本发明涉及涉及微生物
技术领域：
，更具体的说涉及一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法。
背景技术：
：聚-β-羟基丁酸酯(phb)是微生物合成的一种高分子聚合物，由于具有生物可降解性、生物相容性以及光学活性，在医学、药学、农学、电子等领域具有广阔的应用前景。目前，利用微生物发酵生产phb是较为成熟的方法，然而，微生物累积phb的含量不高、累积phb所需的效率低等，造成了phb价格过于高昂，无法满足市场的需求。技术实现要素：本发明目的就是提供一种高效累积phb的方法。为了实现本发明的这些目的和其他优点，一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)构建发酵容器：在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得所述发酵容器；2)接种：将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)培养：紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，并使亚硝基铁氰化钠在发酵液中的浓度为0.06～0.15mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04～0.05t，持续培养4～8天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为4～6的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡10～30min，振荡结束后使用20～40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。优选的是，将丙酮酸4.00～6.00g，(nh4)2so41.00～2.00g，kh2po41.00～2.00g，k2hpo4.3h2o1.00～2.00g，mgso4.7h2o120～180mg,cacl2.2h2o75～100mg,edta20～40mg,vb11～3mg，烟酸1～3mg，维生素h15～30ug，h3bo32.8～4.5mg，znso4.7h2o240～300ug，mnso4.h2o1.6～3.2mg，cu(no3)2.3h2o40～60ug，na2moo4.2h2o750～900ug，溶解于1000ml蒸馏水中,调节ph至7.5-8.5,获得所述发酵液。使用丙酮酸作为碳源，不仅有利于紫色非硫光合细菌的生长，也有利于后期phb的累积。优选的是，所述紫色非硫光合细菌的接种量为培养液总体积的25％～40％。控制紫色非硫光合细菌的接种量，能抑制杂菌的生长，并能缩短紫色非硫光合细菌在发酵液中的适应期，使紫色非硫光合细菌的生物量能得到较快的累积。优选的是，所述白炽灯的光照强度为3000～5000lux。白炽灯的色光最接近于太阳光色，显色性好，光谱是连续而且平均的，拥有极佳演色性的优点，适合紫色非硫光合细菌的生长。优选的是，将氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合均匀，置于坩埚中在1300～1600℃下煅烧2～3h，冷却后，取出进行高能球磨，获得纳米发光材料；将所述纳米发光材料添加到氯化亚铁与氯化铁的溶液中，在高速搅拌条件下添加氨水，之后高速离心获得沉淀，所述沉淀洗涤至中性后在50～60℃条件下干燥，在干燥的所述沉淀中添加环氧树脂粉末，搅拌均匀，加热至250～300℃，保温5～10min后添加固化剂并搅拌均匀，保温5～10min，冷却至室温后进行高能球磨，获得粒径为0.05～0.1mm的所述磁性发光材料。所述固化剂为脂肪二胺、芳香族多胺、三氟化硼以及有机酸酐。通过该方法制备的磁性发光材料将磁至纳米发光材料与磁性四氧化三铁结合在一起，并且该方法制备的纳米发光材料在低于0.01t的弱磁场中也能发出较强的光强，而四氧化三铁对紫色非硫光合细菌具有较好的吸附性能。优选的是，氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合的摩尔质量比为0.1～0.3：3～5：1～2：1～2。通过控制氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合的比例，使制备的纳米发光材料在较弱的磁场作用下也能发出较强的白光。优选的是，所述氯化亚铁与氯化铁的摩尔质量比为1:2～3。通过控制氯化亚铁与氯化铁的比例，使制备的磁性四氧化三铁具备较好的磁性和对紫色非硫光合细菌良好的吸附性能。优选的是，所述环氧树脂粉末与所述沉淀的质量比为1：50～100。通过控制环氧树脂粉末的含量，使其能有效的将纳米发光材料与四氧化三铁交联在一起，也使得制备的磁性发光材料具有较好的抗ph变化的能力。优选的是，步骤3)中磁性发光材料的添加量为发酵液总质量的2％～4％；丙酮酸的添加量为发酵液总质量2.5％～5％。本发明的有益效果：本发明方法制备的磁性发光材料能在磁场的作用下发光和运动，在紫色非硫光合细菌培养的后期添加该磁性发光材料，使紫色非硫光合细菌吸附在该磁性发光材料上，降低了发酵液中游离细菌的含量，使得紫色非硫光合细菌能够再次生长从而获得较高的细胞密度；紫色非硫光合细菌大量吸附于磁性发光材料上，为紫色非硫光合细菌营造出富碳缺氮的微环境以利于phb的累积；在变换的磁场的作用下，磁性发光材料不仅能发出光以利于高密度紫色非硫光合细菌的生长，还能使磁性发光材料一直处于运动状态，避免了紫色非硫光合细菌出现沉降或在发酵液中分布不均不利于生长；添加亚硝基铁氰化钠能提高紫色非硫光合细菌中一氧化氮的含量从而提高nadh的含量以利于phb的累积。