本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种天冬氨酸转氨酶及其制备方法。
背景技术：
天冬氨酸转氨酶，别名：谷氨酸-草酰乙酸转氨酶，英文名：aspartatetransaminase(ast)。天冬氨酸转氨酶在人体内氨基酸分解代谢中的联合脱氨基作用中起重要作用，它催化天冬氨酸和a-酮戊二酸的氨基转移作用，形成谷氨酸和草酰乙酸。广泛分布于人体各组织，其主要位于肝脏，肾脏和骨骼肌，以心肌含量最高。天冬氨酸转氨酶的含量测定在医学上作为肝功能检查的重要指标，用于判断肝功能是否受到损害。
肝脏内的天冬氨酸转氨酶有两种同工酶，分别是存在于肝细胞线粒体的m-ast和胞浆内的s-ast。在血清中ast的正常值为0～40u/l。当肝细胞有轻度病变时，s-ast被释放进入血液，病变加重时，m-ast也会被相继释放，血清中ast的含量与肝细胞损害程度成正相关，因此可以通过测算血清中ast含量来推断肝功能是否正常。
利用天冬氨酸转氨酶生产芳香族氨基酸具有极大的应用前景，在适宜条件下，以天冬氨酸和几种酮氨酸为底物合成对应的l-氨基酸。在利用天冬氨酸转氨酶合成苯丙酮酸，对羟苯丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸时具有较好的效果。
目前生产得到的天冬氨酸转氨酶对低温的耐受能力差，在低温下几乎不能发挥活性，在工业生产上，对温度的要求较高。
技术实现要素：
为解决以上问题，本发明提供一种天冬氨酸转氨酶及其制备方法，得到的天冬氨酸转氨酶具有较好的低温耐受。
本发明的目的之一是提供一种天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列；所述天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明的目的之二是提供一种编码天冬氨酸转氨酶基因的碱基序列；所述天冬氨酸转氨酶基因的碱基序列如seqidno.2所示。
本发明的目的之三是提供一种天冬氨酸转氨酶的制备方法。
天冬氨酸转氨酶的制备方法，包括以下步骤：
1)利用pcr技术扩增seqidno.2所示的碱基序列；
2)将seqidno.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建天冬氨酸转氨酶的表达载体；
3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到细菌天冬氨酸转氨酶蛋白。
作为优选，所述步骤1)中，pcr技术扩增所用的引物为：正向引物如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示。
作为优选，所述步骤2)中载体质粒为pet21a(+)。
作为优选，所述步骤3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌bl21感受态菌体。
作为优选，所述步骤3)中，所述纯化蛋白过程中利用ni-nta亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。
本发明的有益效果在于：本发明通过pcr技术在喜冷杆菌属中扩增得到天冬氨酸转氨酶基因，并且通过ncbiblast碱基序列比对证明该天冬氨酸转氨酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的天冬氨酸转氨酶基因序列。通过基因工程技术得到表达天冬氨酸转氨酶蛋白的ecolibl21-pet21a-at重组菌株，诱导表达重组菌株得到天冬氨酸转氨酶蛋白。利用ecolibl21-pet21a-at重组菌株诱导表达天冬氨酸转氨酶蛋白的方法简单，易操作，而且经过试验证明本发明的天冬氨酸转氨酶为低温酶，即在低温条件下发挥活性，具有较好低温的耐受力，能为工业生产节约能耗。
附图说明
图1为pcr扩增天冬氨酸转氨酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中m泳道为dnamarker，1号泳道为pcr扩增天冬氨酸转氨酶基因的产物；
图2为重组菌株ecolibl21-pet21a-at表达天冬氨酸转氨酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中marker泳道为proteinmarker；at泳道为天冬氨酸转氨酶蛋白。
图3为表达载体pet21a-at的构建示意图；
具体实施方式
实施例1
天冬氨酸转氨酶基因的获取
1)获取含有目的基因的菌株
本发明利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如专利号为201710034491.5的中国发明专利，该菌株的命名为：cryobacteriumbaishanse02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno：m2016604。保藏日期为2016年10月31日，保藏地址为，中国武汉，武汉大学。
2)基因组的提取
利用dna提取试剂盒(takaradalian)提取cryobacteriumbaishanse02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。
3)pcr扩增目的基因
设计引物：正向引物如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示；pcr反应体系如下表1所示：
表1
pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
将pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，pcr扩增产物的大小与预计的1140bp接近，将pcr扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断pcr扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。
测序结果如seqidno.2所示，将seqidno.2所示的碱基序列在ncbiblast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与cryobacteriumarcticumstrainpamc27867的天冬氨酸转氨酶相似性为93％，即可判断seqidno.2所示的碱基序列属于cryobacterium属的新的天冬氨酸转氨酶序列。
实施例2
构建天冬氨酸转氨酶的表达载体
将实施例1中得到的pcr扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶ecori和ndei对pcr扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶ecori和ndei对载体pet21a(+)进行双酶切反应，然后经高效dna连接酶highligation(toyobo)催化连接经双酶切反应后的pet21a(+)和pcr扩增产物；构建得到天冬氨酸转氨酶的表达载体pet21a-at，表达载体pet21a-at的构建如图3所示。
实施例3
表达和纯化天冬氨酸转氨酶蛋白
将实施例2得到的表达载体pet21a-at转化入大肠杆菌bl21的感受态菌体中，大肠杆菌bl21的感受态的制备采用cacl2法，cacl2法制备大肠杆菌bl21的感受态为实验室常规实验手段，在此不再赘述。将得到的表达载体pet21a-at转化入大肠杆菌bl21后得到重组菌株ecolibl21-pet21a-at。将ecolibl21-pet21a-at扩大培养至od600＝0.6后添加1mmiptg，28℃诱导培养表达天冬氨酸转氨酶蛋白，诱导培养结束后收集菌体，依次经菌体破碎和ni-nta亲和层析色谱柱纯化后得到纯化后的天冬氨酸转氨酶蛋白，如图2所示，得到天冬氨酸转氨酶蛋白的蛋白分子量在29.0-44.3之间，与理论预计值40.7kd一致，表明纯化得到的蛋白即为天冬氨酸转氨酶蛋白。
实施例4
反应温度对天冬氨酸转氨酶的活力影响试验
利用mavrides法测定；
底物的配制：配制50mmol/l的l-天冬氨酸和α-酮戊二酸的反应液，反应液ph为7.0；
酶活力单位定义：天冬氨酸转氨酶在一定的温度和ph条件下，每秒钟催化转换1mol底物氨基酸生成相应产物定义为一个活力单位。结果见下表1：
表1
由表1可以看出，本发明得到的天冬氨酸转氨酶最适温度为50℃，而且天冬氨酸转氨酶在4℃具有11％的相对酶活，与现有的天冬氨酸转氨酶相比，本发明得到的天冬氨酸转氨酶具有较好的低温耐受，这是因为编码天冬氨酸转氨酶的碱基序列来自于cryobacteriumbaishanse02，cryobacteriumbaishanse02为低温菌，使得到的天冬氨酸转氨酶具有低温耐受特性，利用本发明的天冬氨酸转氨酶能够在低温条件下生产芳香族氨基酸，具有极大的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>湖北工业大学
<120>天冬氨酸转氨酶及其制备方法
<160>4
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