藻酸盐/胶原水凝胶中的fgf?18制剂的制作方法

藻酸盐/胶原水凝胶中的fgf?18制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及药物制剂领域。更具体地，涉及包含成纤维细胞生长因子18(FGF?18)化合物的均质的水凝胶，并涉及产生所述水凝胶的方法。一旦原位形成，本发明的水凝胶可用于治疗软骨疾病，例如，骨关节炎或软骨损伤。
【专利说明】
藻酸盐/胶原水凝胶中的FGF-18制剂
技术领域
[0001] 本发明涉及药物制剂领域。更具体地，其涉及藻酸盐/胶原水凝胶中的成纤维细胞 生长因子18(FGF-18)蛋白质制剂，且涉及用于生成所述水凝胶/制剂的方法。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞生长因子18(FGF-18)是成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白质家族的成 员，其与FGF-8和FGF-17紧密相关。FGF家族成员的特征是:肝素结合结构域。对于FGF-18已 经鉴定了该假定的肝素结合结构域。假设受体介导的信号转导在与细胞表面肝素硫酸蛋白 聚糖复合的FGF配体的结合之后起始。
[0003] 已经显示，FGF-18是软骨细胞和成骨细胞的增殖剂(Ellsworth等，2002; Shimoaka 等，2002)。已提出将FGF-18以单独(W02008/023063)或联合透明质酸(W02004/032849)的形 式治疗软骨疾病，例如骨关节炎(0A)和软骨损伤(CI)。
[0004] 包含FGF多肽的药物组合物是本领域已知的。W02012172072描述了包含FGF-18的 冻干制剂，其中，该组合物包含FGF-18、缓冲剂、泊洛沙姆表面活性剂和糖作为稳定剂。所述 FGF-18冻干制剂在治疗0A或CI方面显示具有前景的结果。采用所述冻干制剂的当前的给药 方案是一周一次的注射治疗周期，持续3周。该治疗周期可被重复。
[0005] 在CI的情况中，现有制剂的主要缺点是，一旦关节内（i . a.)注射，滑液中FGF-18的 存在可能会诱导健康区域中失控的软骨生长。当然，这可能会诱导不希望的作用，例如，关 节活动性降低。在靶位点水平选择性地递送FGF-18能够仅促进受损区域中的软骨生长。具 体而言，受损区域水平的FGF-18递送将高度有利于伴有微骨折术的CI治疗。微骨折术是关 节软骨修复外科手术技术，其通过在基础骨骼中产生小骨折来发挥作用。这导致多潜能间 充质干细胞从骨髓释放(Ringe J.等，2012)。用包含FGF-18的可注射凝胶填充软骨孔洞将 对凝胶中的细胞起导向作用，该凝胶随后将同时作为供于细胞生长的机械支持物和药物储 库。出于该原因，希望FGF-18不从凝胶释放，而是保留在基质中。
[0006] 组织工程改造中典型的方案是3D基质（即支架）中生长因子的限制，该3D基质可被 植入或注射(取决于机械性质），以确保接纳位点的形状。所述支架的必备特点是生物相容 性和可吸收性。此外，支架必需能够向细胞提供供于生长、增殖和使受损组织再形成的理想 环境。理想上，该基质应近似于原始组织的相同机械性质，并且应具有对于宿主细胞可用的 微孔性(具有充分尺寸的互连的孔）（Te SSmar和G0pferich，2007)。
[0007] 例如，W02012113812描述了用至少一层聚阴离子和一层聚阳离子被覆的纳米纤维 状支架。治疗分子，例如FGF18,可包括在支架中。具体而言，所述治疗分子可形成多聚阴离 子层。所述支架可任选地另包含胶原水凝胶中的成骨细胞和藻酸盐水凝胶中的软骨细胞， 各水凝胶置于经被覆的支架上。所述支架通过手术原位植入。
[0008] 水凝胶是能够吸收和保留大量的水的亲水性聚合物链的三维网络。其主要特征是 能够膨胀或收缩，但不溶解于水性介质。因此，能够在其基质中捕获活性分子(活性药物成 分，即API)，所述分子随后被缓慢释放或保留，这取决于基质和API之间的特定相互作用的 存在与否（Lo Presti等，2011)。采用可注射水凝胶治疗软骨疾病的好处是，能够通过软骨 缺损中进行的关节镜检来注射该支架，无需利用固体支架的任何侵入性手术。
[0009] 在已知的多种水凝胶中，一些制剂基于这样的聚合物，所述聚合物能够响应具体 物理或化学刺激而经历胶凝过程。这些以粘性可注射液体的形式存在，其一经注射即响应 注射位点处的环境刺激(例如温度、pH或离子强度变化)而转变为肉眼可见的凝胶。该制剂 的组合物可经调节以获得具有不同特点的水凝胶，例如，粘弹性质、微孔性等 (W02008063418;Lo Presti等，2011;C. Dispenza等，2011)。当制备包含生物活性蛋白质的 药物组合物时，所述组合物必须以这种方式配制:所述蛋白质的活性保持合适的一段时间。 蛋白质的活性/稳定性的损失可能是由该蛋白质的化学或物理不稳定性所致，主要归因于 变性、聚集或氧化。因此，所得产物可能是药学上不可接受的。尽管已知赋形剂和/或水凝胶 的应用能够增加给定蛋白质的稳定性，这些赋形剂的稳定作用高度依赖于凝胶中的聚合 物、赋形剂的性质和生物活性蛋白质本身。
[0010] 仍需要包含FGF-18作为活性成分的新制剂，其中，所述制剂同时保持活性成分的 生物活性且适用于注射，优选用于关节注射，允许减少治疗所需的注射次数。这一特点将允 许降低感染风险，并且将会增加患者的便利性，因为其既不需要手术也不需要侵入性植入。 所述制剂可用于在患者软骨疾病(例如，骨关节炎或软骨损伤)的治疗中给予。

【发明内容】

[0011] 本发明的一个目的是提供包含FGF-18蛋白的新型制剂。更具体地，所述制剂是包 含FGF-18的均质水凝胶，其中，所述水凝胶优选是离子响应性水凝胶，且更优选藻酸盐/胶 原凝胶。本发明还提供用于制备本发明的均质水凝胶的方法。本文所述的包含FGF-18的水 凝胶可用于在软骨疾病的治疗中给予。特别感兴趣的是藻酸盐/胶原水凝胶，还包含FGF-18 蛋白。
[0012] 在第一方面中，本发明提供一种水凝胶（即凝胶制剂），其是均质的，包含或由以下 组分组成:藻酸盐、胶原、FGF-18、糖作为等渗/稳定剂，以及盐。该制剂以2组分-凝胶系统的 形式提供，各系统在分离时是液体形式。或者，包含藻酸盐的组分-凝胶系统可以是冻干形 式。所述组分之一包含或由如下物质组成:胶原、FGF-18、糖，和藻酸盐的液体或冻干组合物 (溶液1)。所述组分形成均质组合物。第二组分包含液体形式的盐或由其组成(溶液2)。一旦 这两个组分-凝胶系统(溶液1和溶液2)被混合(或合并)到一起，形成凝胶。所述凝胶也是均 质的。在一个优选实施方式中，所述稳定剂是糖或糖-醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖、D-山 梨醇，且所述盐是二价阳离子盐(dicationic salt)(例如，镁盐、铜盐、锌盐或钙盐，例如氯 化钙）。在一个优选实施方式中，在第一组分-凝胶系统（即溶液1)中，藻酸盐中的浓度是或 约是1-5重量％，优选是或约是2.5-4.5,更优选是或约是3或4重量％，所述胶原的浓度是或 约是0.1-5yg/mL，优选是或约是1或2yg/mL，蔗糖的浓度是或约是lO-lOOmg/mL，优选是或约 是30-70mg/mL，例如，是或约是30、40、50、60或70mg/mL，更优选70mg/mL;在第二组分-凝胶 系统（即溶液2)中，所述盐溶液的浓度是或约是l_20mg/mL，优选10mg/mL。当混合在一起时， 溶液1:溶液2的体积比是5:1-1:2,更优选是2:1(在冻干制剂的情况中，溶液1的溶液体积在 冻干过程之前考虑）。优选地，FGF-18选自下组：1)包含或由人FGF-18的成熟形式组成的多 肽，所述人FGF-18的成熟形式对应于包含或由SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基207(Ala) 组成的序列，2)包含或由截短形式的人FGF-18组成的多肽，所述截短形式的人FGF-18包含 或由SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基196(Lys)组成，和3)包含或由SEQ ID N0:2组成的 多肽。更优选地，FGF-18是斯普弗明（sprifermin)，如后文所定义。第一组分凝胶系统还可 包含缓冲剂，和/或任选的其它赋形剂。
[0013] 溶液1优选与溶液2共同注射以原位形成水凝胶。
[0014] 在第二方面中，本发明提供制备FGF-18的均质水凝胶的方法，其包括如下步骤：
[0015] 1)制备溶液1，其包含或由如下组分组成:FGF-18,以及藻酸盐、胶原和等渗/稳定 剂，
[0016] 2)制备溶液2,其包含或由盐组成，和
[0017] 3)共同注射两种溶液，以形成所述凝胶，
[0018] 其中，所述等渗/稳定剂是糖或糖-醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇，并 且所述盐是二价阳离子盐，例如，镁盐、铜盐、锌盐或钙盐(例如，氯化钙）。优选地，最终制剂 的pH保持是或约是6-8,且更具体地是或约是7。在一个优选实施方式中，FGF-18选自下组： 1)包含或由人FGF-18的成熟形式组成的多肽，所述人FGF-18的成熟形式对应于包含或由 SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基207(Ala)组成的序列，2)包含或由截短形式的人FGF-18 组成的多肽，所述截短形式的人FGF-18包含或由SEQ ID NO: 1的残基28(Glu)至残基196 (Lys)组成，和3)包含或由SEQ ID N0:2组成的多肽。更优选地，FGF-18是斯普弗明，如后文 所定义。溶液1还可包含缓冲剂，和/或任选的其它赋形剂。
[0019]在第三方面中，本发明提供药用或兽医用的制品（article of manufacture)，其 包含：
[0020] 1)第一容器，其包含藻酸盐、胶原、FGF-18蛋白，和等渗/稳定剂(溶液1)(所述组合 物是均质的），和
[0021] 2)第二容器，其包含盐(溶液2)，
