一种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法与流程

本发明属于益生菌培养技术领域，具体涉及一种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法。

背景技术：

嗜热链球菌培养基的种类繁多，目前最常见的有四种：mrs培养基、乳清蛋白培养基、脱脂乳培养基、脱脂乳酶解液培养基。mrs培养基适用范围广，几乎所有乳酸菌都可以用其来培养，但增殖速度慢，价格高。乳清蛋白培养基，简单易得，被广泛使用，但由于其乳清蛋白易发生变性沉淀导致用此培养基所培养的菌存活率较低。脱脂乳培养基，同乳清蛋白培养基一样简单易得，价格低廉，但培养基粘度较大，不易操作。脱脂乳酶解液培养基，是有利于嗜热链球菌繁殖的较好的基础培养基，通过使用酶来分解大分子营养物，将不易吸收利用的大分子物质转化为易被吸收利用的小分子物质，从而有利于菌体的增殖，但培养基价格较高，不利于工业生产，工业生产中应用的培养基，一般要求配料简单易得、操作方便、菌体存活率高、增殖速度快、而且培养基与菌体易于分离。

嗜热链球菌增菌培养基使用天然物质来代替化学原料，优化嗜热链球菌培养基，改善培养效果。这些天然物质主要有多糖类、低聚糖类、蛋白质类物质、天然水果蔬菜及豆类、坚果类等。嗜热链球菌增菌培养基材料简单易得，成本低，操作方便，大大提高了菌的存活率，缩短培养时间，有利于工业生产。

苹果富含糖类、酸类、芳香醇类和果胶等物质。王皎、李赫宇、岱琳等对苹果的不同组织研究发现，苹果中的糖类物质大量存在于苹果果肉中，主要包括单糖及双糖。梁俊、郭燕、刘玉莲等对12种品种的苹果进行试验研究，得出结论：苹果中果糖含量最多，其次是葡萄糖，最后是蔗糖。在培养基中加入苹果能为菌的增殖提供丰富的葡萄糖、果糖、蔗糖等碳水化合物。孙文静在研究中表明：苹果中含有丰富的营养物质，适合乳酸菌的生长，而且乳酸菌也是苹果渣培养基中的优势菌。张彪燕表示：苹果中含有丰富的可溶性糖类，蛋白含量较少，适合充当培养基碳源。培养基中加入含量为10%的鲜苹果汁，并于28℃下培养1～2d，可使嗜热链球菌等益生菌的数量大大提高，最大活菌数达到了5.6×10⁷cfu/ml。侯蓓将苹果进行处理后加入嗜热链球菌培养基，在39℃下培养30h，最大活菌数为4.8×10⁹cfu/ml。

香蕉的糖类主要是低聚果糖，而且当香蕉达到最高成熟度时，其低聚糖含量最多。王晓晴，王榆元，周春宏等人研究中发现：添加低聚果糖可以促进嗜热链球菌的生长。候聚敏在研究中得出结论：培养基中加入2%低聚果糖作为碳源，嗜热链球菌的活菌数可达1.5×10¹⁰cfu/ml。

红糖和白糖都是从甘蔗中提取出来的，但两者制作工艺不同，其成分也就不同。张兴昌在研究中表明：蔗糖作为双糖有利于嗜热链球菌的增殖。同时，蒲博通过研究得出结论：用2.0%的蔗糖作为mrs固体培养基的碳源可使植物乳杆菌的菌落数增加3.91倍。

鲜玉米中含有丰富的可溶性蛋白质、氨基酸、淀粉、维生素和矿物质等，其营养结构很适合嗜热链球菌吸收利用。朱克卫在研究中使用玉米作为氮源，结果表明：40g/l的玉米浆为最佳浓度，在此条件下，菌体繁殖最快，产物最多，效果最佳。田洪涛、贾英民、马雯等人表明玉米中丰富的氨基酸、生物素等物质，因而非常适合嗜热链球菌的生长繁殖，经过试验结果分析得出：在培养基中加入0.5%的玉米浆能促进嗜热链球菌生长，其活菌数达到4.7×10⁹cfu/ml。

