解淀粉芽孢杆菌GUAL210及其应用的制作方法

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌gual210及其应用，属于生物防治技术领域。

背景技术：

烟草黑胫病和烟草青枯病是我国烟草生产中最具破坏性的土传病害，每年造成巨额经济损失，贵州省是我国烟草生产的主要产区之一，烟草土传病害的发生也尤为严重，每年由病害造成的经济损失将近亿元，严重影响烟农的经济收入。目前生产上该病害的防治主要采取种植抗(耐)病品种及栽培防治为主、药剂防治为辅的综合防治措施，但生产实际中仍未有合适的抗(耐)土传病害的优良品种。因此，目前大多采用化学防治方法控制病害。目前药剂防治依赖甲霜灵、农用链霉素等化学农药，由于可供选择药剂品种少，主用药剂的使用年限长，病原菌的抗药性逐年增加，农药残留及环境污染等负面效应也逐步增加。因此，生物防治近年来已发展成为烟草病害防治研究的热点领域。

使用芽孢杆菌进行植物病害的防治是目前生物防治研究的热点领域之一，芽孢杆菌具备了产业化的前提条件，适应性广；作用机制多样，不易产生抗药性；发酵周期短，生产成本低；能形成芽孢、易储运；环境友好，对人畜安全，因此利用芽孢杆菌开发生防制剂成为生防制剂开发的重要方向。对于烟草土传病害(烟草黑胫病和烟草青枯病)生防芽孢杆菌的筛选国内外也有一些学者进行了尝试。此外，贵州地区烟草黑胫病和烟草青枯病常常混合发生，目前还未有文章报道筛选了同时可以防治这两种病害的芽孢杆菌。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种解淀粉芽孢杆菌gual210，可同时防治烟草黑胫病和烟草青枯病，以及防治辣椒炭疽病，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一株解淀粉芽孢杆菌gual210，该菌种已于2018年12月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2018871，名称为：解淀粉芽孢杆菌gual210(bacillusamyloliquefaciensgual210)。

本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌gual210在同时防治烟草黑胫病和烟草青枯病中的应用。

本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌gual210在防治烟草黑胫病中的应用。

本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌gual210在防治烟草青枯病中的应用。

本发明还提供一种解淀粉芽孢杆菌gual210在防治辣椒炭疽病中的应用。

本发明的有益效果是：本发明从贵州省黔西南州安龙县烟草黑胫病和青枯病发病严重地块采集健康烟株根际土壤，从中筛选分离得到芽孢杆菌gual210，具有明显的同时拮抗烟草黑胫病菌(phytophthoranicotianae)和青枯病菌(ralatoniasolanacearum)的能力，以及拮抗辣椒炭疽病的能力。通过形态学、生理生化特性及16srdna基因鉴定gual210为解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)。

附图说明

图1芽孢杆菌对烟草黑胫病菌的拮抗效果筛选，ck：烟草黑胫病菌(phytophthoranicotianae)；gual210表示筛选到的具有拮抗效果的芽孢杆菌菌株；

图2芽孢杆菌对烟草青枯病菌的拮抗效果初筛，ck：烟草青枯病菌(ralatoniasolanacearum)；gual210表示筛选到的具有拮抗效果的芽孢杆菌菌株；

图3菌株gual21016srdna基因进化树；

图4菌株gual210菌落形态及生物膜(biofilm)形态；

图5菌株gual210抗菌谱鉴定；

图6菌株gual210抗菌物质鉴定。

具体实施方式

下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍：

一、解淀粉芽孢杆菌gual210的分离与筛选

1.材料与方法

1.1材料

土样采集于2017-2018年分别从贵州省黔西南州安龙县烟草黑胫病和青枯病发病地块采集健康烟株根际土样，采用5点取样法，将同一地块土样混合算1份土样。使用纸袋收集土样，土壤采集工具提前消毒，避免土壤微生物混杂。

1.2培养基

lb培养基用于芽孢杆菌的分离保存和平板对峙实验中；pda培养基主要用于平板对峙实验中。

1.3烟草病害菌株

供试菌株烟草黑胫病菌(phytophthoranicotianae)和烟草青枯病菌(ralatoniasolanacearum)由贵州大学农学院植物病理学教研室提供。

2.根际芽孢杆菌的分离与保存

采用稀释平板法，将土壤稀释液在85℃的水浴锅中水浴30min以杀死绝大部分非芽孢细菌。取100μl稀释液涂lb平板，每浓度涂平板3个，37℃下培养。培养1天后，挑取不同的单菌落，进行转管并保存于-80℃冰箱。