[0022] 其中，所述等渗/稳定剂是糖或糖-醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇，并 且所述盐是二价阳离子盐，例如，镁盐、铜盐、锌盐或钙盐(例如，氯化钙）。优选地，FGF-18选 自下组：1)包含或由人FGF-18的成熟形式组成的多肽，所述人FGF-18的成熟形式对应于包 含或由SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基207(Ala)组成的序列，2)包含或由截短形式的人 FGF-18组成的多肽，所述截短形式的人FGF-18包含或由SEQ ID NO: 1的残基28(Glu)至残基 196(Lys)组成，和3)包含或由SEQ ID N0:2组成的多肽。更优选地，FGF-18是斯普弗明，如后 文所定义。溶液1还可包含缓冲剂，和/或任选的其它赋形剂。然后将各容器的内容物原位混 合在一起，同时注射。优选地，所述制品的第一容器和第二容器是双室或双重注射系统的两 个隔室。
[0023] 定义
[0024]-本文中所用的术语"FGF-18蛋白"或"FGF-18"意指，保留了人FGF-18蛋白的至少 一种生物活性的蛋白质。FGF-18可以是原始的（native)，以其成熟形式，或其截短形式存 在。人FGF-18蛋白的生物活性包括显著增加成骨细胞活性（参见W098/16644)或软骨形成 (参见 W02008/023063)。
[0025]原始或野生型的人FGF-18是由关节软骨的软骨细胞表达的蛋白质。人FGF-18是首 次指定的zFGF-5,并且其在W098/16644中有完整的介绍。SEQ ID N0:1对应于原始人FGF-18 的氨基酸序列，其具有由氨基酸残基l(Met)至27(Ala)组成的信号肽。人FGF-18的成熟形式 对应于SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基207(Ala)的氨基酸序列（180个氨基酸）。
[0026] 本发明中的FGF-18可通过重组方法产生，例如，如申请W02006/063362所教导的。 视表达系统和条件而定，本发明中的FGF-18在重组宿主细胞中表达，具有起始甲硫氨酸 (Met残基)或具有用于分泌的信号序列。当在原核宿主（例如，大肠杆菌）中表达时，FGF-18 在其序列的N末端包含额外的Met残基。例如，当人FGF-18的氨基酸序列在大肠杆菌中表达 时，以N末端(位置1)的Met残基起始，随后是SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基207(Ala)。 [0027]-本文中所用的术语"截短形式"的FGF-18指，包含或由SEQ ID NO: 1的残基28 (Glu)至196(Lys)组成的蛋白质。优选，截短形式的FGF-18蛋白是标为"trFGF-18"（170个氨 基酸）的多肽，其以Met残基(在N末端)起始，随后是野生型人FGF-18的氨基酸残基28(Glu)_ 196(Lys)。trFGF-18的氨基酸序列示于SEQIDN0:2(SEQIDN0:2的氨基酸残基2-170，对 应于SEQ ID NO: 1的氨基酸残基28-196) drFGF-18是重组截短形式的人FGF-18，由大肠杆 菌生成(参见W02006/063362KFGF-18的该具体形式的国际非专利药品名称（INN)是斯普弗 明。已显示，斯普弗明具有与成熟人FGF-18类似的活性，例如，其增加软骨细胞增殖和软骨 沉积，导致多种软骨组织的修复和重建(参见W02008/023063)。
[0028]-术语"活性分子"和"活性成分"指，活性药物成分，即API。本
【发明内容】
中优选的 API是FGF-18。
[0029] -术语"凝胶"或"水凝胶"在本申请中可互换使用。它们指可作为药物制剂使用的 3D基质或支架。其不是固体支架。
[0030] -术语"均质的"指，所述制剂的多个组分混合、掺混、搅拌或渐混在一起，即它们不 形成分层的组分。
[0031] -术语"藻酸盐"，还称为藻酸或藻胶，指任何形式的藻酸盐。其为熟知的胶凝剂，尤 其是与二价阳离子盐联用时。可用于本
【发明内容】
的形式之一是藻酸钠。
[0032]-术语"胶原"指一组天然产生的蛋白质。尽管存在近30种不同形式的胶原，主要的 一种是I型胶原。I型胶原以及II型胶原是可用于本
【发明内容】
中的优选形式。然而，可采用其 它形式的胶原。
[0033] -本申请中所用的术语"藻酸盐/胶原"指藻酸盐和胶原的组合。
[0034] -术语"二价阳离子盐"指，但不限于，例如包含镁、铜、锌或钙的盐。包括氯化镁、氯 化铜、氯化锌或氯化钙。优选地，本发明的二价阳离子盐不是多聚阳离子盐，也不源自多聚 阳离子组分(例如，W02012/113812中公开的那些）。
[0035]-本文中所用的术语"稳定"溶液或制剂是一种溶液或制剂，其中，蛋白质的降解程 度、修饰、聚集、生物活性损失等被可接受地控制，并且不随时间推移而产生不可接受的增 加。优选地，所述制剂在室温下至少12个月的时程中保留至少多于80%的FGF-18活性。本发 明的包含FGF-18的稳定制剂在例如室温或2-8°C下贮存时，具有，优选至少约12个月、18个 月，更优选至少20个月，更优选约24个月的保质期。用于监测本发明的FGF-18制剂的稳定性 的方法是本领域中可得的。
[0036]-本文中所用的术语〃稳定剂〃、"稳定剂"或"等渗剂"是生理耐受的化合物，并且使 制剂具有合适的稳定性/张力。其显著防止水穿过与所述制剂接触的细胞膜的净流。在冷冻 干燥(冻干)过程中，稳定剂还能有效作为冷冻保护剂（即冻干保护剂）。化合物(例如甘油） 常用于该目的。其它合适的稳定剂包括但不限于，氨基酸或蛋白质(例如甘氨酸或白蛋白）、 盐(例如氯化钠），和糖或糖-醇(例如，右旋糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、D-山梨醇或乳糖）。根 据本发明，优选的稳定/张度剂是糖，甚至更优选蔗糖。
[0037] -本文中所用的术语"缓冲剂"指，化合物的溶液，其已知在药用或兽医用的制剂中 是安全的，并且具有将制剂的pH维持或控制在所述制剂所需的pH范围内的作用。用于将pH 控制在中等酸性pH至中等碱性pH的可接受的缓冲剂包括但不限于，磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸 盐、精氨酸、TRIS，和组氨酸缓冲剂。"TRIS 〃指2-氨基-2-羟甲基-1，3，-丙二醇，及其任何药 学上可接受的盐。优选的缓冲剂可以是组氨酸缓冲剂。
[0038] -本文中所用的术语〃溶剂〃指，水性或非水性的液体溶剂。溶剂的选择主要取决于 药物化合物在所述溶剂和给予模式上的稳定性。水性溶剂可仅由水组成，或可由水加上一 种或多种易混溶剂组成，并且可包含溶解的溶质，例如，糖、缓冲剂、盐或其它赋形剂。更常 用的非水性溶剂是短链有机醇，例如，甲醇、乙醇、丙醇、短链酮类、例如丙酮，和多元醇，例 如，甘油。根据本发明，优选的溶剂是水性溶剂，例如水或盐水溶剂。
[0039] -本文中所用的术语"小瓶"或"容器"广泛地指，适于将藻酸盐/胶原保留在液体形 式或冻干形式的储库。类似地，其将保留液体盐混合物。本发明中所用的小瓶的示例包括， 注射器、安瓶、药筒，或适于通过注射(优选通过关节内注射)将FGF-18制剂递送至患者的其 它此类储库。或者，保留所述藻酸盐/胶原溶液的小瓶和保留盐的小瓶示为双室系统(注射 器或药筒，例如，双室注射器或双针头注射装置等）的两个隔室。适用于包装关节内给予产 品的小瓶是本领域熟知且公认的。
[0040] -本文中所用的术语"软骨疾病"涵盖由因创伤性损伤或软骨病疾病造成的损伤所 致的疾病。可通过给予本文所述的FGF-18制剂来治疗的软骨疾病的示例包括但不限于，关 节炎，例如，骨关节炎或类风湿性关节炎，和软骨损伤。
[0041]-所用术语"骨关节炎"意指关节炎的最常见形式。其可由软骨破损造成。少量的软 骨可能会折断，从而造成骨与骨之间的关节中的疼痛和膨胀。随时间推移，该软骨可能会完 全磨损，使得骨与骨在一起摩擦。骨关节炎可能会影响任何关节，但长见于手部和承重关 节，例如，髋、膝盖、足部，和脊柱。在一个优选的示例中，骨关节炎可以是膝盖骨关节炎或髋 骨关节炎。本领域技术人员完全知晓本领域中所用的骨关节炎分类，具体而言是0ARSI评估 系统(参见例如，Custers等，2007)。骨关节炎是可通过给予本发明的FGF-18制剂治疗的优 选的软骨疾病之一。
[0042]-本文中所用的术语"软骨损伤"是主要由创伤造成的软骨疾病或软骨损伤。软骨 损伤可能因创伤性机械破坏而发生，尤其是涉及事故或手术(例如，微骨折术技术)而发生。 该定义中还考虑运动相关损伤或运动相关的关节组织磨损。
[0043]-术语"yg"或"meg"可互换使用并且指质量SI单位的划分。
[0044] 发明详述
[0045] 本发明的主要目的是藻酸盐/胶原凝胶制剂(或水凝胶），其包含或由如下组分组 成:藻酸盐、胶原、FGF-18蛋白、糖作为稳定剂，和盐。所述水凝胶是均质的。所述水凝胶还可 包含缓冲剂，和/或任选的其它赋形剂。在一个优选实施方式中，所述稳定剂是糖或糖-醇， 例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇，且所述盐是二价阳离子盐，例如，镁盐、铜盐、锌盐 或钙盐(例如氯化钙）。所述水凝胶合适于软骨水平的注射。优选地，所述FGF-18蛋白选自下 组：1)包含或由人FGF-18的成熟形式组成的多肽，所述人FGF-18的成熟形式对应于包含或 由SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基207(Ala)组成的序列，2)包含或由截短形式的人FGF-18组成的多肽，所述截短形式的人FGF-18包含或由SEQ ID NO: 1的残基28(Glu)至残基196 (Lys)组成，和3)包含或由SEQ ID N0:2组成的多肽。更优选地，FGF-18是斯普弗明。
[0046]应用可注射的均质水凝胶的优点在于，能够在软骨缺损中注射已包含FGF-18的支 架(或所述支架的组分），而无需利用固体支架的任何侵入性手术。优选，所述水凝胶的注射 通过关节镜检进行。
[0047] 最优选地，本发明的均质水凝胶由两种溶液制备，一种包含聚合物(本文中的藻酸 盐系统；溶液1)，而另一种包含离子(本文中为盐形式;溶液2)，并且在注射后通过混合(或 合并)所述两种溶液而原位形成。所述两种溶液的混合(或合并)优选通过共同注射进行。溶 液1还可包含缓冲剂，和/或任选的其它赋形剂。
