枯草芽孢杆菌DDT98806及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及到采用枯草芽孢杆菌ddt98806和应用。

背景技术：

多环芳烃,是由两个或两个以上的苯环以线形排列、弯接或簇聚的方式构成的有机化合物，也是最早发现且数量最多的致癌物,全世界每年排放到大气中的约几十万吨。由于自身的疏水性及低水溶性,该类物质能很快沉积到环境中,并且随着苯环数量的增多,脂溶性增强,在环境中存在的时间延长,遗传毒性增高。滴滴涕，是一种氯代衍生物，属于典型的有机氯农药，主要用作杀虫剂，杀虫谱广、残效长，尤其对棉铃虫、粗虫和红铃虫效果显著，广泛在棉花和果蔬上使用。但滴滴涕在自然条件下极不易分解，在土壤中的残留期限为4～30年，难溶于水，耐热耐酸，具有脂溶性、生物毒性和生物累积性等特点，因此滴滴涕在我国已经禁用多年，但滴滴涕在土壤和水系等环境中广泛存在，在空气、土壤、河流、地下水、植物和野生动物体内都能够检测到，且残留浓度仍然居高不下，远超过国家相应的污染标准。

目前，国内外报道的有关于多环芳烃污染的处理方法及滴滴涕污染的处理方法，其中包括物理、化学和生物方法。物理、化学处理成本高，易造成二次污染，对土壤等有干扰和破坏效应。生物处理技术具有成本低、效率高、一般很少造成二次污染。

在修复多环芳烃和滴滴涕有机物污染土壤技术领域，当前徐迫切解决的一个技术问题是提供一种修复效果好、无二次污染的微生物菌剂。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种枯草芽孢杆菌ddt98806。

本发明所要解决的另一个技术问题在于为枯草芽孢杆菌ddt98806提供一种新用途。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ddt98806，于2018年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccm2018706，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，序列为：

上述的枯草芽孢杆菌ddt98806在制备枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂中的用途，该复合菌剂为：在1g的固体复合菌剂中，含有菌落数为1.5×10⁹～4.5×10⁹cfu枯草芽胞杆菌ddt98806、菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌ddt98801。

枯草芽孢杆菌ddt98806菌落呈灰白色，菌落圆形，表面有皱褶，粗糙不规则。

土曲霉霉菌(aspergillusterreus)ddt98801，保藏日期为2017年11月22日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为cctccno：m2017710，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，已在专利公开号为cn108130281a的中国专利中公开。

土曲霉菌ddt98801菌落呈土黄色，边缘白色，中央部分绒毛状且稍凸起，表面呈细密放射状沟纹，背面暗黄色。随着培养时间的延长，绒毛状凸起逐渐变平，形成粉末状孢子。分生孢子梗较短，无色，产孢结构双层，生于半球形顶囊上半部，分生孢子头开始为球形，继而呈紧密的柱形，分生孢子球形，直径为2～2.5μm。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有滴滴涕污染土壤中的用途。其使用方法由以下步骤组成：

(1)对污染土壤进行预处理

将含有滴滴涕的混合有机污染土壤敲碎，充分混匀，用塑料薄膜和周围未污染土壤隔离。

(2)制备芽孢杆菌和土曲霉菌固体复合菌剂

菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌ddt98801菌剂的配制方法如下：

按照常规方法制备菌落数为1.5×10⁹～4.5×10⁹cfu/g的芽孢杆菌ddt98806固体菌剂；制备菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌ddt98801固体菌剂，按芽孢杆菌菌剂与土曲霉菌菌剂的质量比为1：1混合制备成芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂。

上述的菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌菌剂的制备方法如下：

取尿素5g、酵母粉2g、nacl0.4g、kh2po410g、mgso4·7h2o5g、feso4·7h2o0.3g、znso4·7h2o0.3g、k2hpo45g、cacl20.004g，加蒸馏水搅拌溶解，调节ph为6.5，用蒸馏水定容到1000ml，配制成土曲霉菌液体培养基；用灭菌蒸馏水配制浓度为2.0～5.0×10⁶个孢子/ml的孢悬液，将20ml孢悬液加入到上述土曲霉菌培养基中，28℃、160转/分钟培养3天；

将麸皮与草炭按3:7的质量比混匀，在混合物中加入磷酸缓冲液浸泡，调ph为6.0，121℃灭菌30分钟，将麸皮-草炭与液体菌剂按质量比10:1混合,加入磷酸缓冲液使其含水量为20％，28℃培养8天，制备成土曲霉菌ddt98801固体复合菌剂，备用；