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)构建发酵容器：在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联并与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)接种:将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)培养：紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，并使亚硝基铁氰化钠在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养4天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例2一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)构建发酵容器：在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)接种：将发酵液添加到透明的发酵容器中，其中，将丙酮酸4.00g，(nh4)2so41.00g，kh2po41.00g，k2hpo4.3h2o2.00g，mgso4.7h2o180mg,cacl2.2h2o75mg,edta40mg,vb11mg，烟酸3mg，维生素h15ug，h3bo32.8mg，znso4.7h2o240ug，mnso4.h2o1.6mg，cu(no3)2.3h2o40ug，na2moo4.2h2o750ug，溶解于1000ml蒸馏水中，调节ph至8.5,获得所述发酵液；接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)培养：紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，并使亚硝基铁氰化钠在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养5天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例3一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)构建发酵容器：在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)接种：将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种发酵液总体积25％的紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)培养：紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，并使亚硝基铁氰化钠在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养6天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例4一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)构建发酵容器：在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)接种：将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种发酵液总体积25％的紫色非硫光合细菌并在5000lux的白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)培养：紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，并使亚硝基铁氰化钠在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养7天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例5一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，其中磁性发光材料的制备方法为：将氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合均匀，置于坩埚中在1600℃下煅烧2h，冷却后，取出进行高能球磨，获得纳米发光材料；将所述纳米发光材料添加到氯化亚铁与氯化铁的溶液中，在高速搅拌条件下添加氨水，之后高速离心获得沉淀，所述沉淀洗涤至中性后在50℃条件下干燥，在干燥的所述沉淀中添加环氧树脂粉末，搅拌均匀，加热至250℃，保温5min后添加固化剂并搅拌均匀，保温10min，冷却至室温后进行高能球磨，获得粒径为0.05mm的所述磁性发光材料；并添加亚硝基铁氰化钠以使其在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养8天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例6一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，其中磁性发光材料的制备方法为：将摩尔质量比为0.1：3：2：1的氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合均匀，置于坩埚中在1600℃下煅烧2h，冷却后，取出进行高能球磨，获得纳米发光材料；将所述纳米发光材料添加到氯化亚铁与氯化铁的溶液中，在高速搅拌条件下添加氨水，之后高速离心获得沉淀，所述沉淀洗涤至中性后在50℃条件下干燥，在干燥的所述沉淀中添加环氧树脂粉末，搅拌均匀，加热至250℃，保温5min后添加固化剂并搅拌均匀，保温10min，冷却至室温后进行高能球磨，获得粒径为0.05mm的