[0048] 在一个优选实施方式中，本发明涉及均质液体聚合溶液的应用，其一经给予即能 够经历胶凝过程，这归因于离子浓度变化。在一个替代性的实施方式，所述聚合溶液可以是 冻干形式。当聚合溶液是所述冻干形式时，所述溶液可任选地另包含冻干保护剂。已知的冻 干保护剂是，例如，糖，和一般的多元醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇。
[0049] 如果溶液1是冻干形式，则冻干优选采用常规过程进行。
[0050] 溶液1中的FGF-18浓度优选是或约是0.1-300mcg/mL，优选是或约是0.1、1、5、10、 20、30、40、50、54、60、70、80、90、100、150、200、250或30011^8/111匕更优选?6?-18的浓度是或 约是〇· 1-lOOmcg/mL，甚至更优选是或约是1〇-6〇111〇8/111匕？6?-18可以5%的过量添加，以防 止配制过程中可能发生的蛋白质损失.例如，对于30mc g/mL的FGF-18浓度，所述化合物可以 31.5mcg/mL的量添加。
[0051 ]溶液1中的凝胶组分，即藻酸盐，的浓度是或约是1-5重量％，优选是或约是2.5-4.5重量％，更优选是或约是3或4重量％。
[0052] 本发明中的稳定剂优选是糖或糖-醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇。优 选的糖是蔗糖。优选地，溶液1中稳定剂的浓度是或约是lO-lOOmg/mL，更优选是或约是30-70mg/mL，例如，是或约是30、40、50、60或70mg/mL，更优选是或约是70mg/mL。
[0053] 溶液1中的本发明的胶原的优选浓度是或约是0.1 -5mcg/mL，更优选是或约是1 -2mcg/mL，更具体地是或约是1或2mcg/mL。
[0054]第二组分-凝胶系统（即溶液2)中的盐优选是二价阳离子盐，例如，镁盐、铜盐、锌 盐或钙盐(例如，氯化钙）。盐溶液的浓度是或约是1 _20mg/mL，优选是或约是1 Omg/mL。
[0055] 在一个优选实施方式中，溶液1包含或由如下组分组成：是或约是0.1-lOOmcg/mL 的FGF-18，是或约是4重量％的藻酸盐，是或约是70mg/mL的蔗糖，和是或约是2mcg/mL的胶 原；且溶液2包含或由如下组分组成：是或约是10mg/mL的二价阳离子盐(例如，氯化钙）。溶 液1还可包含缓冲剂，和/或任选的其它赋形剂。溶液1是均质的。
[0056]当混合在一起时，溶液1:溶液2的体积比是5:1-1: 2，更优选是2:1 (在冻干制剂的 情况中，溶液1的溶液体积在冻干过程之前考虑）。
[0057] 一旦混合在一起，各组分的终浓度优选如下：
[0058] -FGF-18:0.00006-0.2%w/v，例如，0.0036%w/v(当混合前的FGF-18是0· 1- 300mcg/mL时，基于实施例部分中给出的FGF-18浓度）
[0059]-藻酸盐:0.6-3.33 % w/v，例如，2.67 % w/v(当混合前的藻酸盐是4 % w/v时）
[0060]-胶原：0 · 00006-0 · 003%w/v，例如，0 ·000133%w/v(当混合前的胶原是2mcg/mL 时）
[0061 ]-稳定剂:0.6-6 % w/v，例如，4.67 % w/v (当混合前的鹿糖，例如，是70mg/mL时） [0062]-二价阳离子盐:0.033-0.66%￥八，例如，0.33%￥八（当混合前的盐是1011^/1111^时） [0063]在一个优选实施方式中，将最终制剂的pH保持在6-8或约为6-8,更具体地，是或约 是7。
[0064]本发明还提供制备FGF-18的均质水凝胶的方法，其包括如下步骤：
[0065] 1)制备第一溶液(溶液1)，其包含或由如下组分组成:FGF-18，以及藻酸盐、胶原和 稳定剂，
[0066] 2)制备第二溶液(溶液2)，其包含或由盐组成，和
[0067] 3)共同注射两种溶液，以形成所述凝胶，
[0068]其中，所述稳定剂是糖或糖-醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇，并且所述 盐是二价阳离子盐，例如，镁盐、铜盐、锌盐或钙盐(例如，氯化钙）。溶液1还可包含缓冲剂， 和/或任选的其它赋形剂。溶液1是均质的。在一个优选实施方式中，将最终制剂的pH保持在 6-8或约为6-8，且更具体地，是或约是7。优选地，FGF-18选自下组：1)包含或由人FGF-18的 成熟形式组成的多肽，所述人FGF-18的成熟形式对应于包含或由SEQ ID NO: 1的残基28 (Glu)至残基207(Ala)组成的序列，2)包含或由截短形式的人FGF-18组成的多肽，所述截短 形式的人FGF-18包含或由SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基196(Lys)组成，和3)包含或由 SEQ ID N0:2组成的多肽。更优选地，FGF-18是斯普弗明，如本文所定义。
[0069]各化合物（即FGF-18、藻酸盐、胶原、稳定剂和盐)可根据上述浓度、pH、和/或比例 中任何之一采用。优选，溶液1:溶液2的比(体积比体积，即v:v)是或约是1:2-5:1，更优选是 或约是2:1(在冻干制剂的情况中，溶液1的体积在冻干过程之前考虑）。
[0070] 当本发明的水凝胶的溶液1是冻干形式时，需要在步骤3之前（即共同注射之前)对 其进行重建。
[0071] 在第三方面中，本发明提供药用或兽医用的制品，其包含：
[0072] 1)第一容器，其包含或由如下物质组成：藻酸盐、胶原、FGF-18蛋白，和稳定剂（溶 液1)，和
[0073] 2)第二容器，其包含或由盐组成(溶液2)，
[0074] 其中，所述稳定剂是糖或糖-醇，例如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或D-山梨醇，并且所述 盐是二价阳离子盐，例如，镁盐、铜盐、锌盐或钙盐(例如，氯化钙）。溶液1还可包含缓冲剂， 和/或任选的其它赋形剂。溶液1是均质的。优选地，FGF-18选自下组：1)包含或由人FGF-18 的成熟形式组成的多肽，所述人FGF-18的成熟形式对应于包含或由SEQ ID NO: 1的残基28 (Glu)至残基207(Ala)组成的序列，2)包含或由截短形式的人FGF-18组成的多肽，所述截短 形式的人FGF-18包含或由SEQ ID N0:1的残基28(Glu)至残基196(Lys)组成，和3)包含或由 SEQ ID N0:2组成的多肽。更优选地，FGF-18是斯普弗明，如本文所定义。
[0075]各化合物（即FGF-18、藻酸盐、胶原、稳定剂和盐)可根据上述浓度、pH、和/或比例 中任何之一采用。优选地，溶液1:溶液2的体积比（v:v)是或约是1:2-5:1，更优选是或约是 2:1(在冻干制剂的情况中，溶液1的体积在冻干过程之前考虑）。然后将各容器的内容物原 位混合在一起，同时注射(例如，共同注射）。
[0076] 优选地，保留FGF-18制剂的容器和保留盐的容器对应于双室系统或双重注射系统 (例如，注射器或药筒)的两个隔室。
[0077] 当聚合溶液（即溶液1)是冻干形式时，所述制品还可包含第三容器，其包含或由重 建所需的如下溶剂组成，例如水或盐水溶液(例如，注射用的〇. 9%w/v氯化钠）。
[0078] 还描述了包装材料，该包装材料提供用于形成(优选原位形成)本发明水凝胶的说 明书。
[0079] 重要的是，发明人惊人地显示（参见实施例部分），当采用允许同时注射所述两种 溶液的注射器连接体形成所述凝胶时，没有在任何聚合物浓度的情况下观察到残余的液体 相。事实上，两种溶液的相关联的（contextual)注射允许两种液流的更快且更为均质的混 合，这导致瞬时的胶凝。
[0080] 本发明的水凝胶的不同组分可贮存至少约12个月-约24个月。在优选的贮存条件 下，在第一次应用之前，使所述制剂远离亮光（优选避光），并处于冷藏温度(是或约是2-8 。。)下。
[0081] 本发明的水凝胶需要在注射过程中制备。
[0082] 当本发明的水凝胶的溶液1是冻干形式时，需要在应用之前对其进行重建。重建优 选在无菌条件下采用溶剂例如水或盐水溶液(例如，注射用的〇.9%w/v氯化钠)进行，在使 用之前即在与溶液2合并（或混合)之前，因而在注射前重建。重建后，体积优选与冻干前相 同，例如，约0.5mL-5mL，更优选是或约是0.5、1或2mL。所述系统必须在其变得适于注射之前 允许溶解和均质化，例如，在30分钟期间。所述溶液应在，优选重建1小时内使用。
[0083]本发明提供适于药用或兽医用的含FGF-18均质水凝胶，尤其是单次应用。本发明 的包含FGF-18的水凝胶，可用于给予以改善软骨修复或治疗软骨疾病，例如，骨关节炎或软 骨损伤。
[0084] 这些均质水凝胶适用于注射并且是替代性的递送系统。在特别优选的实施方式 中，本发明的制剂用于关节内（i .a.)注射。其可通过直接注射进入缺损来给予，其中，所述 凝胶优选原位形成。在本发明的一个优选实施方式中，i . a.给予在关节中进行，所述关节选 自髋部、膝盖、肘部、腕部、踝部、脊柱、足部、手指、脚趾、手、肩部、肋骨、肩胛骨、大腿、腔部、 脚踝和沿脊柱骨节处的关节。在另一个优选的实施方式中，i.a.给予在髋部或膝盖的关节 中进行。
[0085] 提供以下实施例来进一步说明本发明的制剂和水凝胶的制备。本发明的范围不应 仅限于如下实施例。
【附图说明】：
[0086]图1:对于基于3重量％藻酸盐的凝胶进行的频率扫描测试，安慰剂(w/oFGF)，采用 藻酸盐溶液中的5411^/111]^的？6?-18(￥?6?(54))和藻酸盐溶液中的54〇11^/111]^的？6?-18(￥ FGF(540))〇
[0087]图2:对于基于4重量％藻酸盐的凝胶进行的频率扫描测试:安慰剂(w/oFGF)，采用 藻酸盐溶液中的5411^/111]^的？6?-18(￥?6?(54))和藻酸盐溶液中的54〇11^/111]^的？6?-18(￥ FGF(540))〇
[0088] 图3:对于基于3重量％药用级(PG)藻酸盐的凝胶进行的频率扫描测试:安慰剂(w/ 0 FGF)，采用藻酸盐溶液中的54mcg/mL的FGF-18(W FGF(54))和藻酸盐溶液中的540mcg/mL 的FGF-18(w FGF(540))。
[0089] 图4:对于基于4重量％PG_藻酸盐的凝胶进行的频率扫描测试:安慰剂(w/oFGF)， 采用藻酸盐溶液中的54mcg/mL的FGF-18(w FGF(54))和藻酸盐溶液中的540mcg/mL的FGF-18(w FGF(540))〇