取尿素5、酵母粉2g、nacl0.4g、kh2po410g、mgso4·7h2o5g、feso4·7h2o0.3g、znso4·7h2o0.3g、mnso4·h2o0.005g、k2hpo45g、cacl20.004g、乙醇17ml、甘油50ml、吐温802ml，加蒸馏水搅拌溶解，调节ph为6.5，用蒸馏水定容到1000ml，配制成土曲霉菌培养基；用蒸馏水配制成浓度为2.0～5.0×10⁶个孢子/ml的孢悬液，将20ml孢悬液加入到土曲霉菌培养基中，28℃、160r/min培养3天。

按麸皮与草炭按质量比为3:7比例混匀，在混合物中加入磷酸缓冲液浸泡，测量上清液，调ph为6.0，121℃灭菌30分钟，按麸皮草炭与液体菌剂质量比为10:1加入上述培养好的液体菌剂,加入磷酸缓冲液使其含水量为20％，28℃培养时间8天，制备成枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801固体复合菌剂，备用。

(3)对含有滴滴涕污染土壤进行生物修复

向步骤(1)预处理后的土壤中分别接入枯草芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂，枯草芽孢杆菌与土曲霉菌复合菌剂的接种量为25g/kg～75g/kg，再加入尿素、k2hpo4/kh2po4、有机肥料，使得土壤中c：n：p元素的质量比为100：10：1，调ph为4.5～6.5，加水至土壤的含水率达15％～30％，混匀，将污染土壤的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤的含水率稳定，25～30℃处理21～35天。

在本发明的对含有滴滴涕污染土壤进行修复步骤(3)中，所述的向步骤(1)预处理后的土壤中分别接入芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂，芽孢杆菌与土曲霉菌复合菌剂的接种量最佳为50g/kg，再加入尿素、k2hpo4、有机肥料，使得土壤中c：n：p元素的质量比为100：10：1，加水至土壤的含水率最佳为20％，混匀，调ph为4.5～6.5，将污染土壤的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤的含水率稳定，25～30℃处理21～35天。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有萘污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有芴污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有菲污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有蒽污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有荧蒽污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

本发明的有益效果如下：

采用枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂对滴滴涕、萘、芴、菲、蒽、荧蒽污染土壤进行修复实验，实验结果表明：经21～35天，污染土壤中滴滴涕的降解率为80.99％，对萘、芴、菲、蒽、荧蒽的降解率分别为89.00％、69.50％、71.81％、75.66％、63.22％。枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂对污染土壤修复的降解率比单一菌剂对污染土壤修复的降解率提高了30％。

附图说明

图1是芽孢杆菌ddt98806随时间增长对土壤中多环芳烃和滴滴涕的降解图。

图2是土曲霉菌ddt98801随时间增长对土壤中多环芳烃和滴滴涕的降解图。

图3是芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂对土壤中多环芳烃和滴滴涕的降解图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，但是本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ddt98806，于2018年10月23日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccm2018706，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。

上述的枯草芽孢杆菌ddt98806的提取方法由下述步骤组成：

(1)富集

称取中国浙江省嘉兴市农药厂水沟采集的土壤样品，加入到富集液体培养基中，土壤样品与富集液体培养基的质量体积比为1：10，150r/min、37℃恒温摇床中振荡48小时培养，得到培养液；

上述富集液体培养基是在每升无机盐液体培养基中添加15mg滴滴涕，其中无机盐液体培养基是每升蒸馏水中含(nh4)2so40.2g、kh2po41.0g、k2hpo41.0g、cacl20.08g、feso40.002g、mgso40.4g，调ph值为7.0；

(2)分离纯化

将步骤(1)得到的培养液80℃水浴加热15分钟，用无菌水进行梯度稀释，依次得到稀释10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶倍的菌悬液，用移液枪吸取100μl不同稀释倍的菌悬液用涂布棒分别涂布于富集固体培养基上，富集固体培养基中含20g/l琼脂，每个稀释倍的菌悬液进行三个重复，放于恒温培养箱中37℃培养，用接种环挑取生长快速、颜色单一的单菌落划线培养于牛肉膏蛋白胨培养基平板中，放于恒温培养箱37℃培养1～2天，重复操作，反复分离培养，直至得到纯化的菌株，根据纯化菌株的菌落形态、生长速度、显微形态将相同的菌株合并；

(3)纯化菌株复筛

将步骤(2)纯化的菌株划线于含20mg/l滴滴涕的无机盐固体培养基上，无机盐固体培养基中含有20g/l琼脂，于37℃的恒温培养箱中培养1～2天，挑选生长良好的单菌落，鉴定，命名为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)ddt98806。