黄豆中蛋白含量约38%以上，氨基酸成分组成合理，必需氨基酸含量丰富，是植源性全蛋白，在营养价值上跟动物性蛋白可相媲美，属于优质蛋白。李莹、周剑忠、黄开红通过对不同氮源对嗜热链球菌繁殖的影响进行了比较：培养基中加入2%的豆浆，在37℃下培养30h，嗜热链球菌的活菌数达到了3.9×10¹⁰cfu/ml，相对于mrs培养基增菌效果大大提高。胡渊、刘成国、黄茜等人也发现黄豆浆具有良好的增菌效果。

平菇属于蔬菜类中的高蛋白食物，富含粗蛋白，营养价值丰富。刘丹、潘道东在研究中使用质量分数为10%的平菇汁为氮源，使乳酸菌数显著提高。

红豆属于豆类一种，含有丰富的蛋白质、淀粉、维生素和矿物质，具有营养价值，而且具有丰富的赖氨酸。袁肖寒、高学军在实验中表示：对嗜热链球菌增殖效果最明显的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸等。

陈功、徐文华、张其圣等人通过研究得出结论：在普通培养基的基础上添加尖椒汁，能提高活菌的数量。

闫亚梅等人研究发现：在培养基中加入黄瓜汁能大大提高乳酸菌数量，活菌数达到10⁹cfu/ml以上。

严佳丽、苏琦、王世强通过研究得出结论：芹菜中的某些成分能刺激乳酸菌的生长繁殖，酸奶发酵过程中添加一定体积的芹菜汁能使其发酵酸奶的od值达到最大，即芹菜有最佳的增菌效果。同时，伊长文通过研究发现：芹菜汁中含有促生长因子，能起到增菌效果。

李志成、徐怀德、王敏等在研究中表明：西红柿汁作为促生长因子可以提高嗜热链球菌活菌数。田洪涛、贾英民、马雯等人表明：向培养基中加入西红柿汁，可使活菌数达到mrs培养基的40倍。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法，提高了嗜热链球菌的增殖率，从而加快了嗜热链球菌的大规模生产的速度。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由3-5g玉米制得的玉米煮制液和3-5g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括2-4g红糖，余量为水。

每100ml增菌培养基包括由4g玉米制得的玉米煮制液和4g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括3g红糖，余量为水。

所述玉米煮制液的制备方法为：玉米清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液。

所述西红柿煮制液的制备方法为：西红柿清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，定容，调节ph至6-7。

嗜热链球菌是发酵乳制品生产中最常用的菌种之一，由于其具有特殊的生理活性和营养功能，人们把它应用到食品中可以发挥其更大的价值。在改善食品风味，提高食品的营养价值的同时，也增加了食品的保藏性、稳定性与附加值。

相对于现有技术，本发明以嗜热链球菌为研究对象，以生活中常见的食材为主要原料，从而进行嗜热链球菌培养基的增殖优化。由于其材料价格低廉、易得，而且提高了嗜热链球菌的增殖率，从而加快了嗜热链球菌的大规模生产的速度。

附图说明

图1是嗜热链球菌的菌种分离纯化效果图。

图2是苹果汁替换碳源的单因素结果。

图3是香蕉汁替换碳源的单因素结果。

图4是白糖替换碳源的单因素结果。

图5是红糖替换碳源的单因素结果。

图6是香菇汁替换氮源的单因素结果。

图7是黄豆汁替换氮源的单因素结果。

图8是玉米汁替换氮源的单因素结果。

图9是红豆汁替换氮源的单因素结果。

图10是尖椒汁替换促生长因子的单因素结果。

图11是芹菜汁替换促生长因子的单因素结果。

图12是黄瓜汁替换促生长因子的单因素结果。

图13是西红柿汁替换促生长因子的单因素结果。

图14是对比试验结果。

具体实施方式

实施例1：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由3-5g玉米制得的玉米煮制液和3-5g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括2-4g红糖，余量为水。