[0090] 图5:候选安慰剂(w/o FGF)和活性分子(w FGF)的基于藻酸盐的凝胶的膨胀比，采 用非PG藻酸钠制备。
[0091] 图6:安慰剂(w/o FGF)和活性分子(w FGF)的基于藻酸盐的凝胶的膨胀比，不含I 型胶原，采用非PG藻酸钠制备。
[0092]图7:候选安慰剂(w/o FGF)和活性分子(w FGF)的基于藻酸盐的凝胶的膨胀度，采 用PG藻酸钠制备。
[0093]图8:在具有2mcg/mL I型胶原的4重量％藻酸盐凝胶中进行的FGF-18生物试验。 [0094]图9:基于藻酸盐的凝胶的SEM图像（100x)，所述凝胶来自3重量％或4重量％的聚 合物液体溶液，其包含〇、1或2mcg/mL的I型胶原和54mcg/mL的FGF-18。
[0095]图10:通过CLSM采集的3D图像的剖视图：（a)具有2yg/mL I型胶原的基于藻酸盐的 凝胶，与HTB94细胞孵育72小时之后，和(b)不含胶原的基于藻酸盐的凝胶，与HTB94细胞孵 育144小时之后。白色，用罗丹明B标记的HTB94细胞。右侧:凝胶顶部;左侧:凝胶底部。
[0096] 图11:人FGF-18的序列，对应于SEQ ID N0:l(a)，和斯普弗明的序列，对应于SEQ ID N0:2(b)〇
[0097]图12:在常规贮存条件（5 °C )、加速条件（25 °C )和胁迫条件(40 °C )下，冻干(FD)制 剂在3个月稳定中的pH随时间的变化。
[0098]图13:在常规贮存条件（5 °C )、加速条件（25 °C )和胁迫条件(40 °C )下，冻干(FD)制 剂在3个月稳定中的水分含量随时间的变化％。
[0099]图14:在常规贮存条件(5°C )、加速条件(25 °C )和胁迫条件(40°C )下，冻干(FD)制 剂在3个月稳定中的FGF-18含量随时间的变化。
[01 00]图15:在常规贮存条件(5°C)、加速条件(25 °C)和胁迫条件(40°C)下，冻干(FD)制 剂在3个月稳定中的藻酸盐含量随时间的变化。
[01 01 ]图16: a)在常规贮存条件(5 °C )、加速条件(25 °C )和胁迫条件(40 °C )下，冻干(FD) 制剂在3个月稳定中的特性粘度随时间的变化，计算为10-50(1的剪切速率下的平均值±标 准偏差。.图16b:剪切速率对时间0点和在常规贮存条件(5 °C )、加速条件(25 °C)和胁迫条件 (40 °C)下3个月稳定后的冻干制剂(FD)的特性剪切粘度的影响。
[0102] 图17:机械性质评价。图17a:在常规贮存条件(5°C)、加速条件(25°C)和胁迫条件 (40 °C)下，冻干(FD)制剂在3个月稳定中储存模量(G '）随时间的变化。XXX。图17b: 0时间和 在常规贮存条件(5°C)、加速条件(25°C)和胁迫条件(40°C)下的3个月稳定后，对于冻干制 剂(FD)进行的频率扫描测试。
[0103] 序列说明：
[0104] SEQ ID NO. 1:原始的人FGF-18的氨基酸序列。
[0105] SEQ ID从).2:重组截短的?6?-18(斯普弗明）的氨基酸序列。 实施例
[0106] 材料
[0107] 本实施例的重组截短的FGF-18(trFGF-18或斯普弗明）已经根据申请W02006/ 063362中所述的技术，通过在大肠杆菌中表达而在内部制备。在下述实施例中，斯普弗明和 FGF-18可互换使用。
[0108] 实施例中所用的其它主要物质如下：
[0109] -藻酸钠，西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)A2158，
[0110] -藻酸钠，FMC生物聚合物公司Keltone LVCR(药用级藻酸盐），
[0111] -蔗糖，默克(Merck) 1 · 07653 · 9029
[0112] -来自人皮肤的I型胶原，CalbioChem 234149,和CalbioChem 234138
[0113] -氯化钙(CaC12)，默克公司1.02382.0250，
[0114] -D-( + )_葡糖酸δ-内酯，西格玛奥德里奇公司G4750
[0115] -壳聚糖75%DD HMW，西格玛奥德里奇公司419419，
[0116] -壳聚糖95%DD LMW，法拉瓦利(Faravelli)公司43000，
[0117] -壳聚糖95%DD HMW，赫培医药(Heppe Medical)公司24711，
[0118] 如下述示例报告对于两种类型的水凝胶（即离子响应性和温度响应性水凝胶）的 制备和表征。离子响应性水凝胶已主要采用藻酸钠制备，其能够在二价阳离子的存在下形 成水凝胶，而温度敏感性水凝胶已主要采用壳聚糖制备，熟知其为温度敏感的多糖(Tomme 等，2008)。该研究中所用的两种聚合物是生物相容的天然多糖。
[0119] 为了在这一部分清楚区分凝胶过程之前的制剂和凝胶形成之后的制剂，分别将前 者称为"液体溶液"，而后者称为"凝胶"。
[0120] 方法
[0121] 胶凝时间和温度
[0122] 通过"倾斜测试"评价全部制剂的胶凝时间。凝胶在直径为3cm并在不同温度下孵 育的玻璃Petri皿中制备。在预定的时间间隔处，将Petri皿倾斜，并将制剂不显示任何流动 时的时间视为胶凝时间。
[0123] 机械性能
[0124] 水凝胶的流变学性质采用利用圆锥平板型几何学（1°斜度)且具有40mm直径的AR 2000流变仪(TA仪器)研究。将粗糙的皿施加至两个平板上，以避免样品在测试过程中滑动。 全部样品的厚度在约视样品体积而定。采用溶剂阱来维持水饱和氛围，以防止溶剂 在检测过程中蒸发。
[0125] 在水凝胶从Petri皿中的其原始液体溶液完全膨胀之后，将样品置于流变仪上并 在37°C平衡2分钟。然后，样品在频率扫描测试下于0.1-100拉德/秒的范围测试。振荡应力 设置为l〇Pa，且贮存为G'且损失为G"，记录模量随频率的变化。
[0126] 膨胀性能试验
[0127] 水凝胶的典型性质之一是其在水性溶液存在下膨胀的能力，这归因于其亲水性性 质。为了评价凝胶的膨胀性能，将它们浸入模拟滑液(MSF)溶液并随时间推移进行称重。实 验一式三份在底部配备了具有〇.4μπι多孔膜的悬挂插入件的12孔板中进行。
[0128] 对于该测试仅选择藻酸盐凝胶。凝胶在5mL小瓶中通过如下方式制备：混合200yL 的氯化钙溶液和400yL的聚合物液体溶液，按实施例2中所述制备，并在37°C孵育30分钟。然 后，将所述凝胶转移至先前称重过的空的插入件。对具有凝胶样品的插入件称重，并且将对 应的重量视作〇时间点的参照重量。将包含凝胶的插入件置入板中，并向孔中添加1.5mL的 MSF，确保插入件的多孔底部浸入在所述溶液中。该板用石蜡膜封闭，以避免蒸发现象，并在 定轨振荡器中于37°C孵育。在预定的时间点，从孔中移出包含凝胶的插入物。通过用滤纸吸 干多孔底部来移除过量的MSF，随后对具有凝胶的插入物称重。收集孔中的溶液，贮存于-80 °(：并用新鲜MSF替代。MSF的组成如下:PBS缓冲剂IX pH 7.3，F68(即泊洛沙姆188)0.25g/L， 人血清白蛋白（HSA) 1重量％，PenStrep 1重量％。使用前，MSF过滤通过0.22μπι滤器。结果以 膨胀比形式报告，即时间t时的重量与时间t = 0时的重量之比。
[0129] 扫描电镜(SEM)分析
[0130] 一旦凝胶形成，采用扫描电镜技术来分析聚合网络的三维结构。在关于"胶凝时 间"的段落报告的过程而之后，活性分子的基于藻酸盐的凝胶在直径为3cm的玻璃Petri皿 中制备，混合lmL的聚合物液体溶液和0.5mL的钙溶液。然后，使获得的凝胶在37°C孵育30分 钟。从浓度为3重量％或4重量％的藻酸盐(其均包含0、1或2yg/mL的I型胶原）的聚合物液体 溶液制备六份样品。然后，凝胶经48小时冻干。冷冻干燥周期包括冷冻步骤、首次干燥步骤 和二次干燥步骤。在冷冻步骤过程中，施加从室温到-45°C的跃变温度，然后是_45°C下保持 4小时的阶段。这之后是首次干燥步骤，其中在50mT 〇rr压强下使温度以1°C/分钟的速率从-45°C跃变至_10°C，然后是在50mT〇rr下于-10°C保持24小时和30分钟的阶段。二次干燥步骤 包括两个阶段:50mT 〇rr压强下以1°C/分钟的速率从_10°C至21°C的第一温度跃变，随后是 在50mTorr下于21°C持续12小时和30分钟的阶段，和，之后的50mTorr下以1°C/分钟的速率 从21°C至37°C的第二温度跃变，随后是50mT 〇rr下于37°C持续6小时的阶段。最终，达到室温 和大气压强。然后，对各样品染色并通过SEM分析。
[0131] 体外释放研究
[0132] 还分析用于膨胀测试的相同样品的体外释放测试。具体而言，贮存于-80°C的收集 相(如上文"膨胀性能试验"部分所述)用HPLC分析。所选的样品还通过Biacore分析(数据未 显示）。
[0133] 动物模型中的离体测试
[0134] 在离体动物模型中进行初步测试以研究藻酸盐制剂粘附至真实膝盖关节的能力。 基于实施例9中报告的细胞侵入试验的结果来选择测试的制剂。具体而言，所用模型由构成 牛膝盖的胫骨的上部和股骨的下部组成。采用活塞取样器在膝盖的两个部分上制造深lcm 且直径0.4cm的孔洞，以模拟进行微骨折术时通过手术制造的孔洞。然后，用包含凝胶中终 浓度为1.3yg/mL的I型胶原和36yg/mL的FGF-18的4重量％的藻酸盐制剂来填充所述孔洞。 测试采用输注用阀门进行，以连接两个不同的注射器，一个包含藻酸盐溶液，而另一个包含 钙溶液。同时推动两个注射器的活塞，从而阀门能够混合所述溶液。以垂直和颠倒位置将制 剂注射进入孔洞，以检验在不同的可能的真实体内情况中给予的可能性。37°C孵育约2小时 后，从孔洞移除凝胶以视检检验其状态。
[0135] 体外生物试验
[0136] 用于发光测试(试验板）的96孔板用50μ!7孔的藻酸钠4%溶液和25μ!7孔的CaC12 lOmg/mL溶液被覆，并在37°C，5%C02下孵育30分钟以允许形成基础水凝胶。
[0137] 96孔板(母板)从B排至Η排分配160μ!7孔的试验培养基。然后，FGF-18参照标准品 和样品以10yg/mL稀释于试验培养基中，并以三份重复形式添加（100μL孔)在Α排中，考虑 数组柱子作为重复样。通过采用多通道移液器，通过从A排转移40yL至Η排，从A排的孔至Η排 的孔进行1:5连续稀释。
[0138] 从母板，将25μ!7孔的FGF-18参照标准品稀释物转移至基础水凝胶被覆的96孔板 (试验板），并在37°C和5%C02下孵育1小时。
