一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及到针对恶性肿瘤表面nectin-4双靶点的第四代嵌合抗原受体t(car-t)细胞(表达il-7和ccl19)的构建与应用。

背景技术：

随着全球环境因素的不断恶化，无论发达国家或发展中国家，恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势，恶性肿瘤已成为人类生命健康的最大危害。中国2015年约有430万人确诊癌症，280万人因癌症去世，其中大多数为实体瘤(如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌等)，预计到2020年，中国每年将有550万新发癌症病例，其中死亡人数将达400万。由于传统治疗方法的固有缺陷以及全球生物高新技术的火热发展，人们对新疗法的出现期待已久。而生物治疗作为刚崭露头角的全新治疗理念，由于其所具有的特有优点，必将为癌症患者所广泛接受。

car-t疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案。其通过体外基因转移技术，将编码嵌合抗原受体(car)的基因序列转导入t细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性t细胞。近几年，car-t疗法在治疗恶性血液肿瘤中取得的成果是有目共睹的(如针对难治性/复发性急性b淋巴母细胞白血病的kymriah和针对难治性/复发性非何杰金氏淋巴瘤的yescarta去年已在美国上市)，但至少50％以上的会复发率，且car-t细胞治疗实体瘤效果不佳，主要原因是存在缺乏合适的靶抗原、car-t细胞在体内持续时间短、免疫逃逸、免疫抑制肿瘤微环境等颇具挑战的问题。因此，目标抗原的选择对于car的特异性、有效性以及基因改造的t细胞自身安全性来讲都至关重要。

nectin-4是属于nectin蛋白家族的i型跨膜蛋白，其胞外区由三个ig样结构域(v-c-c型)组成，与钙粘蛋白共同参与了粘附连接的形成和维持。nectin-4在人胚胎细胞普遍表达，但在成人正常组织中却几乎不表达。nectin-4在非小细胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌细胞表面呈高表达，且在这些上皮源性恶性肿瘤的发生、浸润及转移过程中发挥关键性作用，可成为治疗癌症的可靠靶点。靶向nectin-4的抗体偶联药物enuteumabvedotin因在81例晚期膀胱癌的i期临床试验中疗效出色(例如，铂类化疗耐药的患者中客观反应率41％，其中19例肝转移患者中的有效率为47％；甚至在32例pd-1/pd-l1抑制剂治疗无效的患者中有效率达44％)，从而在2018年3月获得了fda突破性疗法认定，目前正在临床研究中用于治疗患有实体瘤的患者。

本发明中的第四代car-t细胞在cd3ζ传导的第一信号和4-1bb共刺激分子传导的第二信号的基础上，选择il-7和ccl-19细胞因子作为第三信号。细胞因子在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导t、b细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中发挥重要作用。其中，il-7在促进t细胞增殖同时可以维持t细胞稳定，ccl-19可以募集外周t细胞及dc(树突状细胞)进入淋巴组织，进而解决car-t细胞在体内持续时间短、免疫抑制肿瘤微环境等颇具挑战的问题。

技术实现要素：

本发明主要是基于car-t细胞治疗恶性实体瘤时存在缺乏合适的靶抗原、car-t细胞在体内持续时间短、抗原逃逸等颇具挑战的难题而提供的一种针对恶性肿瘤表面nectin-4抗原两个表位的第四代嵌合抗原受体t(car-t)细胞(表达il-7和ccl19)的构建及应用。

通过基因工程技术构建plenti-nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19质粒载体，然后利用高滴度，高纯度的慢病毒规模化生产工艺包装出慢病毒载体以转染t细胞，培养五天后通过流式分别检测两种car的表达率，并通过不同方法检测car-t细胞对nectin4阳性细胞的体外杀伤作用。

本发明采用以下技术方案：

一种第四代car-t细胞，所述car-t细胞的car包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合x靶标抗原的anti-xscfv1和anti-xscfv2，x为nectin4；所述胞内信号传导区为cd8α-41bb-cd3ζ；所述细胞因子信号区为y和z，y为il7，z为ccl19。

