异亮氨酸双加氧酶、突变体及在合成4-羟基异亮氨酸中的应用的制作方法

文档序号：17188723发布日期：2019-03-22 21:44阅读：294来源：国知局

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌，来源于该枯草芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶及其突变体，编码所述异亮氨酸双加氧酶的基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用异亮氨酸双加氧酶合成4-羟基异亮氨酸的方法。

背景技术：

葫芦巴种子是传统的中药材，具有抗糖尿病、降胆固醇、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、治疗脂肪肝和慢性肾衰竭等药理作用。4-羟基异亮氨酸是存在于葫芦巴属植物种子中的一种非蛋白氨基酸，其含量约占葫芦巴种子中游离氨基酸的80％。研究表明，4-羟基异亮氨酸具有刺激β-胰岛细胞分泌胰岛素的作用，可以降低血糖浓度，提高血糖耐受性，缓解糖尿病患者对体外胰岛素的依赖，可用于治疗ii型糖尿病，因此成为人们关注的热点。

4-羟基异亮氨酸的传统制备工艺主要是从葫芦巴种子中提取和分离，不仅步骤繁琐，而且产物收率很低(<1％)(phytochemistry1973,12:1707-1711)。近年来，人们开始关注4-羟基异亮氨酸的合成。比如，wang等通过八步合成法(一步生物转化法和七步化学转化法)由2-甲基乙酰乙酸乙酯合成4-羟基异亮氨酸，总收率仅为39％(eur.j.org.chem.,2002,5:834-839)。紧接着，rolland-fulcrand等开发了另一条化学酶法合成路线，以溴乙酸叔丁酯为原料经过六步反应合成4-羟基异亮氨酸(eur.j.org.chem.,2004,4:873-877)。2007年，shimizu等通过两步酶法合成4-羟基异亮氨酸，首先利用醛缩酶催化乙醛和2-羰基丁酸缩合生成4-羟基-3-甲基-2-羰基戊酸，接着利用支链氨基转移酶将l-谷氨酸的氨基转移至4-羟基-3-甲基-2-羰基戊酸，最终生成4-羟基异亮氨酸，收率仅有12％(以2-羰基丁酸计算)，而且产物的光学纯度也不高(femsmicrobiol.lett.,2007,273:70-77)。为了提高酶促合成4-羟基异亮氨酸的效率，shimizu等将苏云金芽孢杆菌中的异亮氨酸双加氧酶克隆在大肠杆菌中进行异源表达，该重组异亮氨酸双加氧酶可以在50mmα-酮戊二酸作为辅底物的条件下催化15mm异亮氨酸羟化反应生成13mm4-羟基异亮氨酸，产物分析得率为86.7％(appl.microbiol.biotechnol.,2011,89:1929-1938)。虽然目前利用异亮氨酸双加氧酶合成4-羟基异亮氨酸的方法，具有反应条件温和、工艺简单等优点，但是目前该方法仅限于实验室规模，存在酶活性低、底物浓度低(仅为15mm)等缺点，不适合工业化生产。因此，需要筛选活性高、能够耐受高浓度底物/产物的酶，以满足工业化生产4-羟基异亮氨酸的需求。

技术实现要素：

针对目前酶法合成4-羟基异亮氨酸的工艺中存在的酶活性低、底物耐受性差、产物得率低等缺陷，本发明提供一种催化活性高、底物耐受性好的异亮氨酸双加氧酶及其突变体、表达所述异亮氨酸双加氧酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体、所述异亮氨酸双加氧酶的制备方法和所述异亮氨酸双加氧酶在制备4-羟基异亮氨酸中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一是：

提供一种枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，已于2018年10月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmccno.16599，菌株编号为ecu1018。所述枯草芽孢杆菌cgmccno.16599筛选自上海佘山国家森林公园的土壤样本。

从上海、江苏、江西、安徽等不同省市、地域广泛采集土壤样本，检测土壤样本中各个菌株催化异亮氨酸羟化反应的产物浓度，发现来自于佘山国家森林公园土壤样本的1株菌表现出很好的底物耐受性和高的产物得率，该菌株编号为ecu1018，对该菌株进行种属鉴定，为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。

所述枯草芽孢杆菌cgmccno.16599具有如下特征：

所述枯草芽孢杆菌菌落为革兰氏阳性菌。单个菌体(0.7-0.8)μm×(2.0-3.0)μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大小为(0.6-0.9)μm×(1.0-1.5)μm，椭圆至柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时常形成皱醭。需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