实施例2

实施例1的枯草芽孢杆菌ddt98806在制备枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂中的用途，该复合菌剂为：在1g的固体复合菌剂中，含有菌落数为1.5×10⁹～4.5×10⁹cfu枯草芽胞杆菌ddt98806、菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌ddt98801。土曲霉霉菌(aspergillusterreus)ddt98801，保藏日期为2017年11月22日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为cctccno：m2017710，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，已在专利公开号为cn108130281a的中国专利中公开。

按照常规方法制备菌落数为1.5×10⁹～4.5×10⁹cfu/g的芽孢杆菌ddt98806固体菌剂；制备菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌ddt98801固体菌剂，将芽孢杆菌菌剂与土曲霉菌菌剂的质量比为1：1混合制备成芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂。

上述的制备菌落数为2.5×10⁹～5.5×10⁹cfu/g的土曲霉菌ddt98801菌剂的方法如下：

取尿素5g、酵母粉2g、nacl0.4g、kh2po410g、mgso4·7h2o5g、feso4·7h2o0.3g、znso4·7h2o0.3g、k2hpo45g、cacl20.004g，加蒸馏水搅拌溶解，调节ph为6.5，用蒸馏水定容到1000ml，配制成土曲霉菌液体培养基；用灭菌蒸馏水配制浓度为2.0～5.0×10⁶个孢子/ml的孢悬液，将20ml孢悬液加入到上述土曲霉菌培养基中，28℃、160转/分钟培养3天；

将麸皮与草炭按3:7的质量比混匀，在混合物中加入磷酸缓冲液浸泡，调ph为6.0，121℃灭菌30分钟，将麸皮-草炭与液体菌剂按质量比10:1混合,加入磷酸缓冲液使其含水量为20％，28℃培养8天，制备成土曲霉菌ddt98801固体复合菌剂，备用；

取尿素5g、酵母粉2g、nacl0.4g、kh2po410g、mgso4·7h2o5g、feso4·7h2o0.3g、znso4·7h2o0.3g、mnso4·h2o0.005g、k2hpo45g、cacl20.004g、乙醇17ml、甘油50ml、吐温802ml，加蒸馏水搅拌溶解，调节ph为6.5，用蒸馏水定容到1000ml，配制成土曲霉菌培养基；用蒸馏水配制浓度为2.0×10⁶～5.0×10⁶个孢子/ml的孢悬液，将20ml孢悬液加入到土曲霉菌培养基中，28℃、160转/分钟培养3天。

按麸皮与草炭3:7质量比例混匀，在混合物中加入磷酸缓冲液浸泡，测量上清液，调ph为6.0，121℃灭菌30分钟，按麸皮草炭与液体菌剂的质量比为10:1混合，加入磷酸缓冲液使其含水量为20％，28℃培养时间8天，制备成枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801固体复合菌剂，备用。

实施例3

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有滴滴涕污染土壤中的用途。其使用方法由以下步骤组成：

(1)对污染土壤进行预处理

将含有滴滴涕的污染土壤敲碎，充分混匀，用塑料薄膜和周围未污染土壤隔离。

(2)对含有滴滴涕污染土壤进行修复

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

向步骤(1)预处理后的土壤中分别接入芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂，芽孢杆菌与土曲霉菌复合菌剂的接种量为50g/kg，再加入尿素、k2hpo4/kh2po4缓冲液、有机肥料，使得土壤中c：n：p元素的质量比为100：10：1，调ph为4.5～6.5，加水至土壤的含水率为20％，混匀，将污染土壤的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤的含水率稳定，25～30℃处理35天，处理具体时间根据污染土壤中所含污染物的量在21～35天内选取。

采用本实施例的芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂对含有滴滴涕污染土壤进行修复，降解率为80.99％。

实施例4

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有萘污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

采用本实施例的芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂对含有萘污染土壤进行修复，降解率为89.00％。

实施例5

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有芴污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

采用本实施例的芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂对含有芴污染土壤进行修复，降解率为69.50％。

实施例6

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有菲污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

采用本实施例的芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂对含有菲污染土壤进行修复，降解率为71.81％。

实施例7

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有蒽污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

采用本实施例的芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂对含有蒽污染土壤进行修复，降解率为75.66％。

实施例8

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂在修复含有荧蒽污染土壤中的用途。其使用方法与含有滴滴涕污染土壤的修复方法相同。

采用本实施例的芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂对含有荧蒽污染土壤进行修复，降解率为63.22％。

