一种鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法与流程

本发明属于鼻咽癌发病检测技术领域，涉及一种鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法。

背景技术：

肽脯氨酰异构酶pin1是一种高度保守的酶，它能够特异性地识别和结合蛋白磷酸化丝/苏脯胺酰基序。pin1在很多种肿瘤组织中过表达，调控多种细胞周期蛋白的构象，从而调控细胞的增殖与分化。通过对多种细胞通路的调节，如细胞生长、细胞周期、细胞增殖与分化等，pin1在肿瘤的发生和发展中起着非常重要的促进作用。前列腺癌pin1作用于磷酸化的β-catenin而调节着细胞的粘附和运动；在乳腺癌pin1作用于磷酸化的cyclind1而调节着细胞周期。此外，pin1与多种病毒相关，如人免疫缺陷病毒i、卡波西肉瘤病毒、丙型肝炎病毒和人类疱疹病毒等。pin1可能通过结合eb病毒dna聚合酶亚基，调节其构象来完成病毒dna复制。鼻咽癌是与人类eb病毒有关的上皮恶性肿瘤。其发病的人群分布和地区分布极不平衡，发展中国家占全球新发病例的92％。鼻咽癌是中国南部地区最为常见的恶性肿瘤，特别是广东地区，因而又被称为“广东癌”。95％以上的鼻咽癌发生与病毒(ebv)的感染有关，在关于ebv感染的严重程度与鼻咽癌分型的关系研究中显示：鼻咽癌未分化癌的ebv感染浓度滴度最高。pin1参与鼻咽癌的发生，通过eb病毒和多个致癌信号通路而发挥重要作用。在eb病毒感染的鼻咽癌中，pin1的过表达能加强癌症的发生和增加其侵袭力。在pin1启动子区两个位点rs2233678(-842g>c)和rs2233679(-667c>t)中，仅有其中的一个位点与肿瘤的发病风险相关。因此，很有必要在鼻咽癌高发的广东地区收集较大量的鼻咽癌病人血液、组织样本及临床资料，进一步明确pin1异构酶启动子的两个多态性位点与鼻咽癌发病风险及临床因素的相关性，以及如何影响pin1异构酶表达及活性。

综上所述，现有技术存在的问题是：在pin1启动子区两个位点rs2233678(-842g>c)和rs2233679(-667c>t)中，仅有其中的一个位点与肿瘤的发病风险相关。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法。

本发明是这样实现的，一种鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法，所述鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法包括以下步骤：

步骤一，血液基因组dna的提取；

步骤二，pcr技术；

步骤三，限制性片段长度多态性酶切方法分析；

将吸附柱cb3放入收集管中；

所述步骤二具体包括：

(1)普通pcr

①pcr管内加入下列物质，总体积：15μl

②将混合物短暂离心，放入pcr仪，反应条件：

③将pcr产物放入-20℃保存；

(2)酶切实验

①pcr管中加入下列物质，总体积10μl

②将试剂混匀后，短暂离心，置37℃水浴3h后，-20℃保存；

水平式琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物。

进一步，所述步骤四之后用平均值±标准差表示；pin1两多态性位点基因型的分布和等位基因的频率在鼻咽癌病人组和正常人对照组中的比较采用卡方检验；两多态性位点与鼻咽癌发病风险的相关性采用的是多元回归分析，用or值和95％ci值表示；两位点与鼻咽癌临床因素关系分析采用卡方检验和fisher’s确切概率法；采用连锁不平衡检测两位点，并用在线的shesis单体型分析两位点单倍体与鼻咽癌发病风险的关系。

本发明的优点及积极效果为：在广东地区收集鼻咽癌病人及正常人血细胞标本各800例(广东医科大学附属医院、南方医科大学附属南方医院提供)，分析pin1启动子多态性与鼻咽癌发病风险，人类基因组dna提取剂盒提取各样本dna，saci酶和banii酶酶切后电泳。

附图说明

图1是本发明实施例提供的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法流程图。

图2是本发明实施例提供的pin1两多态性位点的连锁不平衡示意图；

图中：(a)d′值；图(b)r²值。

图3是本发明实施例提供的干扰ap2α之后pin1的mrna水平是下降示意图。

图4是本发明实施例提供的在蛋白水平上ap2α调节pin1水平示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的鼻咽癌发病风险关联检测的分子方法包括以下步骤：

s101：血液基因组dna的提取；

s102：限制性片段长度多态性(rflp)方法。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

一、病例采集和分组

本实验收集鼻咽癌病人和健康者血液标本，血液收集在抗凝管，-80℃保存，直到提取dna。按照病例对照研究，选择2014年9月至2015年10月广东医科大学附属医院收治的336例和2010年9月至2011年12月广东省南方医院收治的397例鼻咽癌患者血液为病例组，均经病理组织学诊断为鼻咽癌。对照组895例是在2014年9月至2015年10月广东医科大学附属医院收集的年龄和性别相匹配的常规体格检查健康者的血液。所有受试者均是居住在中国广东省，所有参与本实验的受试者均经同意并签于知情同意书，该课题经广东医科大学伦理委员会审核并通过。