每100ml增菌培养基包括由4g玉米制得的玉米煮制液和4g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括3g红糖，余量为水。

所述玉米煮制液的制备方法为：玉米清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液。

所述西红柿煮制液的制备方法为：西红柿清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡10-15h，捞出，再加水煮制15-20min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，定容，调节ph至6-7。

实施例2：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由3g玉米制得的玉米煮制液和3g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括2g红糖，余量为水。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡10h，捞出，再加水煮制15min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡10h，捞出，再加水煮制15min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，溶解后定容，调节ph至6。

将所制得的培养基在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养10h，然后进行平板菌落计数，结果约为7.8×10⁹cfu/ml。

实施例3：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由3.5g玉米制得的玉米煮制液和3.5g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括2.5g红糖，余量为水。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡11h，捞出，再加水煮制16min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡11h，捞出，再加水煮制16min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，溶解后定容，调节ph至6.2。

将所制得的培养基在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养12h，然后进行平板菌落计数，结果约为8.1×10⁹cfu/ml。

实施例4：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由4g玉米制得的玉米煮制液和4g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括3g红糖，余量为水。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡12h，捞出，再加水煮制18min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡12h，捞出，再加水煮制18min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，溶解后定容，调节ph至6.5。

将所制得的培养基在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养14h，然后进行平板菌落计数，结果约为8.9×10⁹cfu/ml。

实施例5：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由4.5g玉米制得的玉米煮制液和4.5g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括3.5g红糖，余量为水。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡14h，捞出，再加水煮制19min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡14h，捞出，再加水煮制19min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，溶解后定容，调节ph至6.8。

将所制得的培养基在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养16h，然后进行平板菌落计数，结果约为8.4×10⁹cfu/ml。

实施例6：

一种嗜热链球菌增菌培养基，每100ml增菌培养基包括由5g玉米制得的玉米煮制液和5g西红柿制得的西红柿煮制液，还包括4g红糖，余量为水。

如上述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）将玉米清洗、去皮，在水中浸泡15h，捞出，再加水煮制20min，使用八层纱布过滤取上清液，得玉米煮制液；

（2）将西红柿清洗、去皮，在水中浸泡15h，捞出，再加水煮制20min，使用八层纱布过滤取上清液，得西红柿煮制液；

（3）将玉米煮制液和西红柿煮制液混合，加入红糖，溶解后定容，调节ph至7。

将所制得的培养基在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养14h，然后进行平板菌落计数，结果约为8.2×10⁹cfu/ml。

下述碳源和氮源的添加量以百分数来表示，实际指的是每100ml培养基中含有由碳源或氮源制得的煮制液，例如苹果添加量为2%，即每100ml培养基中含有由2g苹果制得的苹果煮制液。

苹果汁、香蕉汁、玉米汁、平菇汁、黄豆汁、红豆汁、尖椒汁、黄瓜汁、芹菜汁、西红柿汁的制备方法为：将原材料进行清洗（去皮），称取相应质量的原材料，经过一定时间的浸泡（大豆、绿豆浸泡12h，其于浸泡约15min），然后加水煮一定时间（煮制15~20min），使用八层纱布过滤取上清液。

1.试验材料与试剂

1.1菌种

嗜热链球菌，由河南省花花牛生物科技有限公司所生产的食品级花花牛酸奶中分离得到。

1.2试验药品

蛋白胨、牛肉浸膏、酚酞，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖，分析纯，天津市河东区红岩试剂厂；磷酸二氢钾，分析纯，天津市北辰方正试剂厂；柠檬酸氢二铵，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙酸钠，分析纯，北京北化精细化学品有限公司；酵母提取物，分析纯，华美生物工程公司；硫酸镁、氢氧化钠，分析纯，天津市津北精细化工有限公司。

