一种广泛适用于植物野外取样的保存液配方及其使用方法与流程

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种广泛适用于植物野外取样的固体保存配方。

背景技术：

从分子水平研究植物变化是植物学科中十分重要的手段，在此基础上，芯片分析以及高通量测序等技术给我们带来十分庞大的数据信息。而目前人们遇到的麻烦之一是：许多植物样本位于远离实验室的地方，例如地处偏远的野生动植物保护区，这样取材的过程至少需要以下几个步骤：过于偏远的地方采用人工取样，在取样点将材料进行初级处理后，将其运输至交通较为便利的地方，通过交通工具进行样品转移直至实验室。而核酸，尤其是核糖核酸rna，在离体0.2-0.5h左右的时间即降解，即便部分材料可以保存于乙醇等有机溶剂中，在运输过程中损失量同样较大且运输过程安全性较差。故对植物组织运输保存方法的研究仍有提高空间。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供一种植物野外取样的保存配方，通过此植物野外取样的保存液的使用，保护所取到的样品不受到伤害，在科研领域中，提供实验所需要的完整的rna。

本发明的技术方案是：

1植物野外取样的保存液配方，其特征是由以下成分及其含量组成：a组分：50mmtris-hcl(ph＝8.0)，1mmedta，葡萄糖100mm，甘油3％，硼酸-四硼酸钠缓冲液0.025mm，nacl1.6mm，catb0.5％(m/v)；b组分：琼脂粉15g/l。经无菌水溶解并适当加热(50-60度)至琼脂粉完全熔化，待液体冷却至40度后浸没植物标本使用。

2植物野外取样的保存液实验室处理方式：将样品周围琼脂去掉，将样品和残留琼脂一并放入50ml离心管中，加入3mm异硫氰酸胍混合，按每ml保存液加入0.05gsio2，55度水浴10min，取出后用研磨棒研磨5min后，用振荡器剧烈震荡15min。12000rpm离心5min，将上清小心转移至另一离心管中，加入等体积氯仿进行震荡，后期操作与常规提取方法一致。

附图说明：

图1经本产品保存及新鲜样品直接提取总rna含量对比图

图2rna质量图

表1分光光度法检测结果

具体实施方式：

1.野外采样：将50ml保存液(a成分)中加入0.75g琼脂粉(b成分)，加热溶解后放置一旁冷却；将采集到的动植物样品放入50ml离心管中(如有必要可进行切割后放入离心管中)，待上述已加热的保存液冷却至40度以下时迅速倒入离心管中，冷却至固体后将管口用parafilm封口膜完全封闭。

2.运输过程中应注意防止高温(大于50度)或雨水等对管的污染。运输过程应不超过120h。

3.实验室预处理：将上述固体保存块从离心管中取出，去除多余的琼脂部分，将样品和残留琼脂一并放入新的离心管中，加入3mol/l异硫氰酸胍混合，按每ml保存液加入0.05gsio2，55度水浴10min，取出后用研磨棒研磨5min，之后用振荡器剧烈震荡15min。12000rpm离心5min，将上清小心转移至另一离心管中，加入等体积氯仿进行震荡。

4.4℃13000rpm离心8min，取上清。重复一次上述步骤。

5.上清加入用1/10体积naac和二倍体积无水乙醇沉淀15min，13000rpm离心10min。75％酒精洗两次,溶于30ul的水(depc水)中。

实施效果：

提取效率检测：将同样重量样品分为两组，第一组采用传统方法提取；第二种采用自制的保存液进行保存72h后进行提取，通过分光光度法对核酸总量进行检测。结果表明，经自制保存液保存的样品核酸总量与传统方法提取相比未发生显著减少(图1经本产品保存及新鲜样品直接提取总rna含量对比图)。

提取质量检测：将同样重量样品分为两组，第一组采用传统方法提取；第二种采用自制的保存配方进行保存72h后进行提取，结果表明，两组所提取的样本都未发生rna降解现象(图2rna质量图：左侧泳道为新鲜样品提取rna，右侧显示为经本产品保存72h后及提取rna结果，样品为杨树叶片，上样量为3ul)，用分光光度法对所提取样本230，260，280和320nm波长吸光光度值进行检测，两组样本结果良好，毛细管电泳法检测结果显示，自制保存样本rin值大于8，表示rna完整性良好，完全满足建库等生物学实验需要(表1)。

表1分光光度法检测结果

技术特征：

技术总结
本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种广泛适用于植物野外取样的保存配方。其特征是由以下成分及其含量组成：A组分：50mM Tris‑HCl(PH＝8.0)，1mM Na2EDTA，100mM葡萄糖，5％甘油，硼酸‑四硼酸钠缓冲液0.025mM，NaCl 1.6mM，CATB 0.5％(m/v)；B组分：琼脂粉。本发明能够保证外界不超过50℃，时间不超过72h的情况下可以完整保存任何植物样本RNA的完整性，且该溶液不会产生明显气味，对人体无害，在运输过程中也无易燃易爆等任何危害，可以携带上汽车火车等通用交通工具，也可以通过飞机等方式运输。回到实验室后，可通过专门的提取液将样品中的核酸提取出来，核酸质量可以达到建库标准。

技术研发人员：曲春浦;许志茹;杨成君;胡彦波;刘关君
受保护的技术使用者：东北林业大学
技术研发日：2017.09.28
技术公布日：2019.04.05