所述枯草芽孢杆菌表达如序列表seqidno.2所示氨基酸序列组成的异亮氨酸双加氧酶。

本发明的技术方案之二是：

提供一种异亮氨酸双加氧酶，所述异亮氨酸双加氧酶是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)如seqidno.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在如seqidno.2所示氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异亮氨酸双加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

进一步，(b)所述蛋白质为：由seqidno.2所示氨基酸序列在第34位、第58位、第113位、第165位、第209位单独替换一个氨基酸或同时在第58位和第165位替换两个氨基酸后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质。

优选地，(b)所述蛋白质为：

(1)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第34位苯丙氨酸残基替换为缬氨酸残基而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第58位亮氨酸残基替换为丙氨酸残基而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质；

(3)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第113位组氨酸残基替换为天冬酰胺残基而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质；

(4)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第165位天冬酰胺残基替换为组氨酸残基而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质；

(5)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第209位苏氨酸残基替换为丝氨酸残基而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质；

(6)将如序列表中seqidno.2所示氨基酸序列的第58位亮氨酸残基替换为丙氨酸残基，同时将第165位天冬酰胺残基替换为组氨酸残基而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明所述异亮氨酸双加氧酶是从所述枯草芽孢杆菌cgmccno.16599中获得。采用鸟枪法对所述枯草芽孢杆菌cgmccno.16599的异亮氨酸双加氧酶进行了克隆，获得一个具有较高活性和底物耐受性的重组异亮氨酸双加氧酶，命名为bsido，其氨基酸序列如表中seqidno.2所示。

在筛选获得高活性和底物耐受性的异亮氨酸双加氧酶bsido的基础上，通过反复试验和探索，发现在如seqidno.2所示氨基酸序列的基础上对第34位的苯丙氨酸残基、第58位的亮氨酸残基、第113位的组氨酸残基、第165位的天冬酰胺残基、第209位的苏氨酸残基进行单点替换或同时对第58位的亮氨酸残基和165位的天冬酰胺残基进行双点替换后，仍具有异亮氨酸双加氧酶的活性，在此基础上获得了酶活性显著提高的突变体。

本发明所述异亮氨酸双加氧酶的获得方法为本领域常规方法，较佳地为从重组表达所述异亮氨酸双加氧酶的转化体中分离获得；或者人工合成获得。

本发明所述异亮氨酸双加氧酶的活力测定通过4-羟基异亮氨酸脱氢酶偶联的方法在酶标仪上进行，异亮氨酸在异亮氨酸双加氧酶的催化下羟化产生的4-羟基异亮氨酸可以被4-羟基异亮氨酸脱氢酶氧化脱氢同时生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)，引起340nm波长下吸光度的增加(ε＝6220m^–1cm^–1)。由于4-羟基异亮氨酸脱氢酶相对于异亮氨酸双加氧酶是过量的，从而认为吸光度增加的速率和4-羟基异亮氨酸生成的速率是一致的。该偶联反应的体系为：磷酸钾缓冲液(100mm，ph7.0)、10mm异亮氨酸、20u/ml4-羟基异亮氨酸脱氢酶、2mmnad⁺以及适量的异亮氨酸双加氧酶，反应在30℃下进行。连续监测5min内吸光度的变化，从而确定初始反应速率。一个异亮氨酸双加氧酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol异亮氨酸羟化生成4-羟基异亮氨酸所需的酶量。

所述异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸的液相色谱分析条件：异亮氨酸和4-羟基异亮氨酸先利用2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-葡萄糖基异硫氰酸酯(gitc)进行衍生化后再进行液相色谱分析，液相分析条件为ods-c18column(5μm,φ4.6×200mm)，流动相：甲醇:水:三氟乙酸＝55:45:0.1(v/v/v)，流速：0.8ml/min，检测波长：254nm，柱温：30℃，出峰时间：产物6min，底物10min，gitc12.5min。

本发明的技术方案之三是：

提供一种编码如技术方案二所述异亮氨酸双加氧酶的核酸，具体的，其为如下序列的核酸：

(1)如seqidno.1所示的核酸；或

(2)编码如技术方案二所述异亮氨酸双加氧酶的核酸。

较佳的，可以依据密码子的简并性，对所述核酸序列进行优化，使其在宿主细胞中更有效地表达如技术方案二所述的异亮氨酸双加氧酶。

本发明所述异亮氨酸双加氧酶的编码核酸的获得方法为本领域常规；较佳地，为从所述枯草芽孢杆菌cgmccno.16599中分离获得；或从重组表达所述异亮氨酸双加氧酶的重组表达转化体的质粒中扩增获得；或人工合成获得。