[0139] 以10，000，000SM接种于75cm2培养瓶，并在试验前持续饥饿24小时的BaF3/FGFR3c 细胞培养物以800.000个细胞/mL在试验培养基中稀释，然后以每孔中25yL/孔(20，000个细 胞/孔)添加至FGF-18和基础水凝胶被覆的板，在37 °C和5 % C02下孵育48小时。
[0140]以100此/孔添加 "ATPlite IStep"试剂，以在缓慢混合该板之后揭示增殖情况，并 采用发光计量仪读取发出的光。
[0141] 实施例1:预配制
[0142] 在预配制工作中，藻酸盐或壳聚糖与其它赋形剂混合，以获得具有i.a.注射可接 受的渗透压度的水性溶液（目标:350m0sm/Kg)。然后，测试液体溶液的胶凝时间和温度。进 一步采用不同浓度的FGF-18配制能够在5分钟内和/或于约37°C的温度下形成水凝胶的制 剂(数据未显示）。
[0143] 实施例2:离子响应性凝胶(藻酸盐)的制备
[0144] 挺塗
[0145] 在作为聚合物链之间的交联剂的二价阳离子(例如，Ca2+)的存在下，采用藻酸钠来 获得离子响应性凝胶，其能够形成产生水凝胶的聚合网络。该制剂由两种溶液构成，一种包 含所述聚合物且另一种包含所述离子。一旦混合在一起，所述溶液形成凝胶。
[0146] 对于安慰剂和活性分子凝胶两者而言，钙溶液是相同的，并且由milliQ水中浓度 为10mg/mL的氯化钙CaCl2溶液组成。在聚合物液体溶液中，除藻酸盐以外，添加 I型胶原和 活性分子(本文中为斯普弗明），以及蔗糖，用于调节渗透压度值。安慰剂聚合物液体溶液如 下制备水中浓度为70mg/mL的蔗糖溶液经制备并用于在搅拌下溶解浓度为3重量％ 或4重量％的藻酸钠。一旦藻酸盐溶解，搅拌下添加溶解于盐酸并在mi 11 iQ水中稀释至30μ g/mL或60yg/mL浓度的I型胶原溶液，以分别获得聚合物液体溶液中lyg/mL或2yg/mL的胶原 浓度。对于活性聚合物液体溶液的制备，浓度为3重量％或4重量％的藻酸盐采用包含浓度 为54yg/mL的主体FGF-18的mi 11 iQ水中浓度为70mg/mL的蔗糖溶液溶解。然后，对于I型胶原 的添加进行关于安慰剂报告的相同步骤。凝胶通过将聚合物液体溶液与钙溶液以2: l(v:v) 比例混合来制备。进一步表征之前，凝胶在37 °C孵育30分钟。
[0147] 安慰剂制剂的初步筛选:
[0148] 在测试生理离子量不足以促进胶凝过程之后，选择氯化钙形式的二价阳离子Ca2+ 作为交联剂。为了避免可能造成不希望的钙化现象的钙的应用，也测试了氯化镁，但结果较 不理想。
[0149] 然后筛选可能的制剂，并选择初步的安慰剂制剂。筛选过程中考虑并改变不同参 数，例如，藻酸盐浓度、CaCl2浓度、聚合物和钙溶液的体积比、其它赋形剂的存在，例如，D-( + )_葡糖酸S-内酯（用作胶凝迟缓剂），或HSA(添加至PBS以更好地模拟生理条件）。发现HSA 或D-葡糖酸的存在对于所得凝胶没有显著影响，因此将其弃去，以避免增加无用组分。
[0150] 还观察到，测试的值中，最优藻酸盐浓度是2.5重量％_4.5重量％，且尤其是3重 量％或4重量％。事实上，较低藻酸盐浓度（即1重量％或2重量％)是不可取的，因为没有记 录到完全凝胶形成。另一方面，过高的藻酸盐浓度(5重量％)会导致极高粘性的聚合物液体 溶液，以至于难以控制。
[0151] 所选的初步的安慰剂制剂由水中浓度为3重量％藻酸盐液体溶液和roS中CaCl2浓 度为1 Omg/mL的|丐溶液组成，比例为2:1 (v: v)。
[0152] FGF-18 的添加
[0153] 为获得活性制剂，测试对两种溶液添加 FGF-18。在全部下述测试中，两种溶液间的 比例保持恒定在2:1体积/体积藻酸盐溶液:钙溶液。视检发现，向藻酸盐溶液添加 FGF-18造 成沉淀现象。作为可能解决方案，使藻酸盐溶解于包含〇.25g/L的F68表面活性剂的PBS缓冲 剂中。不过仍出现沉淀。为克服该问题，在藻酸盐溶解之前将FGF-18添加至缓冲剂。由此，聚 合物溶液中的沉淀得以避免，并且蛋白质均质地分布，但相较于水中制备的安慰剂而言，所 得凝胶的物理一致性似乎受影响。此外，分析凝胶形成后的残余液体相，无论如何均能发现 微观沉淀。进一步研究证实沉淀由CaCl 2和PBS之间的相互作用所致，似乎导致磷酸钙的形 成。由此，从聚合物液体溶液和钙溶液消除PBS，并且仅采用mi 11 iQ水作为溶剂。
[0154] 制剂的优化
[0155] 在获得具有较密网格大小的凝胶的协助下，考虑了增加至高达4重量％的藻酸盐 浓度。这应使该材料具有体内更耐久的能力，以具有更长的包封蛋白质保留时间。还研究了 钙含量的最小化，以减少可能的副作用：最小获取量以获得凝胶，保持恒定的全部其它参 数，发现为4mg/mL。由于钙和聚合物溶液的混合会造成凝胶的立即形成，不可能检测pH和最 终制剂的渗透压度。因此，采用70mg/mL的蔗糖将聚合物液体溶液的渗透压度调节在约 300m0sm/kg的值。该添加造成凝胶形成中的改变，其中在不存在蔗糖的情况下没有观察到 残余液体相。假设蔗糖通过与藻酸盐或与钙相互作用来干扰凝胶形成。因此，再次将钙的浓 度升高至10mg/mL导致凝胶形成且无残余液体和沉淀物。
[0156] 检测聚合物溶液的pH，获得7.0的值。钙溶液显示pH值为5.3且渗透压度为约 170m0sm/kg〇
[0157] 聚合物液体溶液中的蛋白质的量设置为54yg/mL。
[0158] 最终，向聚合物液体溶液添加 I型胶原，以提高凝胶的细胞侵入能力，如 Rayatpisheh等(2011)报道。根据文献(Tsai等，1998)，测试了两种不同浓度，1和2yg/mL。
[0159] 在该初步筛选最后，选择了四种候选制剂。对于它们全部而言，钙溶液包含Mi 11 iQ 水中10mg/mL的氯化钙，而聚合物溶液的藻酸盐和I型胶原含量均不同，如表1所示。
[0160] 全部实验采用可简单获得的藻酸钠，由西格玛奥德里奇公司（Sigma Aldrich)提 供。在研究的最后部分，具有相同特点但认证为药用级(PG)的藻酸钠购自FMC BioPolymer Keltone公司。然后，四种候选制剂采用PG藻酸盐重新制备，并与非PG做比较，在视检中获得 相当的结果。还比较了采用PG和非PG藻酸盐获得的凝胶的膨胀和机械性质。
[0161] 预期尽管实验已采用氯化钙进行，但采用任何其它二价阳离子盐，例如，镁盐、铜 盐或锌盐均将获得相似的结果。
[0162] 实施例3:温度响应性凝胶(壳聚糖)的制备
[0163] 挺塗
[0164] 对于壳聚糖制剂的筛选，聚合物液体溶液的制备采用三种不同壳聚糖：高分子量 (HMW)的95 %脱乙酰度(DD)，低MW(LMW)的95%DD，和高MW(HMW)的75%DD。聚合物液体溶液 通过如下方式制备:在5°C或25°C，在剧烈搅拌下，向0.1N的乙酸溶液逐渐添加壳聚糖。计算 聚合物的量，其具有聚合物液体溶液中的1重量％、1.5重量％或2重量％的终聚合物浓度。 一旦壳聚糖完全溶解，即在搅拌下添加 mi 11 iQ水中浓度为10mM、100mM或500mM的KH2P〇4溶 液，以具有聚合物液体溶液中的ImM、10mM或50mM的终浓度。最终，添加浓度为mi 11 iQ水中20 重量％的0_甘油磷酸盐(β-GP)溶液，以调节最终液体溶液的pH至6.0、6.5或7.0的值。对于 接受的制剂，聚合物液体溶液中的β-GP的终浓度是0.5重量％-7重量％。并非总是能够达到 所需的pH值，因为需要过高量的β-GP，超过了350m0sm/Kg的目标渗透压度值或已在室温下 获得了凝胶。可用时，使聚合物液体溶液在37°C孵育直至凝胶形成。检测筛选的全部制剂的 渗透压度，弃去渗透压度高于350m0sm/Kg的制剂，即，终β-GP浓度高于2.5重量％的制剂。
[0165] 安慰剂制剂的初步筛选:
[0166] 温度响应性凝胶基于改变局部环境温度经历了溶液-凝胶（sol-gel)转变的聚合 材料。报告壳聚糖能够随温度变化经历溶液-凝胶转变，但该过程受聚合物分子量(MW)、其 脱乙酰度(DD )、溶液中的聚合物浓度、温度、时间和聚合物溶解过程中的混合速度、溶液的 终pH和其它赋形剂的存在的高度影响。
[0167] 因此，需要对于不同可能的组合进行彻底筛选。应注意，壳聚糖仅可冗余酸性pH的 水中。升高的pH会导致其聚集和沉淀。克服该问题的一种方式是采用β-GP，以增加 pH同时维 持溶液中的壳聚糖。
[0168] 本研究先着重于75 % DD的HMW壳聚糖。在0.1N盐酸中制备若干聚合物液体溶液，终 壳聚糖浓度从1重量％ -2.5重量％不等，终β-GP浓度为1.6重量％ -50重量％(1.6、5、5.6、8、 30、50% )、不同赋形剂，即胶质、葡萄糖胺、透明质酸、羟基-乙基纤维素、羧基-甲基纤维素、 海藻糖，和从6.0到7.0的不同终pH值。据报道，这些赋形剂在诱导凝胶形成中起作用(Cheng 等，2010;Schuetz等，2008;Yan等，2010)。
[0169] 筛选的制剂中仅一种能够在37°C孵育5分钟之后形成凝胶，但β-GP的量高于8重 量％，其在文献中报道为上限，高于其的浓度记录为具有细胞毒性(Ahmadi等，2008)。因此， 如下制剂全部在考虑该限制的情况下制备。所述筛选持续移向具有较高DD值的壳聚糖。第 一试验基于95 % DD的LMW壳聚糖。聚合物溶液均在0.1N盐酸中制备，在剧烈搅拌下于5 °C或 25 °C溶解聚合物。
[0170] 聚合物完全溶解之后，添加其它赋形剂，仅在结束时添加 β-GPj-GP负责增加 pH 值，然后促进胶凝过程。第一试验着重于仅基于具有不同组合的相对浓度的壳聚糖和β-GP 的配方。观察到，采用高浓度的壳聚糖(2%或3重量％ )和高浓度的0-GP(8重量％ )，已经在 室温下出现凝胶，并且在一些情况中，于5°C下也如此。
[0171] 降低组分的浓度，制剂在37°C下长期孵育后仍残余液体。仅在一例中，记录到凝胶 的形成，但在37°C孵育2小时之后，对于该研究的目的而言时间过长。因此，必需添加赋形剂 来改善该制剂。选择羟基-乙基纤维素(HEC)作为最合适的赋形剂，并进行进一步筛选。在该 评价过程中，壳聚糖浓度为1.5重量％-2重量％，且起始HEC浓度为0.5重量％，但在这些条 件中，聚合物溶液甚至能在室温下于添加 β-GP过程中变为凝胶，如果其浓度高于1.8重 量％。能够在37°C孵育13分钟之后变为凝胶的液体溶液可采用如下组成获得：1.5重量％的 壳聚糖、0.5重量％的册(：和1.7重量％
[0172]制剂的优化