进一步地，利用x靶标抗原在恶性肿瘤细胞中表达，但在正常细胞中不表达，构建的双靶点car-t细胞只识别表达x靶标抗原的肿瘤细胞，而不识别正常细胞。

进一步地，所述t细胞中car结合的抗原表位位于靶标抗原x的lgv样结构域。

根据本发明的又一发明目的，提供了一种第四代car-t细胞细胞的构建方法，包括如下步骤：

步骤1、构建表达xcar1&car2-y-z慢病毒载体；

步骤2、慢病毒包装：得到表达xcar1&car2-y-z慢病毒；

步骤3、慢病毒感染t细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增t细胞，利用步骤2得到的表达xcar1&car2-y-z慢病毒感染t细胞，得到表达xcar1&car2-y-z的t细胞,即x双靶点的第四代car-t细胞。

进一步地，所述构建car表达载体的过程中，包括步骤如下：

步骤1、构建表达nectin4car1&car2-il7-ccl19慢病毒载体：将nectin4car1和nectin4car2基因序列分别克隆到plenti载体ecori和mlui位点之间，所获得的载体命名为plenti-nectin4car1和plenti-nectin4car2；将plenti-nectin4car2基因序列通过ndei位点酶切，将il7-ccl19融合基因克隆到plenti-nectin4car2序列下游ndei和mlui位点之间，所获得的载体命名为plenti-nectin4car1&car2-il7-ccl19；

步骤2、慢病毒包装：293t细胞培养于含10％fbs和1％青链双抗的dmem培养基，细胞贴壁后密度达到70％，细胞换成含10％fbs的opti-mem培养基；质粒按plenti-nectin4car1&car2-il7-ccl19：plp1：plp2：pmd2g＝18：9：4：3比例混合后加到pbs中混匀，pei加到等量pbs中混匀，静置5分钟后，将两者混合后静置20分钟，均匀加到293t细胞中；细胞恒温培养箱培养48小时后，收集上清，1500rpm室温离心10min，弃细胞沉淀，上清过0.45um滤膜，即为表达nectin4car1&car2-il7-ccl19的慢病毒，-80℃保存备用；

步骤3、慢病毒感染t细胞：分离人外周血单核细胞，培养和扩增t细胞，利用步骤2得到的表达nectin4car1&car2-il7-ccl19慢病毒感染t细胞，得到表达nectin4car1&car2-il7-ccl19的t细胞。

根据本发明的另一发明目的，上述的第四代car-t细胞在治疗表达nectin4靶标抗原的恶性肿瘤中的应用。

由上述技术方案可以看出，本发明具有以下有益效果：

一.本发明涉及到的car-t细胞针对的靶点是恶性肿瘤细胞表面的nectin-4抗原，而目前针对该靶点的疗法只有作为抗体偶联药物enuteumabvedotin获得了fda疗法认定。

二.本发明以nectin-4的两个抗原表位为靶点，减少了靶向“压力”治疗下形成免疫逃逸而引起恶性肿瘤复发。

三.本发明中的第四代car-t是将il-7以及ccl-19基因转入car-t细胞，其中ccl-19可以募集外周t细胞及dc(树突状细胞)进入淋巴组织，而il-7在促进t细胞增殖同时可以维持t细胞稳定。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细说明。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是通过免疫组化检测人源性恶性肿瘤组织中nectin4的表达情况。

图2是通过流式细胞术检测人源性恶性肿瘤细胞表面nectin4抗原的表达情况。

其中，ht1376(人膀胱癌细胞株)，panc/1(人胰腺癌细胞株)，hcclm3(人肝癌细胞株)，mb453、mb231、mcf7(人乳腺癌细胞株)。

图3是三种car的示意图。

其中，a.plenti-nectin4car1-il7-ccl19重组质粒b.plenti-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒c.plenti-nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒。