本发明的技术方案之四是：

提供一种包含所述异亮氨酸双加氧酶核酸序列的重组表达载体。

本发明所述重组表达载体可以通过本领域常规方法将所述异亮氨酸双加氧酶核酸连接于各种表达载体上构建而成，所述表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒，更优选质粒pet28a。所述异亮氨酸双加氧酶核酸可以操作性地连接于所选载体中适合表达的调控序列的下游，以实现所述异亮氨酸双加氧酶的组成型或诱导型表达。

较佳地，可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过pcr所得的异亮氨酸双加氧酶基因的扩增产物和所述表达载体pet28a用限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切，形成互补的粘性末端，再经连接酶连接，形成含有所述异亮氨酸双加氧酶核酸序列的重组表达载体。

本发明的技术方案之五是：

提供一种包含所述异亮氨酸双加氧酶基因或重组表达载体的重组表达转化体。

本发明所述重组表达转化体可通过本领域常规方法将所述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足所述重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的异亮氨酸双加氧酶基因可被有效表达即可。所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(escherichiacoli,简写为e.coli)，更佳地为大肠杆菌e.colidh5α或e.colibl21(de3)。

本发明的技术方案之六是：

提供一种所述异亮氨酸双加氧酶的制备方法。

本发明所述异亮氨酸双加氧酶通过对所述转化体进行培养后分离得到。所述培养的方法和条件为本领域常规的方法和条件，可以根据宿主类型和培养方法等因素进行适当的选择，只要所述重组表达转化体能够生长并产生所述异亮氨酸双加氧酶即可。所述培养所用的培养基为本领域任何可使所述转化体生长并产生所述异亮氨酸双加氧酶的培养基，较佳地为lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0。较佳地，所述培养方法为：将所述重组表达转化体接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，30～40℃、150～200rpm振荡培养，当培养液的光密度od600达到0.6～1.2时，加入终浓度为0.05～0.5mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，并于16～30℃诱导8～24小时，离心、收集获得静息细胞；更佳的，将所述重组表达转化体接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃、180rpm振荡培养，当培养液的光密度od600达到1.0时，加入终浓度为0.5mm的iptg，在16℃诱导24小时，离心、收集获得静息细胞。

本发明的技术方案之七是：

提供一种4-羟基异亮氨酸的制备方法，包括以下步骤，在水溶液中，在辅底物氧气和α-酮戊二酸，辅因子fe²⁺和抗坏血酸存在的条件下，利用如上所述异亮氨酸双加氧酶或表达异亮氨酸双加氧酶的重组细胞对如下反应式中如化学式i所示的化合物异亮氨酸进行羟化反应，制得如化学式ii所示的化合物4-羟基异亮氨酸。

本发明所述反应体系的ph为5.0～8.0，所述底物浓度为10～50g/l，所述反应温度为20～50℃，所述异亮氨酸双加氧酶用量为3600～18000u/l；所述的反应进程可以采用本领域中常规的检测方法，如液相色谱hplc或薄板层析tlc进行监测，反应时间为4～24小时，或以底物浓度不再减少或产物浓度不再增加的时间为准。

较佳地，所述羟化反应结束后还包括对所述4-羟基异亮氨酸进行分离提取的步骤，所述的分离提取步骤为本领域常规的分离提取步骤。较佳的，先利用强酸将反应体系的ph调节至3～5，使用絮凝剂对反应体系中的菌体和蛋白进行絮凝，过滤后获得澄清的滤液，将滤液上样至强酸性阳离子树脂，然后利用氨水进行洗脱，将含有4-羟基异亮氨酸的洗脱液蒸发除去溶剂即可获得目标产物。所述强酸为本领域常规强酸，如硫酸、盐酸或磷酸等，优选盐酸；絮凝剂为本领域常规絮凝剂，如聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺等，优选聚丙烯酸钠；所述强酸性阳离子树脂为本领域常规强酸性阳离子树脂，如732、hz016、jk006、d001或hd-8等，优选d001。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：

所述异亮氨酸双加氧酶及其突变体具有高效催化异亮氨酸羟化，制备4-羟基异亮氨酸的性能。当异亮氨酸底物浓度为30g/l(228mm)时，转化24小时后，转化率高达95％。相对于其它现有的制备方法，本发明所述制备方法具有反应条件温和，操作简便，底物浓度和产物收率高等显著优势，具有很好的工业化生产应用前景。

