清之后加入ph8—8.5tris缓冲液，将多巴胺溶解在上述含金纳米粒子的溶液中超声搅拌，通过多巴胺的氧化自聚包裹在金纳米粒子表面形成核壳结构的多巴胺包覆金纳米粒子。在种子生长方法中，重复柠檬酸钠和氯金酸进行多步反应，以控制生成金纳米粒子的粒径；通过多巴胺含量的调整以实现多巴胺包覆层厚度的调整。

本发明的技术方案中，以丙烯酰胺(aam)和丙烯酰基甘氨酰胺(naga)为单体，制备的水凝胶，其分子链的侧链上的酰胺基团可以产生强烈的分子间的氢键作用，提供了稳定的物理交联网络，作为一种有效的动态可逆的凝胶网络，实现水凝胶在一定温度下的凝胶-溶胶转变。利用过硫酸铵(aps)引发剂提供的自由基不仅可以引发aam和naga单体发生反应，还可以促进多巴胺进一步自聚，同时聚多巴胺可以与聚丙烯酰胺上的氨基发生迈克尔加成反应，将纳米粒子固定在凝胶网络之中，

在制备方案中，在反应结束后，从反应容器中取出共聚物，去除未参加反应的单体、引发剂、交联剂和溶剂后，浸泡在水中直至达到溶胀平衡(如浸泡7天，每天为24小时，每隔12h更换一次水，达到溶胀平衡)。

基于纳米金的复合超分子水凝胶为近红外响应型材料的应用，溶胶—凝胶转变温度为50—55摄氏度，以激光强度2mw/cm²，波长808nm对凝胶进行照射，在照射10min后，温度提升至溶胶—凝胶转变温度以实现凝胶—溶胶转变。

基于纳米金的复合超分子水凝胶作为生物医药材料的应用，作为细胞支架的应用，在制备治疗乳腺癌药物中的应用，作为乳腺癌术后填充材料，在近红外光调控下防止乳腺癌的复发和转移。

本发明提供的一种温敏性纳米复合水凝胶是以丙烯酰胺(aam)和丙烯酰基甘氨酰胺(naga)为原料，复合多巴胺-金纳米粒子，在引发剂存在下引发制备而成，由于氢键和纳米粒子的协同作用，这种水凝胶具有温敏性，光热性和可注射性，并且具备很好的生物相容性。在发明方案中，将小鼠右胸乳腺接种小鼠乳腺癌细胞，并在肿瘤生长之后进行手术切除，之后将凝胶注射到术后切除部位，通过近红外光照射调节凝胶的填充形状及光热性能，使凝胶有效贴合于术后空腔并在局部高温下杀死癌细胞防止乳腺癌的复发和转移。

附图说明

图1是本发明中的几种金纳米粒子的透射电镜照片，其中金纳米粒子：a)10nm，b)20nm，聚多巴胺包裹后金纳米粒子：c)10nm，d)20nm。

图2是本发明中paam-pnaga和paam-pnaga-aunps-pda水凝胶的傅里叶红外谱图，其中1为paam-pnaga-aunps-pda，2为paam-pnaga。

图3是本发明中不同粒径纳米粒子的紫外吸收光谱谱图。

图4是本发明中含不同纳米粒子的水凝胶随时间的光热转化图(即凝胶光热转换曲线)。

图5是本发明中不同水凝胶的流变性能检测图，在固定频率和应变随温度变化的流变学检测：a)pnaga-aam；b)pnaga-aamaunps；c)pnaga-aamaunps-pda。

