一株反硝化菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物菌剂领域，具体涉及一株反硝化菌及其应用，尤其是在反硝化滤池中的应用。

背景技术：

城市污水处理厂二级中出水常含有一定浓度的氮得不到有效的处理，导致出水在很多场合无法直接使用；因此，城镇污水的深度处理及回用是减轻水体污染负荷、解决水资源短缺的重要战略和必要途径。常见深度处理工艺可分为三大类：混凝沉淀技术、膜处理技术和生物滤池技术。

混凝沉淀技术是利用混凝剂使水中的悬浮颗粒物和胶体物质凝聚形成絮体，然后通过沉淀的方式去除絮体；其缺点为使用铝盐、铁盐等混凝剂，会引入新的外源金属污染物；而使用有机合成高分子絮凝剂，容易在水体内积累，且其单体常含有毒性，使用受限。

膜处理技术使用膜过滤取代传统二沉池的水处理技术。可克服传统活性污泥法的污泥流失和膨胀问题，但存在膜污染问题，且运行成本过高，不适合大规模应用；另外，由于受膜通量限制，遇到水力冲击负荷时调节余量较小；还可能存在反应器内污泥浓度高，膜组件出现损坏等问题。

反硝化生物滤池(简称dnbf)脱氮基本原理是利用反应器内滤料上所附着生物膜的氧化分解作用，滤料及生物膜的吸附截流作用和沿水流方向形成的食物链分级捕食作用，以及生物膜内部微环境和缺氧反硝化作用，共同最终达到水体脱氮的目的。由于具有处理量大、水力停留时间短、占地面积小、启动快等优点，该方法已成为城市污水深度处理领域研究和应用的热点。而现有研究仍侧重于其工艺、参数、滤料等方向改良，未从其根本原理即反硝化生物本身进行强化改良。

总之，混凝沉淀技术存在二次污染等问题，膜处理技术存在成本高、膜污染及损坏等问题。对反硝化生物滤池的强化研究，对水处理及生态保护有非常重要的现实意义，因而受到越来越多的技术关注，成为国内外水处理从业者竞相开发的方向。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株反硝化菌及其应用，尤其是在污水处理中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株反硝化菌，分类命名为乙酰微小杆菌，exiguobacteriumacetylicum，于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14620。

相应的，一株反硝化菌，其16srdna测序序列如seqidno1所示。

相应的，反硝化菌在污水处理中的应用。

优选的，所述应用的温度≥5℃；和/或；所述应用的ph为7～11；和/或；所述应用中，1:1≤c/n≤12:1。

优选的，所述反硝化菌在强化反硝化生物滤池中的应用。

优选的，所述应用包括如下步骤：

(1)配制强化菌液：将所述反硝化菌培养至菌落量≥2×10⁸cfu/l，即得强化菌液；

(2)在所述滤池中加入配水或待处理污水，闷曝1～3d；

(3)排尽闷曝后的配水或污水，再向滤池内加入新的待处理污水至水位达到滤池出水口；停止进污水，将所述强化菌液投入滤池内，静置至少2h，随后充分混匀，再继续向滤池内进待处理污水即可；

所述配水中含活性污泥。

优选的，步骤(1)所述培养的条件为：温度≥5℃；和/或；ph为7～11；和/或；1:1≤c/n≤12:1。

优选的，步骤(1)所述培养的条件为：30℃恒温；和/或；ph＝7；和/或；c/n＝3.6:1。

优选的，步骤(2)所述闷曝时间为2d。

优选的，步骤(3)中，所述强化菌液的添加量为污水日处理量的3％；和/或；夏季连续投加至少7d的强化菌液，冬季连续投加至少15d的强化菌液。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一株适应范围广的反硝化菌：适应ph范围广；有很强的耐碱性，可于极端碱性条件下进行反硝化；适应温度范围广，可于10℃甚至更低的温度下进行反硝化；适应c/n范围广，可以节约应用成本；适应碳源种类多，可利用多种碳源为底物进行反硝化。

2、本发明还提供了一种强化反硝化生物滤池脱氮效果的新思路：从强化脱氮微生物入手，从根本上提高了脱氮效果。本发明还基于该思路提供了一种强化反硝化生物滤池脱氮效果的方法，可极大缩短反硝化生物滤池启动时间，对水中的硝氮降解完全，处理后的水可达到城镇污水处理厂一级a标要求；应用范围广：具有良好的温度耐受性与ph耐受性，对碳源需求低，极大降低了应用成本，具有巨大的推广价值。