生物材料保藏信息

本发明所述的枯草芽孢杆菌ecu1018，已于2018年10月18日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：cgmccno.16599，培养物名称是ecu1018，分类命名是枯草芽孢杆菌bacillussubtilis。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

枯草芽孢杆菌cgmccno.16599的筛选

所述枯草芽孢杆菌cgmccno.16599来源于上海佘山国家森林公园采集的土壤样本，并命名为ecu1018。其筛选、分离包括以下步骤：对采集自上海、江苏、江西、安徽等不同省市、地域的100多份土样进行微生物筛选，将适量土样加入生理盐水中，充分振摇，获得含菌悬浮液，将含菌悬浮液稀释后分别涂布于lb培养基平板，分离单菌落。分离的单菌落分别接种到lb培养基中，30℃振荡培养24小时，将培养液离心，收集静息细胞，加入到含有200mm异亮氨酸、200mmα-酮戊二酸、0.5mmfeso4·7h2o以及10mm抗坏血酸的磷酸钾缓冲液(100mm，ph7.0)中，振荡反应，检测产物的浓度，对这些菌株催化异亮氨酸羟化生成4-羟基异亮氨酸的活性进行评价。其中1个菌株表现出较好的反应效果，对该菌株进行鉴定，为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，命名为ecu1018。该菌株已于2018年10月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，并收到保藏登记号cgmccno.16599。

实施例2

异亮氨酸双加氧酶bsido的克隆

利用ctab法提取菌株枯草芽孢杆菌cgmccno.16599的基因组dna：将菌株枯草芽孢杆菌cgmccno.16599的静息细胞加入液氮冷冻，研磨成粉，加入2×ctab提取缓冲液(100mmtris-hcl,ph8.0,20mmedta,1.4mnacl,20g/l十六烷基三甲基溴化铵(ctab),40mm巯基乙醇)，65℃保温10分钟，间歇摇动。随后加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，12000rpm离心10min，将上清液转移到另一离心管中，再加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，12,000rpm离心10min。将上层水相转移到新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，室温放置30min，4,000rpm离心10min，除去上清液，沉淀用70％(v/v)乙醇漂洗，自然晾干后加入20μl的te缓冲液(100mmtris-hcl,10mmedta,ph8.0)溶解基因组dna，并于-20℃保存备用。

采用限制性内切酶sau3ai对提取的基因组dna进行部分酶切，酶切后的dna片段通过电泳进行纯化，采用胶回收纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)回收2～4kb的片段。将回收的dna片段与预先经过bamhi酶切的质粒puc18在t4dna连接酶(宝生物工程有限公司)的作用下，于4℃冰箱中连接16小时，将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基上，37℃培养箱倒置培养过夜。挑取单克隆接种至300μl含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基深孔板中，37℃振荡培养过夜获得种子液。取50μl种子液接种至600μl含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基二级深孔板中，37℃振荡培养4小时后加入终浓度为0.5mm的异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)并将培养液转移至16℃摇床中诱导24小时。取100μl菌液加到300μl含有200mm异亮氨酸、200mmα-酮戊二酸、0.5mmfeso4·7h2o以及10mm抗坏血酸的磷酸钾缓冲液(100mm，ph7.0)中，37℃振荡反应16小时，利用4-羟基异亮氨酸脱氢酶偶联产物检测的方法，在反应液中加入2u/ml的4-羟基异亮氨酸脱氢酶以及2mmnad⁺，读取340nm波长下吸光度的增长，检测羟化反应产物4-羟基异亮氨酸的生成。将有明显产物生成的阳性克隆子送至上海赛音生物技术有限公司进行测序，获得如seqidno.1所示的核苷酸序列，根据该核苷酸序列所推测的氨基酸序列如seqidno.2所示，将该氨基酸序列编码的异亮氨酸双加氧酶命名为bsido。

所述异亮氨酸羟化酶与文献报道的苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)来源的异亮氨酸羟化酶(uniprot登录号：e2gin1)的同源性仅为77.4％。因此，所述异亮氨酸双加氧酶bsido是全新的。

实施例3

重组质粒和重组表达转化体的构建以及重组酶的制备

以正向引物5’-ggatccatgctgaccaccgtgagcaac-3’(如seqidno.3所示)，反向引物5’-aagcttttatttcggctccttgtagc-3’(如seqidno.4所示)，利用dna聚合酶链式反应技术对实施例2中获得的异亮氨酸双加氧酶bsido的核酸序列进行扩增，将获得的含有异亮氨酸双加氧酶核酸序列的dna片段分别用限制性内切酶bamhi和hindiii进行双酶切，随后与同样经过限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切的质粒pet28a进行连接，获得重组质粒pet28a-bsido。