图4是利用第三代慢病毒包装体系制备car病毒颗粒(滴度为5x10e8tu/ml)，以moi＝40感染人原代t细胞，流式细胞术检测nectin4car在t细胞膜上的表达情况。

图5是通过rtca(实时无细胞标记分析技术)体外验证e:t＝20：1条件下第四代car-t细胞对nectin4阳性的人膀胱癌细胞ht1376的杀伤作用，以未转导病毒的t细胞和cd19car-t为对照,比较nectin4car1-il7-ccl19、nectin4car2-il7-ccl19、nectin4car1&car2-il7-ccl19三种第四代car-t的体外杀伤效果。

图6是通过荧光素酶法体外验证不同效靶比条件下nectin4car1-il7-ccl19、nectin4car2-il7-ccl19、nectin4car1&car2-il7-ccl19这三种第四代car-t细胞对nectin4阳性并通过慢病毒转染使其表达荧光素酶的人膀胱癌细胞ht1376的杀伤作用。

图7是构建plenti-nectin4car1和plenti-nectin4car2重组质粒的相关电泳图。

其中，a.puc57-nectin4car1-amp和puc57-nectin4car2-amp重组质粒经ecori-hf和mlui-hf限制性内切酶双酶切分别得目的条带1458bp、1464bp.b.plentivector经ecori-hf和mlui-hf限制性内切酶双酶切得目的条带7302bp.c.plenti-nectin4car1重组质粒经aflii-hf酶切得目的条带2033bp、3071bp、3656bp，plenti-nectin4car2重组质粒经aflii-hf酶切得目的条带2033bp、3077bp、3656bp。

图8是构建plenti-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒的相关电泳图。

其中，a.左图为pcr扩增p2a-il7-t2a-ccl19片段得目的条带1010bp，右图为plenti-nectin4car2重组质粒经ndei和mlui-hf限制性内切酶双酶切得目的条带8740bp.b.plenti-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒经smai和mlui-hf双酶切得目的条带2422bp、7298bp。

图9是构建plenti-nectin4car1-il7-ccl19重组质粒的相关电泳图。

其中，a.左图为pcr扩增p2a-il7-t2a-ccl19片段得目的条带973bp，右图为pcr扩增p2a-nectin4car1片段得目的条带1488bp.b.重叠pcr扩增nectin4car1-il7-ccl19片段得2442bp.c.plenti-nectin4car1-il7-ccl19重组质粒经aflii-hf酶切得目的条带2033bp、3656bp、4025bp。

图10是构建plenti-nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒的相关电泳图。

其中，a.左图为pcr扩增nectin4car1-p2a片段得目的条带1513bp，右图为pcr扩增p2a-nectin4car2-il7-ccl19片段得目的条带2461bp.b.重叠pcr扩增nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19片段得3957bp.c.plenti-nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒经ecori-hf酶切得目的条带3222bp、8007bp。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

主要实验材料：

ecori-hf、mlui-hf、ndei限制性内切酶(neb公司)，无缝克隆酶(和元生物)，高保真primegxlstar酶(takara公司)，transstbl3感受态细胞(全式金生物科技有限公司)，plasmidminikiti(omega)，plasmidmaxikit(qiagen)，dmem、rpmi-1640、opti-mem培养基、gibcofbs(thermofisherscientific)，sanger测序(上海桑尼生物有限公司)，nacl、酵母粉、蛋白胨、edta、naoh(上海生工生物工程股份有限公司)，引物(江苏金唯智生物科技有限公司)。