附图说明

图1为反硝化菌dn-01的菌落形态图；

图2为反硝化菌dn-01的革兰氏染色图；

图3为反硝化菌dn-01的系统发育树；

图4为不同温度下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中总氮含量对比图；

图5为不同温度下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中硝态氮含量对比图；

图6为不同温度下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中亚硝氮含量对比图；

图7为不同ph下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中总氮含量对比图；

图8为不同ph下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中硝态氮含量对比图；

图9为不同ph下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中亚硝氮含量对比图；

图10为不同碳源下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中总氮含量对比图；

图11为不同碳源下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中硝态氮含量对比图；

图12为不同碳源下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中亚硝氮含量对比图；

图13为不同c/n下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中总氮含量对比图；

图14为不同c/n下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中硝态氮含量对比图；

图15为不同c/n下反硝化菌dn-01脱氮时培养基中亚硝氮含量对比图；

图16为空白组和实验组培养基中总氮含量对比图；

图17为空白组和实验组培养基中硝态氮含量对比图；

图18为空白组和实验组培养基中亚硝氮含量对比图。

具体实施方式

本发明涉及的各试剂和培养基如下：

1、微量元素：edta5g/l、znso40.3g/l、mncl2·4h2o0.5g/l、feso4·7h200.5g/l、cuso4·5h2o0.2g/l、cocl2·6h2o0.3g/l。

2、富集培养基(液体)：ch3coona20.6g/l、nano30.12g/l、kh2po40.12g/l、mgso4·7h2o0.06g/l、cacl20.06g/l、微量元素2ml/l。

3、筛选培养基(初筛/复筛)：ch3coona20.2g、nano30.04g、kh2po40.04g、mgso4·7h2o0.02g、cacl20.02g/l、微量元素2ml/l。

4、纯化培养基：在筛选培养基的基础上加入bt(溴麝香草酚蓝)1ml/l。需要纯化培养基平板(固体)时，再额外加2％的琼脂粉。

加入的bt为先单独配置的浓度1％的bt水溶液。

5、反硝化培养基：ch3coona20.4g/l、nano30.08g/l、kh2po40.08g/l、mgso4·7h2o0.04g/l、cacl20.04g/l、微量元素2ml/l。

一、反硝化菌的筛选

1、反硝化菌的富集。对成都第二污水处理厂污泥、双沙桥下底泥、动物园出水底泥、府南河底泥、锦城公园底泥与摸底河底泥进行采样，使用pbs(10mm)对泥样洗涤3次以上，再用无菌水洗涤若干次。称取清洗后的泥样加入无菌水中(1g泥样对应15ml无菌水)，用旋转匀浆仪充分打碎混匀，获得泥浆混合液。

富集、筛选好氧菌：取20ml混合液到含有玻璃珠的200ml富集培养基(液体)的500ml锥形瓶中，于30℃下，120r/min恒温摇床中振荡5d。

富集、筛选厌氧菌：取20ml混合液到含有玻璃珠的400ml富集培养基(液体)的500ml锥形瓶中，再将锥形瓶放入密封的厌氧袋中，静置，放置于30℃恒温培养箱中进行培养。

在各含富集培养基的容器中分别继续添加培养基至加满，以排尽空气。随后依次将各富集培养基及培养物依次转接到2/3富集培养基、1/3富集培养基，每次转接后分别在30℃下，120r/min恒温摇床中振荡培养5d，获得富集液；以达到梯度富集的目的。其中，所述2/3富集培养基、1/3富集培养基指富集培养基中各组分浓度均为原浓度的2/3或1/3，例如富集培养基中含ch3coona20.6g/l，则1/3富集培养基中含ch3coona20.2g/l。

将富集液进行梯度稀释，即将富集液静置沉降后，取上清液，把上清液分别稀释至10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8。在无菌环境下，用移液器分别吸取0.1ml上述各稀释度的样品，用玻璃棒分别均匀涂布于纯化培养基(固体)上。将平板倒置培养，30℃条件下培养24～72h。

2、反硝化菌的分离纯化。挑取具有不同菌落形态的菌株，分别接种到新的纯化培养基上进行划线，在30℃恒温培养3d。纯化培养基中含bt，在ph＝7时呈绿色，碱性时呈蓝色。反硝化过程中会不断产生oh^-，因此具有反硝化能力的菌落周围的培养基会逐渐发生变色(绿色变为蓝色)。观察各培养基的变化情况，选取发生变色的培养基中的单菌落，重复上述步骤，再划线分离纯化2～3次，将最终得到的各纯化菌落于4℃冰箱中保存。