[0173]为了改善该制剂，进行如下试验，将β-GP的浓度几乎恒定地保持在1.65-1.7重 量％的值，壳聚糖浓度从1.5重量％到1.8重量％不等，且HEC的量逐渐降低至多至0.1重 量％。
[0174]采用该策略选择若干候选制剂。然而，该研究并没有在这一方向上继续，因为发现 HEC赋形剂可能包含污染物(据报道具有细胞毒性），并且，另一方面，造成壳聚糖存在下的 胶凝过程的调节(Hoemann等，2007)。先前实验中测试的其它赋形剂，例如胶质或葡萄糖胺， 未产生积极结果。
[0175] 然后开始最终的筛选工作，采用三种壳聚糖聚合物，其在分子量和DD上有差异： 75 %DD的HMW壳聚糖，95 %DD的HMW壳聚糖和95 % DD的UMW壳聚糖。计划采用85 % DD的LMW壳 聚糖进行该研究，但该物质并没有在研究结束之前获得。在该研究中，以三种固定浓度1、 1.5和2重量％测试了各壳聚糖，并且制备聚合物溶液以具有6.0、6.5和7.0的终pH值。为了 减少所用β - G P的量以增加溶液的p Η值，将聚合物溶解于0.1N乙酸，而不是先前实验所用的 0.1Ν HC1。还监测最终溶液的渗透压度并保持在低于约350m0sm/kg的值。因此，弃去需要过 高量的β-GP以达到所需pH值并且还导致过高的渗透压度值的制剂。在这些筛选测试中，还 研究了离子强度的贡献，因为据报道，盐的存在可能会对胶凝过程有积极贡献(Filion等， 2007)〇
[0176] 由于必须避免钠盐以避免其与蛋白质可能的相互作用，选择KH2P〇4并添加至聚合 物溶液至终浓度为lmM、10mM或SOmMJS^DD的壳聚糖没有产生积极结果，因此完全弃之。 95%DD的HMW壳聚糖产生积极结果:高于1重量％的壳聚糖浓度需要过高量的β-GP以达到固 定的pH值，超过了目标渗透压度值，和1重量％的制剂无法在37 °C形成凝胶。采用具有95 % DD的LMW壳聚糖选择了两种候选制剂，因为其在37°C经历溶液-凝胶转变，但这些聚合物溶 液的制备是完全不可再现的。事实上，观察到获得凝胶所需的时间和聚合物液体溶液的物 理宏观特点显著变化，取决于溶解聚合物花费的时间、聚合物溶解过程中和赋形剂混合过 程中混合的速度，和，最后基于温度和制备的溶液的体积。
[0177] 结果中的这一高可变性导致决定中断对于该聚合物的研究。
[0178] 实施例4:胶凝时间和温度
[0179] 计划将本工作中研究的全部制剂用作原位形成凝胶。因此，对于离子和温度响应 性凝胶而言，重要的要求是快速胶凝时间。实际上重要的是鉴定出具有良好胶凝性质但其 胶凝过程既不过快（以允许注射)也不过慢(没有获得松散材料的风险）的配方。胶凝时间采 用倾斜测试确定:将溶液颠倒，并且在没有观察到液体流动的情况下认为凝胶形成。
[0180] 基于离子的制剂
[0181 ]在基于藻酸盐的制剂的情况中，胶凝过程受到钙溶液浓度和钙与藻酸盐溶液之间 的相对比例的影响。凝胶在玻璃Petri皿中制备，首先添加藻酸盐溶液，然后添加钙溶液，并 试图使两种溶液尽可能的均化。如果氯化钙的量不够，则观察不到凝胶形成，甚至在37°C长 期孵育也是如此。递增交联剂(钙)的量并调节聚合物溶液:该溶液比例，几乎在两种溶液混 合在一起的瞬时形成了凝胶。在一些情况中，观察到残余的液体相。将在37°C孵育之后，液 体完全消失所需的时间视为胶凝时间。
[0182] 胶凝时间从5分钟到2小时不等，并且在一些情况中，没有实现液体的完全消失。采 用4重量％浓度的藻酸盐的聚合物液体溶液的胶凝比采用3重量％的情况要快。添加 I型胶 原没有显示对于胶凝时间的任何影响。结果总结在表2中。4重量％藻酸盐浓度的聚合物溶 液的两种候选制剂显示胶凝时间为5分钟，而3重量％聚合物溶液的两种候选物显示15分钟 内的完全胶凝。
[0183] 重要的是，当采用允许同时注射两种溶液的注射器连接体形成凝胶时，在任何聚 合物浓度均没有观察到残余的液体相。事实上，两种溶液的相关联的注射允许两种液流的 更快且更为均质的混合，这导致瞬时的胶凝。
[0184] 预期尽管实验已采用氯化钙进行，但采用任何其它二价阳离子盐，例如，镁盐、铜 盐或锌盐均将获得相似的结果。
[0185] 基于温度的制剂
[0186] 设计温度响应性凝胶在制备和操作期间于室温下是液体，但在注射后（于生理条 件37°C下)变为凝胶。测试如下进行，在5°C、25°C和37°C孵育不同的基于壳聚糖的制剂，以 通过倾斜测试监测随温度变化的胶凝时间。结果总结于表3。
[0187] 取决于壳聚糖和β-GP浓度，胶凝性能显著变化。采用过度浓缩的β-GP的溶液，胶凝 已在制备液体溶液的过程中于室温下出现。由此，重要的不仅在于通过改变组分的浓度来 优化制剂，还在于在5°C下溶解并混合全部成分，然后，在37°C孵育该液体溶液。在合适的优 化之后，如实施例3所述，15分钟后于37°C获得凝胶形成，但发现结果不具有可再现性。具体 而言，观察到胶凝时间受溶解壳聚糖并将其与其它组分混合所需的速度和时程的影响。
[0188] 实施例5:机械性能
[0189] 水凝胶是一组半固体材料，其由具有高保水能力的亲水性聚合物网络构成。一般 而言，水凝胶具有介于粘性液体和弹性固体之间的机械特点（粘弹性质）（Anseth等，1996)。 重要的是其机械性质在类似于目标体内环境的条件下确定并检测。
[0190]动态机械分析能够表征水凝胶在施加振荡应力(通常是剪切力）之后反映联合的 粘性和弹性响应的粘弹性能。粘弹材料的特点是储存模量，G'，和损耗模量或粘性模量，G"， 其分别给出对于动态应力-应变性能的弹性和粘性贡献。
[0191]从流变学角度，水凝胶定义为G '>G"且G '和G"均独立于振荡频率的粘弹材料 (Peppas等，2000)。具体而言，G'越高，水凝胶的强度越高，并且，G'和G"之间的差异越大，液 体样对比固体样性能越低。在该部分中，我们报道了通过进行频率扫描测试，采用配备有圆 锥平板型几何学的流变仪(参见实验部分)对于藻酸盐水凝胶的粘弹性质的研究。在频率扫 描测试中，施加一定频率范围(0.1-100拉德/秒)的振荡剪切应力。然后，对比频率对G'和G" 作图。
[0192] 图1显示，关于3重量％藻酸盐凝胶的频率扫描结果，其具有藻酸盐溶液中的不同 胶原含量(0、l、2yg/mL)和藻酸盐溶液中的不同FGF-18含量(0、54、540yg/mL)。全部样品在 添加钙溶液之后于37°C孵育30分钟之后分析。进行采用藻酸盐溶液中540yg/mL的FGF-18的 检测以研究高十倍的蛋白质浓度是否会影响材料的内部结构。
[0193] 如同所见，全部样品显示凝胶的典型性能，显示G'》G"，其均独立于角频率。全部 样品的G'值均在约300和400Pa之间。G'的这些差异并不表示这些材料的弹性响应中的实质 性差异。该表明，制剂中低浓度的胶原（1或2yg/mL)不影响0时间点时的凝胶的机械性质。无 论如何，其可促进凝胶在孵育后的较高稳定性，这将在下一部分中显示。
[0194] 重要的是，还注意到，藻酸盐溶液中54或540yg/mL的FGF-18的存在不影响材料的 机械性质。事实上，在两种不同蛋白质浓度下，于安慰剂和活性分子凝胶之间没有鉴定到显 著差异或趋势。这是重要参数，因为其允许FGF-18的制剂在藻酸盐溶液中具有处于宽范围 蛋白质浓度(〇 -540yg/mL)且不影响基质的性质。
[0195] 图2显示由4重量％藻酸盐候选物、对应的安慰剂和不含胶原的安慰剂获得的结 果。同样地，在该例中，所有样品显示凝胶的典型性能，G'》G"，均独立于角频率。同样地，没 有观察到两种胶原和FGF-18(藻酸盐溶液中54或540yg/mL)的影响，所有G'值均处于约380 和500Pa。可预计，较高浓度的藻酸盐将导致较高交联密度，以及弹性模量，G'。然而，记录的 差异并不显著。
[0196] 无论如何，重要的是强调，添加至3重量％和4重量％藻酸盐溶液的钙溶液是相同 的。这意味着，使3重量％藻酸盐溶液接触甚至可导致较密网格的较高相对浓度的交联剂， 取决于溶液中聚合物链的排列。
[0197] 在研究结束时，可用药用级(PG)藻酸盐。为了确保藻酸盐纯度水平不影响凝胶结 构，同样在基于PG藻酸盐的凝胶上进行频率扫描测试。结果示于图3和图4。
[0198] PG藻酸盐获得的结果与采用非PG藻酸盐获得的结果完美相当。唯一差异是3重 量％和4重量％凝胶中结果的离散稍宽。这可能归因于原料分子量分布的细微差异，尽管PG 和非PG藻酸盐的技术参数报告相同的规格。
[0199] 无论如何，同样地，没有观察到3重量％和4重量％系统中的特别的趋势或显著差 异，并且4重量％系统中观察到的略高的G'值在PG原料中也经证实。
[0200] 实施例6:膨胀性能
[0201] 已对水凝胶材料进行评价的典型参数是其在液体存在下膨胀或收缩的能力。采用 该测试来预计材料在体内条件(此时其将接触生理滑液)下注射的性能。
[0202] 该研究仅对根据实施例2制备的基于藻酸盐的凝胶进行，因为弃去了壳聚糖制剂 (如实施例3中所解释）。因此，这四种候选的基于藻酸盐的凝胶在37°C接触MSF孵育，并且监 测其性能30天(参见方法部分的"膨胀性能试验"）。
[0203] 图5中，报告了安慰剂和活性分子凝胶的，四种候选的基于藻酸盐的凝胶的1个月 的膨胀性能。作为参照，还测试了不含I型胶原的相同凝胶，以研究其对凝胶结构特点的作 用。这些结果如图6所示。图5和图6指表示非药用级藻酸盐(非PG)。
[0204] 在这两种情况中，藻酸盐浓度越高，膨胀比越高。该性能似乎与通过流变学测量获 得的结果不同。具体而言，较高聚合物浓度应形成较密网络，这进而通常与较低的吸收水性 溶液的能力相关联。并且，需要考虑使Ca 2+浓度保持恒定，从而，聚合物和交联剂之间的比例 通过使聚合物浓度变化来改变。较低的交联剂可及度(avai lability)可导致形成一些区 域，这些区域中的聚合物未交联，从而允许水容易地透过。这可解释3重量％和4重量％藻酸 盐的候选物之间的膨胀比的差异，并且通过下一部分所示的SEM照片证实。
[0205] 图5和图6之间的比较显示，I型胶原的存在会影响膨胀性能，尤其是动力学方面。 而在不存在胶原的情况下，全部凝胶增加了其重量(监测约15天），然后达到稳定阶段，胶原 的存在，独立于浓度，导致正弦趋势。在胶原存在下，第一稳定阶段在2天后达到，指示对应 于凝胶可保留的最大量的水的均衡膨胀。该值低于胶原不存在的情况下对应的膨胀比值， 表明凝胶具有较紧结构，如同添加胶原之后预计的那样。后续膨胀比在孵育15天之后增加， 指示网络溶蚀现象的开始，随着网格变松，继而引起MSF溶液吸收。然后，第二稳定阶段在24 天之后达到，并且保持直至1个月的观察期的末尾。预计网络的进一步溶蚀会导致进一步增 重，因此，膨胀比先增大再减小，直至出现完全溶蚀。在胶原不存在的情况下（图6)，在缓慢 溶蚀之后观察到连续膨胀比增大。该性能可能与同时发生的溶蚀和水的摄入相关(归因于 凝胶的较松散结构）。