图6是本发明pnaga-aam-aunps-pda水凝胶在2mw/cm²，波长808nm激光照射下随时间的凝胶-溶胶转变示意图。

图7是本发明paam-pnaga-aunps-pda水凝胶的细胞毒性测试结果示意图。

图8是本发明不同水凝胶在小鼠乳腺癌术后填充部位随激光照射的热成像图。

图9是本发明中不同水凝胶的凝胶溶胀度。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

利用种子生长法合成了不同粒径的金纳米粒子，以10nm粒径为例。将150ml2.2mm柠檬酸钠溶液加热15min至沸腾，加入1ml25mm的氯金酸溶液，反应10min。待溶液变为酒红色之后，冷却至90℃，加入1ml60mm柠檬酸钠溶液和1ml25mm氯金酸溶液，反应30min，得到10nm粒径的纳米金。之后重复上述步骤即可得到不同粒径的金纳米粒子，如之后继续加入1ml25mm的氯金酸和150ml2.2mm柠檬酸钠溶液重复上述步骤3次即可得到20nm的金纳米粒子。将新合成的金纳米粒子溶液离心10min，弃上清分散到去1ml离子水中。加入2mg多巴胺盐酸盐，搅拌溶解之后用tris缓冲液调节ph至8.5，超声搅拌30min，之后离心收集沉淀，得到多巴胺包覆的核壳结构的纳米粒子。将按照相同的步骤得到10nm和20nm的金纳米粒子，包裹多巴胺之后进行紫外可见光吸收测试，取1ml纳米粒子水溶液超声分散均匀，在200-1000nm的波长范围内以1nn/s的速度测试吸光度以及吸收峰。如附图1所示，金纳米粒子粒径为10nm，20nm，经聚多巴胺包裹后金纳米粒子仍能保持较好的分散情况。aunps—x表示金纳米颗粒，x为金纳米粒子的粒径；aunps-pda-x表示多巴胺包裹金纳米粒子，x为金纳米粒子的粒径。如附图3所示，粒径为10nm和20nm的金纳米粒子在520nm处出现吸收峰，而多巴胺包裹之后的纳米粒子吸收峰发生了红移，并出现两个吸收峰，且红移距离随纳米粒子尺寸的增大而增大。其中aunps-pda-20分别在560nm和780nm处出现吸收峰，其特征峰均处在近红外区，且距离激光波长范围更近，可以表现出更加优异的光热转化效率。考虑到近红外光响应及光热转化效率，之后我们采用20nm的金纳米粒子作为最终的纳米粒子尺寸。

以丙烯酰胺(25mg)和丙烯酰胺基甘氨酰胺(125mg)为单体，溶解在质量百分数2wt％的纳米粒子水溶液(多巴胺包覆金纳米粒子质量/多巴胺包覆金纳米粒子和水的质量之和)中，加入引发剂过硫酸铵(aps)15mg。混合液经充氮气除氧后，将混合液注入密闭的模具中，模具在室温固化12h以保证充分引发自由基聚合。随后打开模具取出凝胶，在去离子水浸泡3—4天(每天为24小时)，达到溶胀平衡，每隔12h更换上述去离子水。按相同步骤利用不同粒径的纳米粒子得到纳米复合凝胶，进行光热转化，流变测试，凝胶-溶胶转变等实验过程。凝胶样品命名为paam-pnaga-aunps-pda-x，其中x代表的是金纳米粒子的粒径，具体详见下表：

将上述制备的paam-pnaga和paam-pnaga-aunps-pda凝胶进行红外光谱检测，paam-pnaga凝胶的特征峰为：v＝3448cm^-1(nh)，2927cm^-1(ch)，1647cm^-1(c＝o)。paam-pnaga-aunps-pda凝胶的特征峰为：v＝3426cm^-1(nh)，2924cm^-1(ch)，1639cm^-1(c＝o)，1258cm^-1(c-n)。在paam-pnaga-aunps-pda凝胶中出现了新的1258cm^-1特征峰，这是聚多巴胺的苯环上的c-n伸缩振动峰，证实pda与aam发生了迈克尔加成反应，将纳米粒子固定在凝胶网络中，如附图2所示。

采用如下方法对本发明的纳米复合水凝胶的进行流变测试，将烘干后的圆柱形凝胶称重的到初始重量之后浸泡到37℃去离子水中，每间隔一定的时间之后，取出水凝胶，并用滤纸轻轻擦拭凝胶表面带有的水分，然后立刻在微量天平上对其进行称量，记录下质量，每组测量三个试样。凝胶的溶胀度用一下公式进行计算：

其中mwet和mdry为凝胶的湿重和干重，如附图9所示。pnaga-aam，pnaga-aam-aunps和pnaga-aam-aunps-pda水凝胶均在泡水5天(每天为24小时)之后达到溶胀平衡，其中含有纳米粒子的pnaga-aam-aunps和pnaga-aam-aunps-pda水凝胶溶胀度有所下降，主要是由于纳米粒子分散在凝胶网络中增加了凝胶的交联程度，网络更加致密。而未加多巴胺包裹的pnaga-aam-aunps相比pnaga-aam-aunps-pda水凝胶，其吸水速率增大，主要是金纳米粒子的自由扩散使水更容易进入聚合物网络，而多巴胺交联的水凝胶将纳米粒子固定在网络中，得到更加致密的三维网络。

采用如下方法测试本发明的纳米复合水凝胶在近红外光下的光热转化性能：取直径10mm，高8mm的圆柱状样品放置在比色皿中，将温度传感器放置在凝胶中，利用2w/m²的功率(激光强度2mw/cm²，波长808nm)对凝胶进行照射，测试凝胶温度随时间的变化规律。其在照射10min后，温度提升50℃，且凝胶可以完全变为溶胶。为了更形象地表述凝胶的光热转化性能，详见说明书附图4。