1.3试验材料

碳源包括：红富士苹果、云南香蕉、精制白糖、纯红糖；氮源包括：保玉1号玉米、秀珍平菇、海红豆、黑农41号黄豆；促生长因子包括：宝椒3号尖椒、西洋芹菜、水黄瓜、粉红d-80西红柿。

2.试验仪器与设备

smz745生物显微镜，尼康仪器有限公司；dhp-9213隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ldzh-100kbs高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；fe20实验室ph计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；td-2102b天平，余姚市金诺天平仪器有限公司；sw-cj-2d型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；i2可见分光光度计，济南海能仪器有限公司。

3.试验方法

培养并分离出嗜热链球菌→单因素确定碳源、氮源和促生长因子的最优作用时间和添加量→正交实验得到最优配方。

3.1嗜热链球菌的分离提纯

制备固体mrs培养基，将酸奶经过稀释后涂布在培养皿中，37℃下培养一段时间后，在显微镜下进行镜检选出可能的菌落并多次重复该过程，直到分离出纯嗜热链球菌菌种。经纯化后的菌种进行斜面接种保存，以利于试验的持续进行。

3.2嗜热链球菌增菌培养基碳源的单因素试验

用试验材料中的碳源替代mrs中的碳源，如苹果汁替代mrs培养基中的葡萄糖和酵母膏记做苹果汁培养基，其他材料以此类推。mrs培养基中碳源比例为2.5%，根据这一参考值确定试验碳源添加梯度为2%、3%、4%、5%。

苹果中碳水化合物中约占20%，试验可分别将10g、15g、20g、25g苹果经过煮沸、过滤制作为含有2%、3%、4%、5%碳源的苹果汁。

香蕉中含碳水化合物的量约为15%，分别将13g、20g、27g、33g香蕉经过煮沸、过滤制作为含有2%、3%、4%、5%碳源的香蕉汁。

白糖的碳水化合物的量约为99.9%，分别加入2g、3g、4g、5g白糖于培养基中。

红糖的碳水化合物接近100%，分别加入2g、3g、4g、5g红糖于培养基中。

按照不同的浓度来配制不同的培养基，调节ph值为6.5左右，在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养10h、12h、14h、16h，测定各小时的酸度，确定每种成分的最佳培养时间和最佳添加量，再选出三种效果较好的碳源。

3.3嗜热链球菌增菌培养基氮源的单因素试验

将mrs培养基中的牛肉膏和蛋白胨替换为玉米汁、香菇汁、红豆汁、黄豆汁。mrs培养基中氮源占2%，根据这个值来确定试验氮源添加梯度为2%、3%、4%、5%。

玉米中含蛋白质约为4%，分别将50g、75g、100g、125g玉米经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%氮源的玉米汁。

平菇含蛋白质量约为2%，分别将100g、150g、200g、250g平菇经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%氮源的平菇汁。

黄豆的蛋白质含量约为30%，分别将7g、10g、13g、17g黄豆经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%氮源的黄豆汁。

红豆的蛋白质含量约为20%，分别将10g、15g、20g、25g红豆经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%氮源的红豆汁。

按照不同的浓度梯度来配制不同的培养基，调节ph值为6.5左右，在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养10h、12h、14h、16h，测定各小时的酸度，确定每种成分的最佳培养时间和最佳添加量，再选出三种效果较好的氮源。

3.4嗜热链球菌增菌培养基促生长因子的单因素试验

将尖椒汁、黄瓜汁、芹菜汁、西红柿汁替换mrs培养基中的磷酸氢二钾、柠檬酸二胺、乙酸钠、硫酸镁和硫酸锰来配制培养基，根据mrs培养基中促生长因子量占2%，然后根据这一参考值选取确定试验促生长因子添加梯度为2%、3%、4%、5%。