将获得的质粒pet28a-bsido转化到大肠杆菌e.colibl21中，获得重组大肠杆菌，并将构建的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃振荡培养过夜，以1％(v/v)的接种量转接至装有400mllb培养基的2l三角瓶中，并于37℃、180rpm摇床中振荡培养，当培养液的od600达到1.0时，加入终浓度为0.5mm的iptg作为诱导剂，16℃诱导24小时后，将培养液离心(8000rpm,10min)，并用生理盐水洗涤两次，获得静息细胞，测得静息细胞的活力为360u/g湿细胞。

实施例4～7

不同ph对重组异亮氨酸双加氧酶bsido催化异亮氨酸反应的影响

称取4g如实施例3获得的重组静息细胞加入到100ml含有3g异亮氨酸、3.33gα-酮戊二酸、0.352g抗坏血酸、14mg七水合硫酸亚铁的底物溶液中，底物溶液预先用氢氧化钠溶液调节ph至5–8，在37℃、180rpm摇床中振摇反应24h。反应样品加入等体积的乙腈终止反应，反应底物和产物经2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-葡糖基异硫氰酸酯(gitc)衍生化后，利用液相色谱分析产物得率。反应最终结果列于表1，数据说明，酶促异亮氨酸羟化反应的最适宜ph为6.0。

表1ph对重组异亮氨酸双加氧酶bsido催化反应转化率的影响

实施例8～11

温度对重组异亮氨酸双加氧酶bsido催化制备4-羟基异亮氨酸的影响

称取4g如实施例3获得的重组静息细胞加入到100ml含有3g异亮氨酸、3.33gα-酮戊二酸、0.352g抗坏血酸、14mg七水合硫酸亚铁，ph6.0的底物溶液中，在20–50℃、180rpm摇床中振摇反应24h。反应样品加入等体积的乙腈终止反应，反应底物和产物经gitc衍生化后，利用液相色谱分析产物得率。反应最终结果列于表2，数据说明，酶促异亮氨酸羟化反应制备4-羟基异亮氨酸的最适宜反应温度为40℃。

表2温度对重组异亮氨酸双加氧酶催化异亮氨酸羟化反应的影响

实施例12～16

不同上载量的重组异亮氨酸双加氧酶bsido对异亮氨酸羟化反应的影响

分别称取1–5g如实施例3获得的重组静息细胞加入到100ml含有3g异亮氨酸、3.33gα-酮戊二酸、0.352g抗坏血酸、14mg七水合硫酸亚铁，ph6.0的底物溶液中，在40℃、180rpm摇床中振摇反应24h。反应样品加入等体积的乙腈终止反应，反应底物和产物经gitc衍生化后，利用液相色谱分析产物得率。反应最终结果列于表3，数据说明，酶促异亮氨酸羟化反应最适宜的细胞上载量为30g/l。

表3催化剂上载量对异亮氨酸双加氧酶催化异亮氨酸羟化反应的影响

实施例17～21

底物浓度对重组异亮氨酸双加氧酶bsido催化反应的影响

称取3g如实施例3获得的重组静息细胞加入到100ml分别含有1–5g异亮氨酸、1.11–5.55gα-酮戊二酸、0.352g抗坏血酸、14mg七水合硫酸亚铁，ph6.0的底物溶液中，在40℃、180rpm摇床中振摇反应24h。反应样品加入等体积的乙腈终止反应，反应底物和产物经gitc衍生化后，利用液相色谱分析产物得率，反应最终结果列于表4，数据说明，当异亮氨酸的浓度在40g/l以下时转化率均能超过90％，继续提高异亮氨酸的浓度，转化率略有下降。

表4不同底物上载量对重组异亮氨酸双加氧酶催化反应的影响

实施例22

异亮氨酸双加氧酶bsidof34v的获得

采用quikchangeiisite-directedmutagenesiskit所述方案进行操作。设计含有突变位点的引物5’-atcgcgaacgatattgttctgcaggaccaagaa-3’(如seqidno.5所示)和5’-ttcttggtcctgcagaacaatatcgttcgcgat-3’(如seqidno.6所示)。

pcr反应体系(50μl)：模板dna10ng，5μl10×kodplusbuffer，5μldntp(各2mm)，2μlmgso4(25mm)，突变引物各1μl(10mm),1ukod酶(toyoboco.,ltd.,osaka,japan)，加灭菌双蒸水至50μl。其中模板为实施例3获得的质粒pet28a-bsido。