一、构建重组质粒

(1)构建plenti-nectin4car1和plenti-nectin4car2重组质粒：

nectin4car1(hcd8leader-vl1-linker-vh1-cd8hinge-cd8tm-41bb-cd3ζ)(seqidno.8)和nectin4car2(hcd8leader-vl2-linker-vh2-cd8hinge-cd8tm-41bb-cd3ζ)(seqidno.9)核苷酸序列经合成优化后已添加5'utr(ecori)和3'utr(mlui)，故使用ecori-hf和mlui-hf限制性内切酶双酶切以上两个合成优化的重组质粒puc57-amp和载体plentivector，反应条件为37℃3h，65℃20min，酶切体系如表7。酶切产物经过1％琼脂糖凝胶电泳获得载体片段，见图7(a)和图7(b)，然后用xygene胶回收试剂盒回收nectin4car1、nectin4car2目的片段和plenti载体片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。载体片段和目的片段通过t4克隆，16℃16-24h，65℃10min，然后进行质粒转化(t4克隆产物在冰上放置5min后，将其转入50ultransstbl3感受态中，冰上放置30min，42℃45s，再冰上5min，加入500ullb，在37℃，225rpm/min摇床中活化1h，然后5000rpm/min20℃离心5min，弃去上清，将剩余菌液混匀后涂板，37℃培养12-14小时)。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用aflii-hf限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表7，使用1％琼脂糖凝胶观察目的片段如图7(c)，最后进行sanger测序。

(2)构建plenti-nectin4car1-il7-ccl19和plenti-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒：

使用引物cd3ζ-p2af、ccl19r扩增出人工合成片段p2a-il7-t2a-ccl19(seqidno.10)，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃1min)*35循环，扩增体系见表3。使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图8(a.左图)，获目的条带1010bp，然后用xygene胶回收试剂盒回收p2a-il7-t2a-ccl19片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。plenti-nectin4car2重组质粒经ndei和mlui-hf限制性内切酶双酶切后，使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图8(a.右图)，获目的条带8740bp，然后用xygene胶回收试剂盒回收目的片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。p2a-il7-t2a-ccl19胶回收片段和plenti-nectin4car2胶回收片段通过无缝克隆连接，然后进行质粒转化，挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用aflii-hf限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表7。使用1％琼脂糖凝胶电泳观察目的片段如图8(b)，最后进行sanger测序。故构建出plenti-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒。

使用引物car1f、p2a-cd3ζr扩增出nectin4car1-p2a片段，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃1.5min)*35循环；使用引物il7f、ccl19r扩增出p2a-il7-t2a-ccl19片段，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃1min)*35循环，扩增体系见表3。使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图9(a.左图)和图9(a.右图)，分别获目的条带1.5kb、1kb，然后用xygene胶回收试剂盒回收(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。取两胶回收产物各1μl为模板，用car1f和ccl19r为引物，扩增目的片段nectin4car1-il7-ccl19，扩增体系如表4所示，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃2.5min)*35cycle，使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段如图9(b)，目的条带大小为2442bp。nectin4car1-il7-ccl19胶回收片段和①中plenti载体胶回收片段通过无缝克隆连接，然后进行质粒转化。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用aflii-hf限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表7，使用1％琼脂糖凝胶电泳观察目的片段如图9(c)，最后进行sanger测序。故构建出plenti-nectin4car1-il7-ccl19重组质粒。

(3)构建plenti-nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19重组质粒：

使用引物car1f、car1-p2ar扩增出nectin4car1-p2a片段，扩增条件为(98℃10s，,60℃15s，68℃1.5min)*35循环，引物p2a-car2f、ccl19r扩增出p2a-nectin4car2-il7-ccl19片段，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃2.5min)*35循环，扩增体系见表3。使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段见图10(a)，获目的条带1.5kb和2.5kb，然后用xygene胶回收试剂盒分别回收目的片段(操作步骤见下表2)，检测浓度和纯度。取两胶回收产物各1μl为模板，用car1f和ccl19r为引物，扩增目的片段nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19，扩增体系如表4所示，扩增条件为(98℃10s，60℃15s，68℃4min)*35cycle，使用1％琼脂糖凝胶电泳获得目的片段如图10(b)，目的条带大小为3,957。nectin4car1-p2a-nectin4car2-il7-ccl19胶回收片段和①中plenti载体胶回收片段通过无缝克隆连接，然后进行质粒转化。挑单克隆菌落进行菌液扩增37℃，250rpm/min，12h-14h，质粒提取，最终用aflii-hf限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系见表7，使用1％琼脂糖凝胶电泳观察目的片段如图10(c)，最后进行sanger测序。