尖椒中促生长因子约占5%，分别将40g、60g、80g、100g尖椒经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%促生长因子的尖椒汁。

黄瓜中促生长因子约占5%，分别将40g、60g、80g、100g黄瓜经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%促生长因子的黄瓜汁。

芹菜中促生长因子约占5%，分别将40g、60g、80g、100g芹菜经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%促生长因子的芹菜汁。

西红柿中促生长因子约占5%，分别将40g、60g、80g、100g西红柿经过煮沸、过滤制成含有2%、3%、4%、5%促生长因子的西红柿汁。

按照不同的浓度梯度来配制不同的培养基，调节ph值为6.5左右，在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中进行分装，并接种嗜热链球菌菌种5%，于37℃恒温培养箱中分别培养10h、12h、14h、16h，测定各小时的酸度，确定每种成分的最佳培养时间和最佳添加量，再选出三种效果较好的促生长因子。

3.5正交试验

根据表1嗜热链球菌增菌培养基的因素水平表，将碳源、氮源、促生长因子和培养时间作为4个因素，通过单因素试验确定的三种原料作为3个水平，利用l9（3⁴）正交表配制培养基，调节ph值为6.5左右，在121℃下灭菌15min，再在超净工作台中分装至试管中，并接种嗜热链球菌菌种，于37℃恒温培养箱中培养，测量各试管的酸度，确定出最佳培养基。

4.数据测量方法

4.1酸度的测量方法

测定时取10毫升培养基，用20ml蒸馏水稀释，用酚酞作指示剂，然后用0.1mol/l氢氧化钠溶液滴定，按所消耗的氢氧化钠的毫升数表示。消耗0.1毫升为1°t。

4.2菌数测定

将液体培养基稀释到10^-6倍，将稀释10^-4、10^-5、10^-6的三个稀释浓度分别吸取0.1ml涂布到mrs固体培养基上，培养48h左右后进行读数。

5.试验结果与分析

5.1嗜热链球菌的分离提纯

如图1显示，经分离提纯后的菌种为纯的嗜热链球菌，无其他杂菌。

5.2单因素试验结果

5.2.1碳源的单因素结果

根据3.2的方法来配制不同的培养基，分析确定不同碳源的最佳作用时间和添加量。

5.2.1.1苹果汁替换碳源的单因素结果

图2显示在10h-14h之间，不同浓度的苹果汁培养基的酸度都在增加，在14h时达到最高峰，14h之后酸度下降。这说明在14h左右达到了嗜热链球菌生长的对数生长末期或稳定期，之后经过衰亡期菌数开始下降，其中3%的苹果汁的酸度最高为194°t。最后得出结论：苹果汁的最佳作用时间为14h，添加量为3%。

5.2.1.2香蕉汁替换碳源的单因素结果

图3显示2%的香蕉汁在10h-12h之间酸度增加缓慢，12h-14h之间酸度迅速增加，这段时间为嗜热链球菌的对数生长期，14h之后还在增加但增加速度慢。3%的香蕉汁在14h达到峰值而且酸度最大，4%的香蕉汁在14h达到酸度最大值，5%香蕉汁在12h酸度最高，其中3%的香蕉汁的酸度最高达到190°t，过低浓度不利于嗜热链球菌的生长，过高浓度反而会抑制菌的增殖。比较四种浓度最后得出：3%的香蕉汁在14h时效果最佳。

5.2.1.3白糖替换碳源的单因素结果

根据图4显示：2％的白糖培养基酸度值在10h-12h直接缓慢增加，12h-14h内急剧增加，可判断出这段时间为菌种的对数生长期，因此增菌明显，14h之后酸度降低，活菌数减少。3％的白糖培养基的酸度在14h时已达到了峰值，14h之后开始逐渐降低，酸度最大值为173°t。4％的白糖培养基酸度在10h-14h内呈上升趋势，14h之后呈下降趋势，酸度最大值为177°t。5％的白糖培养基酸度同样也是在14h时达到最高，最高值为173°t。根据图4还能发现：白糖的浓度过高或过低都对嗜热链球菌的增殖不利，过低的浓度不能满足菌种的生长需求，而过高的浓度又会起生长抑制作用。总之：白糖培养基的最佳培养时间为14h，白糖的最优添加量为4％。