[0206] 如上所述，没有记录到采用聚合物溶液中1或2yg/mL的I型胶原获得的凝胶之间的 差异。
[0207] 有趣的是，在安慰剂和活性分子凝胶之间也没有观察到差异。这表明，凝胶中36μ g/mL终浓度的FGF-18不影响该材料的内部结构。这些实验采用相同制剂重复，此时采用PG 藻酸盐制备，且结果示于图7。
[0208] 如同所见，结果与采用非PG藻酸盐获得的那些完美地相当，唯一的差异是，相较于 非PG材料，3重量％和4重量％藻酸盐凝胶膨胀比的较小偏差。对于显示预计性能的4重量％ 凝胶，该实验进行长达50天，即在第二稳定阶段之后的重量减小，指示缓慢连续溶蚀。
[0209]实施例7:扫描电镜(SEM)分析
[0210] 一旦凝胶形成，拍摄SEM图像以研究材料的显微结构。该分析在新鲜制备的，然后， 冻干的凝胶上进行。
[0211] 在两种聚合物浓度下进行的，具有和不具有I型胶原的样品比较示于图8,显示胶 原对于3重量％藻酸盐凝胶的微孔性不具有显著作用，且对于仅4重量％仅稍有作用，添加 有胶原（1或2yg/mL)时其显示稍紧的结构。
[0212] 对于显微照片，观察到两种材料之间的多孔性差异，4重量％藻酸盐凝胶显示的空 洞大于3重量％。这同样可通过3%中交联剂的相对浓度来解释。
[0213] 藻酸盐制剂重量(wt)高于4重量％的情况。这可在3重量％凝胶中诱导较密结构。
[0214] 这些图像与膨胀结果一致，并且与机械性质分析明显矛盾。事实上，4重量％凝胶 中存在的较大空洞解释了相较于3重量％观察到的较高膨胀程度。另一方面，对于4重量％ 观察到的稍高弹性模量G'，可解释如下:大孔中存在非交联的或松散交联的藻酸盐链，这无 论如何都对G '有贡献。
[0215] 实施例8:体外释放研究
[0216] 体外释放研究关联膨胀测试进行，在考虑的各时间点收集各孔的吸收相。来自活 性的基于藻酸盐的凝胶的全部样品通过RP-HPLC分析。此外，还通过Biacore，一种更特定且 更灵敏的分析方法，分析所选样品，以确认通过RP-HPLC获得的结果。
[0217] 在起始该实验之前，评价测试的可行性。具体而言，研究了孔板系统中FGF-18的回 收。事实上，根据先前的研究，已知蛋白质趋于粘附至不同的塑料材料，例如，聚苯乙烯，和 膜。在不同实验条件下评价已知量的游离FGF-18的回收。测试了 F68表面活性剂的存在和/ 或用HSA或FGF-18的浓缩溶液对孔进行预处理的可能的积极作用。实验如下进行:在插入物 和各孔的如下溶液中添加浓度为500yg/mL的FGF-18溶液：
[0218] -a)PBS中1重量％HSA的溶液，
[0219] -b) PBS+F68中1重量％的批六溶液，
[0220] -c)和d)与a)和b)相同，但用HSA浓缩溶液对孔进行预处理，
[0221] -e)和f)与a)和b)相同，但用FGF-18浓缩部分对孔进行预处理。
[0222] 37°C孵育16小时后，对于全部样品，分析孔和篮中的相，并且回收率达到约75%。 因此，由于回收率相当，用于改善测试的策略均没有显著的积极作用。然后，体外释放采用 PBS中的1重量％HSA溶液进行，采用F68 0.25g/L作为吸收相。
[0223] 实验中，使凝胶在孵育条件下保持30天。通过HPLC或Biacore均没有在任何收集的 部分中检测到FGF-18。这表明，在观察阶段，蛋白质被捕获于凝胶基质中。
[0224] 考虑FGF-18和藻酸盐之间发生强相互作用，这些结果是可期待的。事实上，考虑到 这两种分子的结构，可能发生离子和疏水相互作用。此外，FGF-18是肝素结合蛋白，其显示 与肝素的高能二级相互作用。藻酸盐是分子结构与肝素相似的天然碳水化合物，因此，这两 种大分子之间很有可能发生极强的二级相互作用。
[0225] 为证实这一点，进行分离实验，显示仅HIC或肝素被覆的色谱柱能够分离FGF-18和 藻酸盐。
[0226] 实施例9:体外细胞侵入试验
[0227] 制剂中FGF-18的给予能够在注射后产生3D结构，如基于藻酸盐的水凝胶的情况， 这能够将活性分子(API)定位在注射位点。同时，所述制剂能生成支架，生长中的软骨可锚 定于其中。由此，对于所选的基于藻酸盐的凝胶而言，重要的要求是该材料与软骨细胞细胞 的相容性和被细胞侵入的能力。因此，基于原位形成载有FGF-18的水凝胶，研究了可选制剂 的细胞侵入、细胞毒性和趋化性性质。
[0228] 采用两种软骨肉瘤细胞系进行体外细胞侵入试验，分别是ATDC5鼠软骨形成细胞 系和CRL-7891人软骨肉瘤细胞系，其常用于研究软骨细胞性能。实验在由包含0、1或2yg/mL 的I型胶原和54yg/mL FGF-18的4重量％或3重量％的藻酸盐液体溶液形成的凝胶上进行。
[0229] 孵育24、48、72和144小时之后监测细胞侵入。将凝胶从孔中移出，并切下薄片，置 于玻璃上，并在具有Zeiss A-Plan 10χ/0·25目镜玻璃的Axiovert 200显微镜上观察。通过 该方式，能够分析凝胶截面(section)，并将细胞定位在不同水平的穿透深度。采集照片并 通过AxioVision 4.2软件处理。一些样品还通过共聚焦激光扫描显微镜(〇^10分析，采用 FVlOOlympus，可进行有限时间的演示应用。对于这些实验，凝胶用roS中的浓度为0.2yg/mL 的罗丹明B溶液处理，在分析前1小时，将其添加至孔中的培养基。采用罗丹明B来对细胞染 色，然后用553nm的激光激发样品来进行视检。
[0230] 在24、48、72和144小时观察具有3重量％或4重量％聚合物液体溶液，含或不含胶 原的基于藻酸盐的凝胶的细胞侵入。在各时间点，切下凝胶薄片来观察凝胶截面(数据未显 示）。首先观察到制剂与细胞的良好相容性，因为基于藻酸盐的凝胶似乎对于两种细胞系均 无毒性，其甚至显示与不同物种(小鼠和人)源性的相容性质。
[0231] 在具有4重量％的藻酸盐凝胶的制剂中，在凝胶内部发现更多的细胞和细胞簇。
[0232] 对于4重量％的包含2yg/mL I型胶原的藻酸盐凝胶可观察到不同性能。相较于其 它制剂，更多细胞侵入该凝胶。此外，细胞不产生簇，但似乎沿着凝胶良好分布为单一且孔 分开的细胞。这一方面似乎揭示其处于健康状态。最终，观察到其随时间推移穿透进入凝胶 基质。比较含2yg/mL胶原和不含胶原的4重量％的凝胶，观察到在胶原存在下的侵入更快且 更加均质(参见图9)。该分析通过CLSM进行，证实了细胞侵入凝胶基质的能力。
[0233] 实施例10:动物模型中的离体测试
[0234] 基于这些藻酸盐制剂的治疗可与微骨折术策略相联合。因此，为了证明凝胶与该 技术的相容性，需要对离体动物模型进行初步研究，并由此采用牛膝盖。
[0235] 实验在含2yg/mL I型胶原的4重量％藻酸盐，候选凝胶进行。从其它候选物中选择 该凝胶，是因为其在上文所示的细胞侵入方面显示最有前景的结果。
[0236] 在胫骨上部和股骨下部制造空洞，其具有微骨折术手术预期的相同尺寸（1cm深X 4_直径）。然后，空洞用候选凝胶填充，所述填充采用注射器连接体在注射时分别混合藻酸 盐溶液和钙溶液。这允许瞬时获得均质凝胶，没有任何水滴现象。在垂直和颠倒位置均进行 注射，证实在两种情况中，凝胶均保持在空洞内，且没有观察到材料滴下。还使关节经历振 荡和快速移动，证明凝胶良好固定在空洞中，且没有观察到材料损失。然后，在37°C孵育2小 时之后评价带有注射的凝胶的关节:凝胶仍填充整个空洞，并且，一旦取出，其看起来稍带 红色，表明从裂口溢出的血液被该凝胶吸收。
[0237] 这些初步的结果表明藻酸盐制剂在微骨折术策略中的可行性。
[0238] 实施例11:体外生物试验
[0239]按照方法部分所述进行的细胞增殖试验显示，捕获在凝胶中的FGF-18以清晰的剂 量响应性曲线具有生物活性，如图10所示。
[0240] 结论
[0241 ]在添加氯化钙作为交联剂后，从藻酸钠获得离子响应性凝胶，而热响应性凝胶从 壳聚糖获得，其中添加 β-GP以调节pH，不发生聚合物的任何沉淀。
[0242]测试了不同聚合物浓度的基于藻酸盐或壳聚糖的制剂，并且考虑添加其它赋形剂 来调节制剂的pH和渗透压度，且在一些情况中，有利于胶凝过程。
[0243]胶凝时间结果显示，相较于壳聚糖，基于藻酸盐的凝胶显示极快且可再现的胶凝。 因此，选择藻酸盐凝胶进行进一步开发。
[0244] 选择四种候选凝胶制剂来表征机械性质、膨胀、体外释放和细胞侵入，通过向包含 3%或4重量％藻酸盐、1或2yg/mL I型胶原、70mg/mL蔗糖和54yg/mLFGF-18的藻酸盐溶液添 加10mg/mL氯化钙溶液来形成。藻酸盐溶液体积与钙体积比是2:1。
[0245] 候选凝胶的机械性质不受胶原浓度或FGF-18浓度(至少高达540yg/mL)的影响。该 是一项重要目标，因为FGF-18在水凝胶中的目标浓度仍未确定，这允许以宽范围浓度在这 些基质中配制FGF-18而不影响最终凝胶的特点。在3重量％和4重量％藻酸盐凝胶中没有观 察到弹性模量G'的主要差异，全部显示介于约300和500Pa之间的值，4重量％凝胶显示较高 的值。
[0246] 全部候选凝胶显示相同的膨胀特性，指示相似的水合和降解过程。仅在绝对值中 存在差异，4重量％藻酸盐凝胶稍高。该结果与SEM显微照片一致，这证明了这些凝胶的孔的 车交高尺寸（higher dimension)。
[0247] 模拟滑液中37°C孵育15天之后，全部候选物显示由重量增加所指示的第一降解过 程。事实上，网络的初始降解通常会导致较松散的结构，其因而能够接纳较大量的水。1个月 后，连续的网络降解导致肉眼可见的凝胶溶蚀的起始，这由缓慢的重量损失所指示。同时， 在50天观察之后，凝胶仍未完全溶蚀的，这由多孔篮中一些凝胶的存在所指示(50天的膨胀 比值）（Lo Presti C.等，2011;Dang等，2011)。
[0248]开展细胞侵入试验。显示最具前景的细胞侵入结果的凝胶制剂包含4重量％藻酸 盐和2yg/mL胶原。然后，选择该制剂进行离体实验来研究该凝胶的粘附性质。在牛膝盖上进 行的这些离体实验显示，候选藻酸盐凝胶可采用用于藻酸盐和钙溶液的双重注射器来注 射，以垂直或颠倒方向注射均不显示任何滴下。此外，凝胶显示完美填充，和对模拟微骨折 术情况的软骨空洞的粘附(数据未显示）。