二、血液基因组dna的提取

(1)室温解冻冻在-80℃抗凝管的全血，取200μl的血液于1.5ml的离心管中；

(2)加入20μl的蛋白酶k(proteinasek)，充分混匀；

(3)加入200μl的缓冲液gb，充分颠倒混匀，水浴箱70℃放置10min，溶液变清凉，短暂离心，以除去离心管盖和内壁上的水珠；

(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡摇匀15s，短暂离心，以除去离心管盖和内壁上的水珠；

(5)将上一步所得的溶液转移到吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放回收集管中；

(6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

(9)重复步骤8；

(10)离心2min，弃废液，把吸附柱cb3放回收集管中，室温放置5分钟，彻底晾干吸附材料上残余的漂洗液；

(11)把吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附柱膜的中间部分悬空滴加50μl的超纯水，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

(12)将离心管中收集的溶液再加入吸附膜中间部分，室温放置2min，12000rpm离心2min，将所得溶液收集到离心管中，测得浓度，并保存于-20℃。

三、限制性片段长度多态性(rflp)方法

(1)普通pcr

①pcr管内加入下列物质，总体积：15μl

②将上述混合物短暂离心，放入pcr仪，反应条件：

③将pcr产物放入-20℃保存。

(2)酶切实验

①pcr管中加入下列物质，总体积10μl

②将上述试剂混匀后，短暂离心，置37℃水浴3h后，-20℃保存。

(3)水平式琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物

①选择配套的25孔点样梳子，对准电泳槽插梳子位置，垂直架在电泳胶模的一端，使梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm；

②将10xtbe缓冲液稀释成1xtbe缓冲液，可在室温保存备用；

③称取3g琼脂糖，放入1000ml的锥形瓶内，加入100ml的1xtbe缓冲液，制备成3％琼脂糖凝胶，100℃微波加热至琼脂糖融化均匀；

④待琼脂糖凝胶冷却约60℃左右时，加入5μl溴化乙锭，轻轻摇匀，避免起泡；

⑤将琼脂糖胶轻轻倒入电泳胶模中，轻轻插入梳子，室温放置约20分钟左右，见胶凝固后，小心拔掉梳子和电泳胶模两端的挡板，保证上样孔的完好。

⑥小心将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入1xtbe电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm；

⑦将15ml酶切产物与溴酚蓝指示剂缓冲液混合，短暂离心，用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录好样品上样顺序；

⑧盖上电泳槽，开启电源开关，150v恒压，25min；

⑨电泳完毕后，关闭电源，取出凝胶，在254nm波长的紫外透射显影仪下观察，读取并记录条带位置。

五、数据统计

所有的实验结果至少重复三次，均用平均值±标准差表示(means±sd)。hardy-weinberg平衡检验正常人对照组中基因型的观察值与期望值之间差异无统计学意义。pin1两多态性位点基因型的分布和等位基因的频率在鼻咽癌病人组和正常人对照组中的比较采用卡方检验。两多态性位点与鼻咽癌发病风险的相关性采用的是多元回归分析，用or值和95％ci值表示。两位点与鼻咽癌临床因素关系分析采用卡方检验和fisher’s确切概率法。采用连锁不平衡检测两位点，并用在线的shesis单体型分析两位点单倍体与鼻咽癌发病风险的关系。所有的实验结果采用spss16.0和graphpad5进行统计分析，具有统计学意义用*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

六、pin1启动子多态性与鼻咽癌发病风险的相关性

1.鼻咽癌病例组与健康人对照组的一般特征

本实验收集鼻咽癌病人733人，健康人895人。733例鼻咽癌病人中，男性440例，女性393例，平均年龄为(50.22±15.91)岁；肿瘤分期：t1+t289例，t3+t4146例；淋巴结分期：n028例，n1+n2+n3207例；转移26例，无转移211例(由于部分患者临床病理参数不全，导致部分参数总数少于病例总数)。对照组平均年龄为(47.05±11.38)岁。两组研究对象的年龄、性别构成差异无统计学意义(p值分别为0.052和0.131)(表1)。

表1鼻咽癌病例组与健康人对照组的一般特征

2.pin1基因-842g>c和-667c>t两位点基因型、等位基因频率与鼻咽癌发病风险的关系，pin1基因的-842g>c和-667c>t两位点在健康人对照组中，gg848例(94.8％)、gc45例(5.0％)、cc2例(0.2％)；cc319例(35.6％)、ct453例(50.6％)、tt123例(13.8％)，两位点基因型频率的分布均无差别(p值分别为0.095和0.058)，表明符合基因平衡法则。

如表2，在病例组中，-842g>c位点的基因型分布为：基因型gg660例，占90.1％；gc69例，占9.4％；cc4例，占0.5％；而等位基因分布为：基因型c77例，占5.3％；g1389例，占94.7％。在对照组中，该位点的基因型分布为：基因型gg848例，占94.8％；gc45例，占5.0％；cc2例，占0.2％；而等位基因分布为：基因型c49例，占2.7％；g1741例，占97.3％。