5.2.1.4红糖替换碳源的单因素结果

根据图5的数据可以得出：2%和3%的红糖培养基酸度曲线相似，都在10h-14h内不断增加，在14h之后开始下降。4%和5%的红糖培养基酸度曲线也得都在10h-12h之间上升，12h之后下降。四种浓度中3%的红糖培养基酸度在14h时最高为191°t，因此红糖培养基的最优作用时间为14h，最佳添加量为3%。

综上所述，四种碳源的最优作用时间都为14h，最佳添加量分别为3%的苹果汁、3%的香蕉汁、4%的白糖、3%的红糖。其对应的酸度最大值分别为194°t、190°t、177°t、191°t，即3%的苹果汁＞3%的红糖＞3%的香蕉汁＞4%的白糖，因此可选取前三种碳源进行正交试验。

5.2.2氮源的单因素结果

根据3.3的方法来配制不同氮源的嗜热链球菌增菌培养基，确定各自的最优作用时间和最优添加量。

5.2.2.1香菇汁替换氮源的单因素结果

根据图6可以看出：不同添加量的香菇汁培养基酸度曲线均在10h-14h内呈上升趋势，其中4%的香菇汁在14h时酸度值最高为191°t，在14h-16h之间酸度曲线呈下降趋势。因此在香菇汁替代mrs培养基的氮源的试验中，香菇汁最优添加量为4%，最优作用时间为14h。

5.2.2.2黄豆汁替换氮源的单因素结果

根据图7显示：四种浓度的黄豆汁培养基均在14h时达到酸度最大值，即在此时活菌数最高，其中4%的黄豆汁在14h时酸度最高，达到167°t。因此，黄豆汁培养基的最优作用时间为14h，最佳添加量为4%。

5.2.2.3玉米汁替换氮源的单因素结果

根据图8得出：在玉米汁的不同添加量中，酸度曲线趋势大致相同，均在14h时达到高峰，即14h为最佳培养时间，4%添加量的玉米汁在四种不同添加量中效果最好，酸度最高为218°t。因此在玉米汁替代氮源的单因素实验中，最优时间为14h，最佳添加量为4%。

5.2.2.4红豆汁替换氮源的单因素结果

根据图9可以得出，不同添加量的红豆汁均在10h-14h之间酸度增加，14h时达到酸度最大值，14h之后酸度逐渐下降，即14h为最佳培养时间。其中4%的红豆汁在14h时的酸度比其余三种添加量的酸度高，为188°t。因此：使用4%的红豆汁替代mrs中的氮源，培养14h后效果最好。

综上所述：四种优化氮源的最优作用时间都为14h，最优添加量分别为4%香菇汁、4%玉米汁、4%黄豆汁和4%红豆汁，对应的酸度最大值为191°t、218°t、167°t、188°t，即4%玉米汁＞4%香菇汁＞4%红豆汁＞4%黄豆汁。选取前三种效果最好的材料进行正交试验。

5.2.3促生长因子的单因素结果

根据3.4的方法来配制更换不同促生长因子的培养基，来分析确定每种材料的最佳培养时间和最佳添加量。

5.2.3.1尖椒汁替换促生长因子的单因素结果

根据图10得出，不同添加量的尖椒汁都在10h-14h之间酸度逐渐增加，14h时达到最大值，14h-16h内酸度降低，即14h为培养基的最优作用时间。在14h时，4%的尖椒汁培养基酸度最高为208°t。得出结论：在尖椒汁替换促生长因子的试验中，最佳作用时间为14h，最佳添加量为4%。