3.烟草黑胫病菌和青枯病菌拮抗芽孢杆菌筛选

以烟草黑胫病菌和青枯病菌作为供试植物病原菌，通过平板对峙法筛选同时可以拮抗两种病原菌的芽孢杆菌，通过初筛和复筛观察是否产生抑菌圈，并利用十字交叉法测量其抑菌直径，再通过特定平板检测是否有生物膜、蛋白酶、纤维素酶、嗜铁素、磷酸酯酶等的产生，选择拮抗效果较好的芽孢杆菌1株，编号为gual210(见图1和图2)。

抑菌率(％)＝[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/处理组菌落直径]×100二、解淀粉芽孢杆菌gual210的鉴定

1.生防菌株鉴定

通过形态学、生理生化特征及16srdna基因对筛选的菌株进行鉴定。

1.1菌落形态观察

接种菌株至含有5mllb培养液的试管中，37℃过夜摇培，离心收集菌体，菌体用无菌水清洗3次，最后用无菌水重悬并稀释至浓度1×10⁸cfu/ml，在lb平板上滴加10μl菌液，37℃过夜培养后观察菌落形态。

1.2生理生化特征

根据《伯杰氏系统细菌学手册》，对菌株的生理生化特性进行测定。

1.3分子生物学鉴定

50mg/ml溶菌酶37℃水浴1h处理菌体，采用biomiga细菌基因组dna提取试剂盒提取基因组dna。以基因组dna为模板，采用16srdna通用引物27f/1492r进行pcr扩增，pcr产物验证正确后送上海生工进行pcr产物测序。测序结果于ncbi数据库进行blast比对分析，并利用clustalx软件进行多序列比对和系统进化分析软件mega6中的neighbor-joining算法构建系统发育树。

经分析：gual210可在lb培养基上形成比较复杂的菌落结构(图4)。菌株的生理生化特性见表1，株菌为g⁺，可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇，产生过氧化氢酶和硝酸还原酶，甲基红染色阳性，可液化明胶等特征。通过16srdna基因序列分析，构建了菌株gual210的16srdna基因进化树，结果显示，菌株gual210与解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)聚到一个分支(图3)。通过形态学、生理生化特性及16srdna基因鉴定al210为解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)。

表1菌株gual210生理生化特征

+：阳性反应；-：阴性反应

2.生防菌株抗菌谱鉴定

菌株gual210具有光谱拮抗活性，对烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒炭疽病菌和高粱斑点病菌等多种病原真菌抑菌效果较好(见图5)。表明这两株菌对以上病害都有潜在的生防效果。

3.生防菌株抗菌物质鉴定

菌株gual210可产生嗜铁素和磷酸酯酶(见图6)，与芽孢杆菌促进植物生长相关。芽孢杆菌在植物根系定殖并产生复杂的生物膜结构，可以有效占据根表有利位点，限制病原菌菌丝的侵入，并能诱导植物对病原菌产生抗性，达到防病增产的效果。

三、解淀粉芽孢杆菌gual210在防治植物病害方面的应用

1.烟草黑胫病防治田间试验

供试品种：云烟87。试验地点：贵州安龙。试验地：肥力均匀，2017年种植烤烟且黑胫病发病地块。

试验设计：用解淀粉芽孢杆菌gual210处理，以药剂30％甲霜·噁霉灵水剂(中农立华(天津)农用化学品有限公司)为阳性对照，以绿地康(绿地康是中农绿康(北京)有限责任公司研发的微生态制剂，用以改善土壤微生态防治病害以及促生增产的效果)，未进行任何药剂处理的为空白对照，共3个处理，3次重复，每小区30株烟，所有处理随机区组排列。药剂处理浓度及用量参考药剂说明，烟苗移栽时灌根施用，施用2次；芽孢杆菌浓度为10⁸cfu/ml，50ml菌液灌根施用，共施用3次，从烟苗移栽时灌根1次，后每隔7-10d灌根1次。2018年4月27日移栽，田间栽培管理方法与当地一致，不施用其它杀菌剂。

田间调查：田间调查时间选取空白对照开始发病后到采收前共进行3次，调查所有处理小区烟株黑胫病发病率，并分级调查病害严重度。烟草黑胫病病害分级标准依据gb/t23222-2008进行，计算病害的发病率和病情指数，数据采用dps数据处理系统duncan新复极差法进行方差分析。结果如表2所示。

表2安龙地区烟草黑胫病的田间小区防效

表2可知，芽孢杆菌对烟草黑胫病都有一定防效，防效与甲霜·噁霉灵相当。甲霜·噁霉灵是目前生产中用于防治烟草黑胫病的主用药剂。有报道表明，生产中烟草黑胫病菌已对甲霜灵·锰锌产生抗药性。因此，结合化学药剂和生物杀菌剂的优缺点，可尝试生防菌株与化学农药复配施用，达到减少化学农药的用量。