在病例组中，-667c>t位点的基因型分布为：基因型cc241例，占32.9％；ct359例，占50.0％；tt133例，占18.1％；而等位基因分布为：基因型t625例，占42.6％；c841例，占57.4％。在对照组中，该位点的基因型分布为：基因型cc319例，占35.6％；ct453例，占50.6％；tt123例，占13.8％；而等位基因分布为：基因型t699例，占39.1％；c1091例，占60.9％。

结果显示：鼻咽癌病例组与健康人对照组在-842g>c和-667c>t两位点基因型分布具有统计学差别(p＝0.001，p＝0.048)。在-842g>c位点，与基因型gg比较，基因型gc与增加鼻咽癌的发病风险相关，而基因型cc则与鼻咽癌发病风险无明显相关。因鼻咽癌组和对照组中cc基因型均少于5例，故将基因cc和gc相合并进行统计，显示组合基因型cc+gc与发生鼻咽癌的危险性增高有关，其发病风险型是基因型gg的2倍(or＝2.000,95％ci＝1.366–2.927,p＝0.001)。在-667c>t位点，基因型tt与增加鼻咽癌的发病风险相关(or＝1.438,95％ci＝1.061-1.922,p＝0.019)。

鼻咽癌病例组与健康人对照组在-842g>c和-667c>t两位点等位基因分布比较也具有统计学意义。等位基因-842g和等位基因-667c的突变，均与发生鼻咽癌的危险性增高有关(表2)。

表2-842g>c和-667c>t两位点基因型和等位基因分布

^adatawerecalculatedbyunconditionallogisticregressionwithadjustmentforageandgender

3、pin1基因-842g>c和-667c>t两位点基因型与鼻咽癌临床因素的关系

pin1基因-842g>c和-667c>t两位点基因型频率与鼻咽癌病人的年龄、性别、tnm分期均未发现相关(p>0.05)(表3和表4)。

表3-842g>c位点的基因型频率与临床参数的关系

*two-sidedfisher'sexacttestwasused.

#dataavailableonlyinsomecases.

表4-667c>t位点的基因型频率与临床参数的关系

*two-sidedfisher'sexacttestwasused.

#dataavailableonlyinsomecases.

4、pin1基因-842g>c和-667c>t两位点单体型频率及其与鼻咽癌发病风险性的关系，对pin1基因-842g>c和-667c>t两位点间进行连锁不平衡分析，结果如图2(d′＝0.706，r2＝0.014)。

在病例组中，单倍体型-842g-667c771例，占52.6％；-842g-667t618例，占42.1％；-842c-667c70例，占4.8％；-842c-667t7例，占0.5％。在对照组中，单倍体型-842g-667c1049例，占58.6％；-842g-667t692例，占38.7％；-842c-667c42例，占2.4％；-842c-667t7例，占0.4％。

结果显示：两位点单倍体型频率与鼻咽癌发病风险具有相关性(p<0.001)。与野生型单倍体-842g-667c相比，单倍体型-842g-667t和-842c-667c频率在鼻咽癌病例组和健康人对照组中均具有统计学意义，且均是与发生鼻咽癌危险性增高有关(or＝1.215,95％ci＝1.053-1.402,p＝0.008；or＝2.268,95％ci＝1.530-3.362,p＝0.001)(表5)。但单倍体型-842c-667t在鼻咽癌病例组和健康人对照组中无统计学差别(or＝1.361,95％ci＝0.475-3.896,p＝0.565)(表5)。

表5-842g>cand-667c>t单倍体频率与鼻咽癌发病风险的关系

aglobaltest.

结果说明：发现在广东省人群中，-842gc基因型和-842gc+cc合并基因型与增加鼻咽癌发生风险有关。在-667c>trs2233679位点上，大多数研究发现此位点多态性与肿瘤发病风险无关，而本研究发现-667tt基因型与增加鼻咽癌发生危险性有关。这些研究结果不一致的原因可能是多方面的：不同的肿瘤类型、样本量大小的不同和不同遗传种族背景等。在鼻咽癌高发地区广东省收集大量的样本，分析pin1基因多态性与发病风险，在人群与基因的分布方面具有一定的代表性和稳定性。

pin1的过表达能促进鼻咽癌的发展和增强其侵袭性。结果显示变异体-842c-667c和-842g-667t的转录活性明显高于野生型-842g-667c，此结果和相应的单倍体与癌症风险发生率相符合。

显示-842g>c和-667c>t基因型分布与鼻咽癌临床特征无关。

综上所述，pin1基因-842g>c(rs2233678)和-667c>t(rs2233679)两个多态性位点都与广东省鼻咽癌的发病风险相关，这可能是癌症发生风险的一个重要的生物标记物，特别是鼻咽癌，为明确这个结论，还发现pin1启动子可以结合转录因子ap2α的活性有关。

如图3：在mrna水平上ap2α调节pin1水平；图4在蛋白水平上ap2α调节pin1水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。