采用如下方法对本发明的纳米复合水凝胶的进行流变测试，测试样品的尺寸为直径3cm，厚度1mm的圆片，采用压缩模式测试温度范围为30-70℃之间的g’和g‘’数值，固定应力15pa，固定频率1hz，目的是保证测试处于线性范围内。升温速率控制为0.1±0.05℃。这种纳米复合水凝胶在50℃时，储能模量和损耗模量出现交点，证实发生凝胶-溶胶转变，详见说明书附图5。固定频率和应变随温度变化的流变学检测：a)pnaga-aam；b)pnaga-aamaunps；c)pnaga-aamaunps-pda。三种凝胶随着温度的升高，储能模量(g′)和损耗模量(g″)均出现交点，代表凝胶具有凝胶-溶胶转变温度(或ucst)，其ucst温度分别为58℃，52℃和55℃。当g′＞g″时，呈现凝胶态，而当g′＜g″时，呈现溶胶态。这主要是温度升高会导致氢键的断裂，交联密度降低，而温度降低之后，氢键重新恢复。在加入纳米粒子之后，凝胶的ucst降低，主要是由于纳米粒子随温度的升高，自由运动的频率加剧，导致氢键更快断裂。

利用如下方法检测本发明的纳米复合水凝胶在近红外光下的凝胶-溶胶转变，制备直径为10mm，厚8mm的凝胶，在2mw/cm²的近红外光照下，观察凝胶形态的变化。凝胶在照射1min时温度达到40℃凝胶开始变软并开始发生变形，发生部分凝胶溶胶转变，照射5min后可以从凝胶态完全变为溶胶态。待冷却至室温之后，溶胶又可以恢复到凝胶，证实凝胶具备良好的热塑性和可注射性，详见说明书附图6。

利用如下方法检测本发明的纳米复合水凝胶的细胞毒性。为了测试这种纳米复合超分子水凝胶应用于生物材料可能性，将各种不同的凝胶片切成直径为10mm，厚0.5mm的圆片，在75％的酒精中浸泡2h使其消毒，然后用pbs洗涤，这些凝胶放入到48孔板的底部。将2ml的l929细胞悬浮液(5×10⁴cells/ml)种入到48孔板中，培养24小时。然后将细胞培养基吸出，加入80μl噻唑蓝溶液(5mg/ml)和320μl无血清细胞培养基，培养4小时后，吸出溶液，用pbs冲洗3次，然后加入300μl二甲基亚砜，将结晶物质溶解，最后通过酶标仪测定490nm波长处的吸光度，实验结果以采用未经处理的空白细胞作为对照组，最终的细胞存活率的计算公式为样品吸光度/对照组吸光度×100％。同样为了降低误差，我们对每个复合比例进行了三个孔的平行实验，取平均值以及偏差作为测量结果。实验结果表明了这种凝胶具有很好的生物相容性，可以作为细胞支架等生物材料的应用，如附图7所示。

利用如下方法检测本发明的纳米复合水凝胶的乳腺癌术后填充效果，将10⁶个4t1细胞(江苏凯基生物技术股份有限公司)注射到balb/c小鼠的右胸乳腺，待肿瘤生长到200mm³时，将肿瘤切除。之后将纳米复合水凝胶注射到术后空腔部位，通过近红外光照射改变凝胶形状使其跟更加贴合填充部位。填充24h之后对填充部位激光照射5min，通过热成像机观察，该凝胶温度可以达到50℃，足以杀死组织中残余的肿瘤细胞。对比注射pbs的空白组，温度仅仅升高了2.3℃，而复合金纳米粒子的凝胶可达到43℃，但填充48h和72h之后，通过激光照射后温度仅能达到40℃和37℃，而纳米复合凝胶的光热性能没有发生变化，依旧可以达到之前的温度。实验结果证明这种纳米复合水凝胶的光热性能优异，且纳米粒子在凝胶中可以稳定存在，是一种优异的近红外响应性凝胶，详见说明书附图8。利用如下方法评价治疗乳腺癌复发效果，在手术填充之后，每天激光照射5min，于4周后将老鼠处死，考查肿瘤复发情况，其中分为空白无处理组，激光照射无填充组，凝胶填充激光照射组，6只一组，最后的复发结果分别为5只，4只，1只，该结果证实这种纳米复合水凝胶可以有效防止乳腺癌的复发。将具有近红外响应的纳米复合水凝胶注射到术后部位，通过近红外光照射可调控填充凝胶的形状以及光热效果，作为一种适宜的填充材料并通过光热作用杀死癌细胞，可以有效控制乳腺癌的复发和转移。

根据本发明内容进行制备工艺参数的调整均可实现复合水凝胶的制备，且均表现出近红外性能，与实施例基本一致。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。