所述磁性发光材料；并添加亚硝基铁氰化钠以使其在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养6天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例7一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，其中磁性发光材料的制备方法为：将摩尔质量比为0.1：3：2：1的氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合均匀，置于坩埚中在1600℃下煅烧2h，冷却后，取出进行高能球磨，获得纳米发光材料；将所述纳米发光材料添加到摩尔质量比为1:2的氯化亚铁与氯化铁的溶液中，在高速搅拌条件下添加氨水，之后高速离心获得沉淀，所述沉淀洗涤至中性后在50℃条件下干燥，在干燥的所述沉淀中添加环氧树脂粉末，搅拌均匀，加热至250℃，保温5min后添加固化剂并搅拌均匀，保温10min，冷却至室温后进行高能球磨，获得粒径为0.05mm的所述磁性发光材料；并添加亚硝基铁氰化钠以使其在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养6天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例8一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加磁性发光材料、丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，其中磁性发光材料的制备方法为：将摩尔质量比为0.1：3：2：1的氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合均匀，置于坩埚中在1600℃下煅烧2h，冷却后，取出进行高能球磨，获得纳米发光材料；将所述纳米发光材料添加到摩尔质量比为1:2的氯化亚铁与氯化铁的溶液中，在高速搅拌条件下添加氨水，之后高速离心获得沉淀，所述沉淀洗涤至中性后在50℃条件下干燥，在干燥的所述沉淀中添加环氧树脂粉末，所述环氧树脂粉末与所述沉淀的质量比为1：50，搅拌均匀，加热至250℃，保温5min后添加固化剂并搅拌均匀，保温10min，冷却至室温后进行高能球磨，获得粒径为0.05mm的所述磁性发光材料；并添加亚硝基铁氰化钠以使其在发酵液中的浓度为0.06mg/l，打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养6天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为5的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡20min，振荡结束后使用40目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例9一种利用紫色非硫光合细菌累积phb的方法，其包括以下步骤：1)在透明的密闭容器的外侧围绕着4组同轴设置的线圈，且中间两组线圈的间距为线圈半径的0.4864倍，两端两组线圈间距为线圈半径的1.8814倍，中间线圈箍数为与两端线圈箍数之比为2.2606，4组线圈相互串联后与交流电源开关连接，获得发酵容器；2)将发酵液添加到透明的发酵容器中，接种紫色非硫光合细菌并在白炽灯光照条件下进行密闭培养；3)紫色非硫光合细菌的培养密度大于5×109个/ml时，往发酵容器中添加发酵液总质量2％的磁性发光材料、5％的丙酮酸与亚硝基铁氰化钠，并添加亚硝基铁氰化钠以使其在发酵液中的浓度为0.06mg/l，其中，磁性发光材料的制备方法为：将摩尔质量比为0.1：3：2：1的氧化铯、氧化铟、五氧化二钒与氧化钇混合均匀，置于坩埚中在1600℃下煅烧2h，冷却后，取出进行高能球磨，获得纳米发光材料；将所述纳米发光材料添加到摩尔质量比为1:2的氯化亚铁与氯化铁的溶液中，在高速搅拌条件下添加氨水，之后高速离心获得沉淀，所述沉淀洗涤至中性后在50℃条件下干燥，在干燥的所述沉淀中添加环氧树脂粉末，所述环氧树脂粉末与所述沉淀的质量比为1：50，搅拌均匀，加热至250℃，保温5min后添加固化剂并搅拌均匀，保温10min，冷却至室温后进行高能球磨，获得粒径为0.05mm的所述磁性发光材料；打开所述电源开关使线圈在所述发酵容器内产生磁场并使磁感应强度为0.04t，持续培养7天，培养结束后过滤发酵液获得滤出物，所述滤出物重悬浮于ph为6的磷酸缓冲液中，并在振荡器上振荡10min，振荡结束后使用20目的滤布过滤，收集滤液获得高phb含量的紫色非硫光合细菌。实施例10对比实验，组1根据实施例9的方法进行培养紫色非硫光合细菌；组2根据实施例9的方法进行培养紫色非硫光合细菌，但是不添加磁性发光材料；组3根据实施例9的方法进行培养紫色非硫光合细菌，但是不添加亚硝基铁氰化钠；组4根据实施例9的方法进行培养紫色非硫光合细菌，但是发酵液中不添加磁性发光材料和亚硝基铁氰化钠；培养结束后对单位体积发酵液中的紫色非硫光合细菌干重和单位质量紫色非硫光合细菌中phb的含量进行检测，结果如下表所示：细菌干重(g/l)phb(mg/g)组11.41910组20.92883组31.07830组41.46760根据上述表格的试验结果可知，组3的细菌干重比组4提高了32％，phb含量提高了9.2％，说明磁性发光材料能显著的提高单位体积发酵液中光合细菌干重，并能在一定程度上促进phb的累积；组2的phb含量比组4提高了16.2％，说明添加亚硝基铁氰化钠能促进phb的累积；组1的细菌干重比组4提高了34％，组1的phb含量比组4提高了19.7％，说明磁性发光材料和亚硝基铁氰化钠能共同促进细菌干重的提高和细菌中phb的累积。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12