[0249 ]细胞增殖试验显示，捕获在凝胶中的FG F -18以清楚的剂量依赖性曲线显示生物活 性。观察50天之后，凝胶仍未完全降解，并且体外释放实验未显示任何FGF-18在模拟滑液中 释放的证据，这表明，FGF-18将停留在凝胶中，因此将很有可能更有效于长期作用于已迀移 进入凝胶的细胞。因此，这些结果是具有前景的。
[0250]实施例12:冷冻干燥的制剂
[0251 ]制备包含FGF18、糖(蔗糖)和I型胶原的聚合物液体溶液(参见实施例2)之后，将溶 液分配进入小瓶。各小瓶（l〇ml Fiolax Clear 45x24,玻璃形式SCHOTT)用2mL的聚合物液 体溶液填充。所有填充的小瓶经历冻干处理。具体而言，该处理具有以下步骤：
[0252] -冷却期，从25°C至_40°C，持续1小时，其中产品冷冻开始
[0253] -冷冻期，-40°C，持续4小时，其中产品保持冷冻
[0254] -真空期，其中压强骤降至真空
[0255] -第一干燥期，温度从-40 °C升至-10 °C，持续30分钟，然后在-10 °C持续10小时
[0256] -第二干燥期，其中温度从_10°C升至21°C，持续30分钟，然后在21°C持续34小时
[0257] -第三干燥期，其中温度从21°C升至37°C，持续16分钟，然后在37°C持续20小时。
[0258] 冻干处理完成后，小瓶用塞子密封并贮存于2-8 °C。
[0259] 冻干产品需在注射应用前重建。需要将其在室温平衡，然后将2mL的WFI(注射用 水)注射进入小瓶，然后将小瓶涡旋并晃动以促进块状物重建。使系统溶解并均质化持续30 分钟，然后其变得适于注射。
[0260] 然后，使冻干制剂在3个不同温度下经历3个月的稳定性研究。5°C、25°C下的常规 贮存条件以实施加速稳定性，和在40°C的胁迫条件下。在用2ml的水重建样品之后，分析在 0、2、4、8和12周的时间进行。后续参数如下：
[0261] . pH
[0262] ?含水量
[0263] · FGF18含量
[0264] ?藻酸盐含量
[0265] ?藻酸盐MW分布
[0266] ?粘度
[0267] ?机械性能
[0268] ?细胞侵入能力
[0269]下文是多至12周的主要结果。
[0270] 21:在全部三种不同温度，随孵育时间推移，没有记录到制剂pH值的显著变化。FD 制剂的pH高于液体形式(最可能归因于其经历的过滤和冻干处理），但其不随时间推移而变 化。图12所示的数据表明，制剂在常规贮存条件下稳定长达12周。
[0271]含水量:残余水分含量均在接受标准(3%)内。对于贮存于2_8°C的制剂而言，该值 恒定，而在25°C孵育12周之后，其随时间推移稍有增加，并且在40°C持续2周后甚至增加更 多，如同预期。该数据(参见图13)表明，制剂在常规贮存条件下稳定长达12周。
[0272] FGF18含量:在全部三种不同温度下，随时间推移，没有观察到制剂中FGF18含量的 显著变化，其中总含量稍低于54μg/ml的目标浓度，这最可能归因于不同加工步骤中且尤其 是过滤过程中的材料损失。在不同时间点观察到的差异最可能归因于仍在开发中的方法的 变化，事实是既要考虑FGF18的量接近于方法的检测限制，又要考虑小瓶含量的变化，这也 通过结果的显著STD DEV而得以证明：事实上，溶液的高粘度不允许实验室水平上操作的准 确的填充体积。综上，数据表明，制剂在常规贮存条件下稳定长达12周(参见图14)。
[0273]藻酸盐含量：随时间推移，在全部三种不同温度中没有观察到藻酸盐含量的显著 变化。观察到的变化最可能归因于仍在开发中的方法的变化，并考虑到小瓶含量的变化，因 为溶液粘度不允许在实验室水平上得到很准确的填充过程。图15所示的数据表明，制剂在 常规贮存条件下稳定长达12周。
[0274] 藻酸盐MW分布:在全部三种不同温度下，随时间推移，没有观察到制剂的色谱特性 的变化，从而也没有总体聚合物分子量分布上的变化:峰指示宽MW分布，从大于870kDa到约 40kDa，其中最大值在约520kDa。MW分布通过与良好确定的MW的标准参照物比较来评估。峰 的左侧部分检测到的小平台归因于胶原。数据表明制剂在常规贮存条件下稳定长达12周 (数据未显示）。
[0275] 粘度:对于贮存于25°C和40°C的样品，在时间0点观察到制剂粘度的轻微下降，这 归因于加速的降解条件，而对于贮存于常规条件(2_8°C)的样品没有观察到显著差异:观察 到的变化最可能归因于方法变化和填充过程。数据表明制剂在常规贮存条件下稳定长达12 周(参见图16)。
[0276]机械性能:采用用水在稳定性研究的各时间点重建的藻酸盐FD制剂通过与氯化妈 溶液混合来形成水凝胶。研究了所得水凝胶的机械性质。在全部三种不同温度下，随时间推 移，没有观察到储存模量G'的变化，因而机械性质无变化。图17所示的结果表明，制剂在常 规贮存条件下稳定长达12周。
[0277]细胞侵入能力:采用用水在稳定性研究的各时间点重建的藻酸盐FD制剂通过与氯 化钙溶液混合来形成水凝胶。研究了所得水凝胶的细胞侵入能力，将水凝胶与细胞孵育72 小时，然后通过共聚焦激光扫描显微镜来分析样品。随时间推移，考虑贮存于相同温度条件 下的样品，没有观察到能够穿透进入水凝胶基质中的活细胞的数量的显著变化(数据未显 示）。在各时间点，贮存于40°C的样品显示的穿透细胞的数量高于贮存在2-8°C的样品，表明 在较高温度下孵育造成聚合物基质的部分变化。数据表明制剂在常规贮存条件下稳定长达 12周。
[0278]结论:冻干藻酸盐制剂在常规贮存条件(2_8°C)下显示良好稳定性长达12周，且看 起来至少与对应的液体制剂一样稳定。
[0279] 表格
[0280] 表1:四种候选的基于藻酸盐的制剂的钙和聚合物液体溶液的组合
[0282]表2:活性的基于藻酸盐的制剂的胶凝时间
[0284]表3:选择的基于壳聚糖的制剂在37 °C的胶凝时间
[0286] 参考文献
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[0312] 26.W02012113812
【主权项】
1. 一种均质水凝胶，其包含FGF-18、藻酸盐、胶原、作为稳定剂的糖和二价阳离子盐，或 由它们组成。2. 如权利要求1所述的均质水凝胶，其中，所述水凝胶由两种溶液形成： a. 第一均质溶液(溶液1)，其包含FGF-18、藻酸盐、胶原和作为稳定剂的糖，或由它们组 成，和 b. 第二溶液(溶液2 )，其包含二价阳离子盐，或由其组成。3. -种生成均质水凝胶的方法，其包括以下步骤： a. 制备第一均质溶液，其包含FGF-18、藻酸盐、胶原和作为稳定剂的糖，或由它们组成， b. 制备第二溶液，其包含二价阳离子盐，或由其组成， c. 混合这两种溶液然后注射或共同注射这两种溶液以形成水凝胶。4. 如权利要求1或权利要求2所述的均质水凝胶，或如权利要求3所述的方法，其中，所 述稳定剂是鹿糖。5. 如前述权利要求中任一项所述的均质水凝胶或方法，其中，所述二价阳离子盐是钙 盐、镁盐、铜盐或锌盐。6. 如前述权利要求中任一项所述的均质水凝胶或方法，其中，FGF-18选自下组： a. 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸残基28-207或由其组成的多肽， b. 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸残基28-196或由其组成的多肽，和 c. 包含SEQ ID N0:2或由其组成的多肽。7. 如前述权利要求中任一项所述的均质水凝胶或方法，其中，在相应的溶液中，所述藻 酸盐的浓度是3-4重量％，所述胶原的浓度是l-2mcg/mL，所述稳定剂的浓度是10-100mg/ mL，且所述盐的浓度是1 -20mg/mL。8. 如前述权利要求中任一项所述的均质水凝胶或方法，其中，溶液1:溶液2的比例是2: 1(体积比体积）。9. 一种制造制品，其包含两种容器，其中： a. 第一容器包含第一均质溶液或由其组成，其中，所述第一溶液包含FGF-18、藻酸盐、 胶原和作为稳定剂的糖，或由它们组成，和 b. 第二容器包含第二溶液或由其组成，所述第二溶液包含二价阳离子盐或由其组成。10. 如权利要求9所述的制造制品，其中，所述稳定剂是鹿糖。11. 如权利要求9或10中任一项所述的制造制品，其中，所述二价阳离子盐是钙盐、镁 盐、铜盐或锌盐。12. 如权利要求9-11中任一项所述的制造制品，其中，FGF-18选自下组： a. 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸残基28-207或由其组成的多肽， b. 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸残基28-196或由其组成的多肽，和 c. 包含SEQ ID N0:2或由其组成的多肽。13. 如权利要求9-12中任一项所述的制造制品，其中，在相应的溶液中，所述藻酸盐的 浓度是3-4重量％，所述胶原的浓度是l-2mcg/mL，所述稳定剂的浓度是lO-lOOmg/mL，且所 述盐的浓度是1 _20mg/mL。14. 如权利要求9-13中任一项所述的制造制品，其中，溶液1:溶液2的比例是2:1(体积 比体积）。15.如权利要求9-14中任一项所述的制造制品，其中，所述第一容器和所述第二容器是 双室系统的两个隔室或双针头注射装置的两个隔室。
【文档编号】A61L27/52GK106068131SQ201480076244
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2014年12月23日 公开号201480076244.6, CN 106068131 A, CN 106068131A, CN 201480076244, CN-A-106068131, CN106068131 A, CN106068131A, CN201480076244, CN201480076244.6, PCT/2014/79205, PCT/EP/14/079205, PCT/EP/14/79205, PCT/EP/2014/079205, PCT/EP/2014/79205, PCT/EP14/079205, PCT/EP14/79205, PCT/EP14079205, PCT/EP1479205, PCT/EP2014/079205, PCT/EP2014/79205, PCT/EP2014079205, PCT/EP201479205
【发明人】F·卡内尔, C·洛普莱斯蒂
【申请人】阿雷斯贸易股份有限公司