实施例9

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

在以上的实施例3～8的对含有滴滴涕污染土壤进行修复步骤(2)中，向步骤(1)预处理后的土壤中分别接入芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂，芽孢杆菌与土曲霉菌复合菌剂的接种量为25g/kg，再加入尿素、k2hpo4/k2hpo4缓冲液、有机肥料，使得土壤中c：n：p元素的质量比为100：10：1，调ph为4.5～6.5，加水至土壤的含水率达15％，混匀，将污染土壤的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤的含水率稳定，25～30℃处理21～35天。

其它步骤与实施例2相同。

实施例10

制备芽孢杆菌和土曲霉固体复合菌剂的方法与实施例2相同。

在以上的实施例3～8的对含有滴滴涕和多环芳烃污染土壤进行修复步骤(2)中，向步骤(1)预处理后的土壤中分别接入芽孢杆菌与土曲霉菌固体复合菌剂，芽孢杆菌与土曲霉菌复合菌剂的接种量为75g/kg，再加入尿素、k2hpo4、有机肥料，使得土壤中c：n：p元素的质量比为100：10：1，调ph为4.5～6.5，加水至土壤的含水率达30％，混匀，将污染土壤的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤的含水率稳定，25～30℃处理21～35天。

其它步骤与实施例2相同。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例2制备的枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801固体复合菌剂(简称为复合菌剂)与枯草芽孢杆菌ddt98806(简称为枯草芽孢杆菌)、土曲霉菌ddt98801(简称为土曲霉菌)进行了对比实验，各种实验情况如下：

1、复合菌剂与枯草芽孢杆菌、土曲霉菌对含有滴滴涕和有机污染物土壤的降解对比实验实验时采用的枯草芽孢杆菌为实验1、土曲霉菌为实验2、复合菌剂为实验3，未添加任何菌剂为实验4(对照组)。

取不含有机污染物的干净土壤，自然阴干，过1mm筛，剔除其中的大块物质。121℃灭菌20分钟，在250ml三角瓶中分装100g上述干净的灭菌土壤，添加滴滴涕使其浓度为20mg/kg，添加多环芳烃萘、芴、菲、蒽、荧蒽使其浓度为80mg/kg。按照实施例2的步骤进行实验。通过gc-ms测定各处理组中的滴滴涕及其多环芳烃的含量。其中每组实验做三个重复，取其平均值，降解率按下式进行计算：

实验和计算结果见表1。

表1各处理组的条件及其降解效率

实验结果表明：处理35天后，枯草芽孢杆菌ddt98806菌剂对土壤中萘、芴、菲、蒽、荧蒽的降解效率分别为60.00±2.5％、40.22±2.4％、48.1±1.0％、50.11±1.9％、37.05±1.0％，对滴滴涕的降解效率为42.55±1.9％。土曲霉菌ddt98801菌剂对土壤中萘、芴、菲、蒽、荧蒽的降解效率分别为70.00±3.5％、50.1±2.9％、53.5±1.5％、69.11±3.6％、52.05±2.1％，对滴滴涕的降解效率达60±1.9％。使用枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂对土壤中萘、芴、菲、蒽、荧蒽的降解效率分别为89.00％、69.50％、71.81％、75.66％、63.22％，对滴滴涕的降解效率达80.99％。本发明使用的土曲霉菌ddt98801和芽孢杆菌ddt98806复合菌剂比单一菌剂对多环芳烃和滴滴涕的降解效率提高了30％。

2、复合菌剂的接种量对修复含有污染物土壤降解率的影响

实验时采用的枯草芽孢杆菌和土曲霉菌复合菌剂的不同添加量分别为实验1、实验2、实验3、实验4，实验1、实验2、实验3、实验4的接种量分别是50、40、25、75，见表2。

取不含有机污染物的干净土壤，自然阴干，过1mm筛，剔除其中的大块物质。121℃灭菌20分钟，在250ml三角瓶中分装100g上述干净的灭菌土壤，添加滴滴涕使其浓度为20mg/kg，添加萘、芴、菲、蒽、荧蒽使其浓度为80mg/kg。按照实施例2的步骤进行实验。通过气相色谱质谱测定各处理组中的滴滴涕及其多环芳烃的含量。其中每组实验做三个重复，取其平均值，降解率按下式进行计算：

实验和计算结果见表2。

表2复合菌剂的接种量对降解效率的影响

实验结果表明：复合菌剂接种量为50g/kg时，对土壤中的有机污染物的降解效果最好。

综上所述，枯草芽孢杆菌ddt98806和土曲霉菌ddt98801复合菌剂对有机污染土壤的降解效率显著提高，特别是对难降解的滴滴涕有较好的降解效果。

序列表

<110>嘉兴益方环境科技有限公司

<120>枯草芽孢杆菌ddt98806及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1486

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<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)

<400>1

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<213>土曲霉菌(aspergillusterreus)

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