3、反硝化菌的初筛。将各反硝化菌培养基分装在50ml的三角瓶中，装液量为20ml。将各纯化菌落接种于反硝化培养基中，在30℃、120rpm的恒温摇床中培养3d；再按10％的接种量转接入筛选培养基中，于30℃、120rpm的恒温摇床中培养3d(此步骤中，好氧菌和厌氧菌分开处理，厌氧菌不进行摇床振荡)，测定各菌株脱氮性能。具体考察方法为：取样检测培养基中的硝氮、总氮含量，计算硝氮、总氮降解率。硝态使用紫外分光光度计按hj/t346-2007标准测定；总氮使用紫外分光光度计按hj636—2012标准碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定。

4、反硝化菌的复筛。将初筛中具有反硝化活性的菌株，按10％的接种量接种于新的筛选培养基中，在30℃、120rpm的恒温摇床中培养1d(此步骤中，好氧菌和厌氧菌分开处理，厌氧菌不进行摇床振荡)，再次测定各菌株脱氮活性，选择脱氮活性最高的菌株，命名为：dn-01。

二、反硝化菌的鉴定

1、生理生化特征鉴定。将dn-01接种于富集培养基上，在30℃的恒温培养箱中进行培养，72h后于观察菌落形态，具体如图1所示。革兰氏染色图如图2所示，该菌株为革兰氏阴性，椭球状；厌氧菌。

对该菌继续进行相关生理生化指标鉴定，包括接触酶鉴定、淀粉水解实验、脂肪酶活性鉴定、蛋白酶活性鉴定(酪明培养基与牛奶双层板)、纤维素降解实验、甲基红实验、v-p实验、吲哚实验与no^3-、no^2-降解实验。各检测方法如下：

(1)接触酶活性：无菌环境，挑取dn-01菌落于载玻片上，滴一滴3％过氧化氢溶液，立即观察有无气泡产生。有则为阳性。

(2)淀粉水解实验：配置淀粉活性鉴定培养基(《分子克隆实验指南》中记载的lb培养基基础上，加入1％可溶性淀粉)，加入2％琼脂粉灭菌制备平板。无菌环境，dn-01单菌落划线，平板倒置，厌氧处理后加入恒温培养箱30℃培养3d，形成肉眼可见菌落后，于平板菌落周围滴加碘液，菌落周围有透明圈即为阳性，否则为阴性。

(3)脂肪酶活性：配置脂肪酶活性鉴定培养基(lb培养基基础上加入1％吐温80)，加入2％琼脂粉灭菌制备平板。无菌环境，dn-01单菌落划线，平板倒置，厌氧处理后加入恒温培养箱30℃培养3d，3d后菌落周围有晕圈即为阳性，否则为阴性。

(4)蛋白酶活性：配置酪明蛋白培养基(lb培养基基础上0.3％酪蛋白，酪蛋白需先进行碱化，称取1g酪蛋白加入1ml的1mol/l氢氧化钠，加水后加热溶解，再加入0.5％明胶，加热溶解)，加入2％琼脂粉灭菌制备平板。配置牛奶双层板培养基(上层添加lb培养基，下层加入牛奶)，加入2％琼脂粉，配置平板时，上层板与下层板分别配置后高温高压灭菌，与无菌环境与操作下取平板加入10ml下层培养基，待冷却后加入上层培养基，倒置平板。无菌环境，dn-01单菌落划线，平板倒置，厌氧处理后加入恒温培养箱30℃培养3d，3d后菌落周围有晕圈即为阳性，否则为阴性。

(5)纤维素降解实验：配置纤维素培养基(lb培养基基础上加1％纤维素钠)，加入2％琼脂粉灭菌制备平板。无菌环境，dn-01单菌落划线，平板倒置，厌氧处理后加入恒温培养箱30℃培养，5d后于菌落周边滴0.1％刚果红染色30min，后用无菌水冲洗，再加入1mol/l盐酸复染30min后无菌水冲洗，观察菌落周边是否有透明圈，有即为阳性，否则为阴性。

(6)甲基红实验：配备试验用培养基(0.5％蛋白胨，0.5％磷酸氢二钾)，取dn-01种子液于无菌环境及操作下按10％接种量接种于甲基红培养基中，分别培养2d、6d，随后取8ml菌液于试管中，加入一滴1g/l甲基红试剂，若培养液显红色即甲基红阳性，否则为阴性。