2.烟草青枯病防治田间试验

供试品种：云烟87。试验地点：贵州安龙。试验地：肥力均匀，2017年种植烤烟且青枯病发病地块。

试验设计：用解淀粉芽孢杆菌gual210处理，以中生菌素(中生菌素是中国农科院生防所研制成功的一种新型农用抗生素，是由淡紫灰链霉菌海南变种产生的抗生素，属n－糖苷类碱性水溶性物质。该菌的加工剂型是一种杀菌谱较广的保护性杀菌剂，具有触杀、渗透作用。中生菌素对农作物的细菌性病害及部分真菌性病害具有很高的活性，同时具有一定的增产作用。是目前生产中比较常用的生物杀菌剂。防治茄科青枯病效果明显)为阳性对照，以荧光假单胞菌(商品化试剂)(荧光假单胞杆菌是一类广泛分布的革兰氏阴性杆状菌，环境适应性强，具有抑制多种病原菌、帮助植物吸收营养、促进植物生长等有益的作用，是防治青枯病、软腐病、细菌性角斑病、腐烂病、姜瘟病等细菌性病害的特效药。缺点是货架期比较短，一般生产后6个月活菌数减少以及菌活性下降，会导致药效大幅度降低，不可做杀菌剂使用，但可以混入堆肥中发挥一点肥效作用。芽孢杆菌可以产生抗逆的芽孢，如果产品含水量小于5％，目前可以达到2-3年的货架期，也可长期保存，是芽孢杆菌作为主流生物制剂的主要原因)，未进行任何药剂处理的为空白对照，共3个处理，3次重复，每小区30株烟，所有处理随机区组排列。药剂处理浓度及用量参考药剂说明，烟苗移栽时灌根施用，施用2次；芽孢杆菌浓度为10⁸cfu/ml，50ml菌液灌根施用，共施用3次，从烟苗移栽时灌根1次，后每隔7-10d灌根1次。2018年4月27日移栽，田间栽培管理方法与当地一致，不施用其它杀菌剂。

田间调查：田间调查时间选取空白对照开始发病后到采收前共进行3次，调查所有处理小区烟株青枯病发病率，并分级调查病害严重度。烟草青枯病病害分级标准依据gb/t23222-2008进行，计算病害的发病率和病情指数，数据采用dps数据处理系统duncan新复极差法进行方差分析。结果如表3所示。

表3安龙地区烟草青枯病的田间小区防效

实验结果表明，本芽孢杆菌对烟草青枯病的防效较好。

3.辣椒炭疽病防治田间试验

供试品种：党武。试验地点：贵阳市花溪区。

试验设计：用解淀粉芽孢杆菌gual210处理，以商品化生防制剂绿康威(中农绿康(北京)生物技术有限公司)作为阳性对照，未进行任何药剂处理的为空白对照，共4个处理，3次重复，每小区30株辣椒，所有处理随机区组排列。药剂处理浓度及用量参考药剂说明，辣椒苗移栽时灌根施用，施用3次；芽孢杆菌浓度为10⁸cfu/ml，50ml菌液灌根施用，共施用3次，从辣椒苗移栽时灌根1次，后每隔7-10d灌根1次。田间栽培管理方法与当地一致，不施用其它杀菌剂。

田间调查时间选取空白对照开始发病后共进行2次，调查所有处理小区辣椒炭疽病发病率，并分级调查病害严重度。辣椒炭疽病病害分级标准依据gb/t17980.33-2000进行，计算病害的发病率和病情指数，数据采用dps数据处理系统duncan新复极差法进行方差分析。

当空白对照小区辣椒炭疽病开始发生时开始进行病害调查。2018年5月22日调查第1次，每隔7-10d调查1次，共调查3次。结果如表4所示。

表4芽孢杆菌对辣椒炭疽病的田间小区防效

实验结果表明，本芽孢杆菌对辣椒炭疽病具有明显防效，且比商品化的生防制剂效果还好。

解淀粉芽胞杆菌可以产生多种抗菌物质抑制植物病原菌。研究发现，芽胞杆菌抗真菌活性来源于环脂肽类抗生素，而抗细菌活性则可能由于聚酮类物质和核糖体合成途径产生的细菌素。这些物质可以抑制细菌的生长和真菌菌丝的生长及孢子的萌发。但是不同芽孢杆菌的基因组差异较大，因此本发明分离得到的芽孢杆菌产生的抑菌物质还需进一步研究。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。