表1.引物序列

seqidno.11氨基酸序列来自wo2017/042210al，seqidno.12所示的氨基酸序列来自enfortumabvedotin(cas:1346452-25-2)，seqidno.13氨基酸序列源自人源性il7和ccl19序列，核苷酸序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，最终以质粒干粉形式保存。

表2.胶回收

表3.pcr体系

表4.重叠pcr体系

表5.t4克隆体系

表6.无缝克隆体系

表7.限制性酶切体系

二、利用plenti载体质粒及辅助质粒转导293t细胞以包装慢病毒，并将包装出的慢病毒转染jurkatcell以计算病毒滴度

(1)293t细胞培养于含10％fbs和1％青链双抗的dmem培养基，细胞贴壁后密度达到70％，准备含10％fbs的opti-dmem全培于37℃培养箱中复温，吸弃293t细胞中的dmem原培养基，将opti-dmem沿皿壁加入到293t细胞；

(2)用1.5mlpbs重悬60ugpei，1.5mlpbs重悬总质量为20ug的plenti载体质粒及辅助质粒；质粒按plenti-nectin4car1&car2-il7-ccl19：plp1：plp2：pmd2g＝18：9：4：3比例混合；

(3)室温静置5min，将pbs-pei混合液加至pbs-dna混合液中，室温静置20min；

(4)准备opti-dmem全培于37℃培养箱中复温，吸弃293t细胞中的dmem原培养基，将opti-dmem沿皿壁加入到293t细胞；

(5)将pei-dna-pbs混合液加至培养皿中，37℃培养48h；

(6)收集上清液中的慢病毒于50ml离心管；

(7)1500rpm离心5min去除细胞碎片，再用针筒通过0.45um过滤器过滤后，3000×g离心12-14h，4℃以浓缩病毒；

(8)吸弃上清，以1:200-1:400加入vivo全培或aim-v全培(最好加1％hepes)，重悬病毒；

(9)将病毒分装于1.5mlep管中，保存于-80℃，避免反复冻融(冻融使滴度降低一个数量级)，剩少许病毒用于下步的病毒滴度检测实验；

(10)jurkat细胞1500rpm离心5min后，弃上清，1ml1640培养基重悬，计数；

(11)于96孔板中加入0.5x106jurkat细胞，以1:50、1:500、1:1000、1:2000等梯度比例加入病毒，再补充培养基至每孔总体积为200ul；

(12)每孔加入0.1ulpolybreneb蛋白促转导(0.1ul/200ul体系)；

(13)将96孔板经1200g，90min，32℃离心，离心后，于37℃培养箱孵育4h；

(14)将96孔板各孔的jurkat细胞悬液吹打混匀后转至1.5mlep管中，1500rpm离心5min后，弃上清，用1ml1640全培重悬后转至24孔板中扩大培养48h，37℃。

三、密度梯度离心法分离健康人的外周血单个核细胞(pbmc)，慢病毒转染t细胞并检测t细胞表面car表达情况

(1)取健康人外周血10ml至edta-na2抗凝管，与dpbs按照1:1的比例混匀；

(2)取四只15ml无菌离心管，分别加入5mlficoll分离液，将外周血与dpbs的混合液缓慢加至ficoll分离液面上，注意不要破坏液面；

(3)水平离心800g，20min，25℃，加减速度均调到“0”；

(4)离心后用巴氏吸管将离心管中的白色絮状层即pbmc层吸出，置于新的无菌离心管中，加入pbs，将pbmc离心洗两遍；

(5)1500rpm/min，5min水平离心，弃掉上清,加入1mlbuffer1(dpbs含5％fbs)重悬计数pbmc；

(6)用流式细胞术确定pbmc中cd3阳性细胞的比例。在细胞悬液中以cd3/cd28dynabeads:cd3阳性细胞＝3:1的比例加入cd3/cd28beads(106个cd3阳性细胞加30ulbeads)，4℃以1rpm速度旋转摇晃30min使磁株与细胞充分接触结合；