(7)v-p实验：配备试验用培养基，取dn-01种子液于无菌环境及操作下按10％接种量接种于甲基红培养基中，分别培养2d、6d，培养完毕后取8ml菌液于试管中，加入1ml0.3％肌酸溶液(肌酸使用40％氢氧化钠溶解)，若培养液显红色，继续放置1h，仍未变色即v-p实验阳性，否则为阴性。

(8)吲哚实验：配置吲哚培养基(1％蛋白胨，0.5g/l氯化钠，调ph为7.6)，配置吲哚试剂(称取0.5g对二甲基氨基苯甲醛于150ml锥形瓶中，加入47.5ml95％乙醇溶液，加入10ml浓盐酸)。取dn-01种子液于无菌环境及操作下按10％接种量接种到吲哚培养基中，厌氧处理后于30℃恒温培养箱中培养3d，培养完毕后取10ml培养液于试管，加入3ml戊醇，静置20min后沿管壁加入2ml吲哚试剂，若溶液显示红色即吲哚阳性，否则为阴性。

结果如表1所示。

表1生理生化指标鉴定结果

其中，“-”表示呈阴性，“+”表示呈阳性。

2、分子鉴定。采用天根^tm细菌dna提取试剂盒提取纯化后的dn-01菌的总dna，以之为模板，选取16srrna细菌通用引物进行pcr扩增，并进行跑胶纯化及回收，pcr产物交由生工进行测序，得到长度为1466bp的序列，具体序列如seqidno1所示。利用blast将所测得的序列与genbank/embl/ddbj数据库中已登录的序列进行同源性比较，dn-01同源性最近菌株为exiguobacteriumacetylicum，相似性与序列覆盖率均为99％。将上述序列采用mega7计算序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统发育树如图3所示。

至此，发明人筛选、鉴定出一株脱氮活性高的反硝化菌，分类命名为乙酰微小杆菌(exiguobacteriumacetylicum)，于2017年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14620。

三、不同理化因素对反硝化菌dn-01脱氮性能的影响

制备dn-01种子液：将dn-01单菌落于无菌环境及无菌操作下接种于富集培养基中，于30℃恒温培养箱培养3～4d至菌浓度为2×10⁸cfu/l，即得种子液。

探究理化因素影响时，分别将dn-01种子液以10％的接种量接种于反硝化培养基中，每4h取样，观察其24h总氮、硝态氮、亚硝氮变化，每组三个平行。相关指标按照国标使用紫外分光光度计进行测定。

1、不同温度对脱氮能力的影响

设4个处理组，温度分别为10℃、20℃、30℃与40℃，ph为7.0～7.5，乙酸钠为碳源，硝酸钠为氮源，c/n比6:1，使用反硝化培养基，各处理其余条件相同，各组总氮、硝态氮、亚硝氮如图4～6所示。

从图4～6可以看出，不同温度对反硝化菌脱氮影响不同，当温度为30℃、40℃时，完全去除硝氮需8～12h；温度为10℃、20℃时，完全去除硝氮需20h；当温度为30℃、40℃时，其总氮降解较快，且亚硝氮含量于8h时到达峰值，随后开始降解。dn-01于较低温度10℃时表现出一定的脱氮性能。结果表明：dn-01适宜脱氮温度为30℃，具备一定的低温脱氮能力，温度适应范围广。

2、不同ph对脱氮能力的影响

设3个处理，ph分别为3、7和11，温度为30℃，其余条件与上述的温度试验相同。各组总氮、硝态氮、亚硝氮如图7～9所示。

从图7～9可以看出，不同ph对反硝化菌脱氮影响不同，dn-01菌于极端酸性环境时失去脱氮性能，于极端碱性环境(ph＝11)时仍保持较高的脱氮活性，表明dn-01具备碱性环境下脱氮能力，ph适应范围较广。

3、不同碳源对脱氮能力的影响

设4个处理，碳源分别为乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠与葡萄糖，温度为30℃，其余条件与上述的温度试验相同。各组总氮、硝态氮、亚硝氮如图10～12所示。

不同碳源对反硝化菌脱氮影响不同，反硝化菌dn-01以常见底物葡萄糖及空间结构较简单的乙酸钠、丁二酸钠为碳源时，脱氮效果较优，以分子量大、空间结构较复杂的柠檬酸钠为碳源时，脱氮活性下降。