5.2.3.2芹菜汁替换促生长因子的单因素结果

根据图11得出，不同添加量的芹菜汁都在10h-14h之间酸度逐渐增加，14h时达到最大值，14h-16h内酸度降低，即14h为培养基的最优作用时间。在14h时，5%的芹菜汁培养基酸度最高为206°t。得出结论：在芹菜汁替换促生长因子的试验中，最佳作用时间为14h，最佳添加量为5%。

5.2.3.3黄瓜汁替换促生长因子的单因素结果

根据图12得出，不同添加量的黄瓜汁都在10h-14h之间酸度逐渐增加，14h时达到最大值，14h-16h内酸度降低，即14h为培养基的最优作用时间。在14h时，4%的黄瓜汁培养基酸度最高为197°t。得出结论：在黄瓜汁替换促生长因子的试验中，最佳作用时间为14h，最佳添加量为4%。

5.2.3.4西红柿汁替换促生长因子的单因素结果

根据图13得出结论：10h-14h内各添加量的西红柿汁酸度均在增加，14h后开始降低，即14h为最佳培养时间，在最佳培养时间下4%的西红柿汁酸度最好为201°t。因此在西红柿汁替代促生长因子的试验中，使用4%的西红柿汁，培养14h时酸度最高，增菌效果最好。

综上所述：所有材料的最佳作用时间为14h，各材料的不同添加量为4%的尖椒汁、5%的芹菜汁、4%的黄瓜汁和4%的西红柿汁，其对应的酸度分别为208°t、206°t、197°t、201°t，即4%的尖椒汁＞5%的芹菜汁＞4%的西红柿汁＞4%的黄瓜汁。选取前三种效果最好的材料进行正交试验。

5.3正交试验结果与分析

按照上述3.5的试验方法进行正交试验得出的结果见下表2。

从下表2的结果分析中得出，按照培养基酸度的大小，将四种因素排序即d＞b＞c＞a，时间＞氮源＞促生长因子＞碳源。时间的影响最大。结果分析出最佳培养基方案为a3b1c1d2（3%红糖、4%玉米汁、4%尖椒汁、培养时间15h），理论分析结果没有在试验组中，所以需要验证。

5.4对比试验结果

将a3b1c1d2（3%红糖、4%玉米汁、4%尖椒汁、培养时间15h）作为组1，a3b1c3d2（3%红糖、4%玉米汁、4%西红柿汁、培养时间15h）作为组2，得出的活菌数换算为lg(活菌数)，最后结果见下图14。

通过下图14的数据分析得出，mrs培养基最大活菌数为3.6×10⁹cfu/ml，a3b1c1d2即组1的最大活菌数为8.7×10⁹cfu/ml，a3b1c3d2即组2的最大活菌数达到了1.7×10¹⁰cfu/ml。结果表明：本实验的最优组合为a3b1c3d2，其增菌效果约为mrs培养基的4.6倍。最后确定，嗜热链球菌的最佳增菌配方为：3%的红糖作为碳源，4%的玉米汁作为氮源，4%的西红柿汁作为促生长因子，培养时间为15h。

6.结论

本发明以嗜热链球菌为菌种，采用生活中常用的食材为原料，通过单因素实验确定三种碳源及添加量、三种氮源及添加量、三种促生长因子及添加量，然后通过正交实验确定优化培养基。

（1）通过单因素试验确定三种最佳碳源及其添加量即3%苹果汁、3%香蕉汁、3%红糖，三种最佳氮源及其添加量即4%玉米汁、4%平菇汁、4%红豆汁，三种最佳促生长因子及其添加量即4%尖椒汁、5%芹菜汁、4%西红柿汁。

（2）通过正交试验确定的最优组合为3%的红糖、4%的玉米汁、4%的西红柿汁、培养时间为15h。

（3）最优组合与mrs培养基比较验证发现：其增菌效果明显，最大活菌数达到了1.7×10¹⁰cfu/ml，约为mrs培养基的4.6倍。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。