(7)30分钟以后，在试管中加足够(大于1ml)buffer1，然后把试管放于磁力架上左右旋转1～2分钟，吸弃上清；

(8)配制vivo完全培养基：vivo空培+5％fbs+1％hepes+1％丙酮酸钠+1％非必需氨基酸+1:30谷氨酰胺+1:10000il-2+1:2000il-7+1:2000il-15，并用vivo全培重悬细胞与磁珠，计数；

(9)加培养基使cd3阳性细胞浓度在0.5-1x106/ml之间。铺板细胞浓度为0.5～1.0×106/ml，置于37℃培养箱培养；

(10)t细胞培养24-36h，5％co2，37℃；

(11)在24-36h内，以moi值＝5、20、40、80转导car慢病毒载体，moi(病毒感染复数)＝[病毒滴度x病毒体积(ml)]/细胞数；

(12)1200xg，90min，4℃离心后，在37℃培养箱孵育至96孔板长满细胞后转至24孔板中，1,3,5日计数监测细胞生长状况，绘其生长曲线，5-7天时测car转导率。结果如图4所示。

四、rtca法检测car-t细胞对靶细胞的杀伤作用

(1)e-plate16准备:在e-plate16的孔中加入50μl培养基，将e-plate16放到rtcastation上，开始检测基线(background)，确定所选择的孔接触正常，所有孔的cellindex低于0.063；

(2)取出e-plate16，在孔中加入100μl混合均匀的ht1376人膀胱癌细胞悬液，使每孔中细胞数目为10000cells/50μl，将e-plate16置于超净台中室温放置30min后放置培养箱中的rtcastation上，过夜检测细胞增殖曲线；

(3)过夜后取出e-plate16，置于超净台中，将car-t细胞及对照细胞分别按照e:t＝20:1加入各孔中；

(4)设置mock细胞组，t细胞的数目与上述(3)中car-t细胞数相同；

(5)同时设置两个对照，阴性对照为ht1376细胞在培养基中培养；阳性对照为在培养基加入2.5％的triton-x100，两者均不加mock细胞或car-t细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值；

(6)将e-plate16放到rtcastation上培养48h后，观察曲线变化，结果如图5所示。

五、通过荧光素酶法检测car-t细胞对靶细胞的杀伤作用

(1)培养nectin4-luc-ht1376细胞至对数生长状态，取一定细胞数离心沉淀后计数：

(2)96孔平底不透明白板中加入10⁴个nectin4-luc-ht1376细胞，培养基补充至100ul；培养4-6小时使细胞贴壁生长：

(3)nectin4car1-il7-ccl19、nectin4car2-il7-ccl19、nectin4car1&car2-il7-ccl19三种第四代car-t细胞与nectin4-luc-ht1376细胞数比例设定为5:1、10:1、20:1和40:1，将相应的car-t细胞加入每孔混合培养：

(4)设置mock细胞组，t细胞的数目与上述(3)中car-t细胞数相同：

(5)同时设置两个对照，阴性对照为nectin4-luc-ht1376细胞在培养基中培养；阳性对照为在培养基加入2.5％的triton-x100，两者均不加mock细胞或car-t细胞，作为细胞杀伤的最小和最大化背景值，即kmin和kmax；

(6)培养12小时后，96孔板以1500rpm速度离心5min，弃掉上清，用培养基洗一次后重悬细胞；

(7)每孔加入0.5mm的d-荧光素，避光静置10min后，在酶标仪用化学发光模式(luminometricmeasurement)检测荧光强度，每孔检测时间为1000ms；

(8)统计各孔的荧光强度值k，比较car-t与mock细胞对nectin4-luc-ht1376细胞的杀伤效率％，计算公式为：杀伤效率％＝(kmin-k)/(kmin-kmax)x100％，结果如图6所示。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>温州启星生物技术有限公司

<120>一种第四代car-t细胞及其构建方法和应用

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