4、不同c/n对脱氮能力的影响

设5个处理，c/n分别为1:1、3:1、6:1、9:1、12:1，温度为30℃，其余条件与上述的温度试验相同。各组总氮、硝态氮、亚硝氮如图13～15所示。

不同c/n对反硝化菌脱氮影响不同。c/n＝1:1时硝氮可降解完全，亚硝氮则因电子供应不足无法完全降解。c/n＝9:1时，具有最佳脱氮活性。c/n＝12:1时，因初始浓度过高，菌无法适应，脱氮表现出现一定的滞后，但仍可完全脱氮。因对电子的特殊需求，普通反硝化菌一般要求c/n为9以上才能展示较佳的脱氮性能，但dn-01在低c/n(如3:1、6:1)时，仍具备较高的脱氮活性，表明该菌对cod需求较低，在脱氮及其它应用中可大幅节约成本。

四、dn-01在强化反硝化生物滤池中的应用。

1、强化菌液的配置：使用反硝化培养基对种子液按10％的接种量进行转接，于30℃下恒温培养箱中培养3d，即得到可外加的强化菌液。

2、反硝化生物滤池强化方法：

(1)滤池顶部设置出水口，在滤池内加入活性污泥与生活污水配水(以下简称配水)，不添加强化菌液，闷曝(只曝气不进污水)2d，以快速初步形成微生物膜。此步骤中，也可以直接使用待处理污水(以下简称污水)代替配水。

其中，所述配水的制作方法为：先对活性污泥及生活污水中的硝氮、亚硝氮、氨氮、cod进行检测，检测后，按一定比例加乙酸钠进行调节，使cod达到400mg/l，硝氮达到80mg/l，cod不足可使用乙酸钠补充。硝态使用紫外分光光度计按hj/t346-2007标准测定；总氮使用紫外分光光度计按hj636—2012标准碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定；亚硝氮使用紫外分光光度计按gb7493-1987标准n-(1-萘基)-乙二胺光度法测定；cod使用lovibondcod测定仪按hj/t399-2007标准快速消解分光光度法测定。

(2)随后进入微生物挂膜阶段。先将滤池中闷曝后的配水全部排出，再向滤池内连续进污水1d左右，进水至水位达到滤池顶部出水口。关闭进水泵，再按日处理水流量的3％体积将dn-01强化菌液投加于反硝化生物滤池中，投加后静置2h，随后充分混匀。随后再往滤池内连续进污水，进行挂膜阶段，hrt＝2.5h(hydraulicretentiontime，污水在滤池的平均停留时间)。夏季连续投加7d的强化菌液，冬季连续投加15d的强化菌液，每次投放时，均暂停进污水；以保证外加高效脱氮菌在生物膜群落中成为优势菌种，达到优异的脱氮效果。

下面结合实施例，对dn-01在强化反硝化生物滤池中的应用效果做进一步展示。

实施例

在冬季(户外温度5～10℃)设置空白组和实验组；c/n比为3.6:1，分别按上述“dn-01在强化反硝化生物滤池中的应用”的方法进行闷曝。

随后进入挂膜阶段。先将滤池中的配水/污水全部排出，再先向滤池内连续进新的污水1d左右，进水至水位达到滤池顶部出水口。关闭进水泵，再按日处理水流量的3％体积将dn-01强化菌液投加于实验组，后静置2h使其充分混匀，再继续进污水；连续投加15d，随后停止投加；空白组在处理时每日相同时间投入等量自来水代替强化菌液。空白组与实验组硝氮、亚硝氮、总氮变化如图16～18所示。

结果表明，空白组于7d时启动稳定，实验组于3d时启动稳定，启动时间提前57.14％。实验组亚硝氮浓度远低于空白组，且亚硝氮无积累。16d后，实验组总氮浓度为0～0.5mg/l，满足城镇污水处理厂一级a标要求，满足地表水ii类需求。

16d前，空白组总氮降解率为33.73％～77.71％；16d前(还在添加强化菌液时)实验组总氮降解率为78.56％～99.99％；实验组相对空白组平均提升26.20％。16d后空白组总氮降解率为70.34％～82.95％，16d后实验组总氮降解率为94.59％～99.99％，实验组相对空白组平均提升19.30％。16d后实验组脱氮效果稳定于95％～99.99％，总氮近乎完全去除，脱氮效率相对于空白组明显提升，反硝化滤池得到显著强化。另外，本实施例的c/n极低，无需外加碳源，可节约经济成本。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株反硝化菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1466

<212>dna

<213>乙酰微小杆菌(exiguobacteriumacetylicum)

<400>1

gcccgtgcgggtgctatacatgcaagtcgagcgcaggaaactgacggaactcttcggagg60

gaaggcagtggaatgagcggcggacgggtgagtaacacgtaaggaacctgcctcaaggat120

tgggataactccgagaaatcggagctaataccggatagttcaacggaccgcatggtccgc180

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