人NOS3基因第61位点的单核苷酸多态性及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及人nos3基因第61位点的单核苷酸多态性及其与类风湿关节炎相关性的检测；本发明还涉及该位点的实时荧光定量pcr检测试剂盒和方法。
背景技术：
：类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,ra)是一种系统性自身免疫性疾病，以关节的炎症为主要特点，主要的病理变化为慢性滑膜炎和血管炎，当累及关节软骨和骨质时，逐渐形成关节畸形和强直，导致关节功能丧失。尽管ra的发病机制至今尚未完全阐明，但目前普遍认为ra的发生是具备遗传易感性的个体在各种危险因素的刺激下诱导机体免疫功能紊乱进而打破自身免疫耐受所致。迄今为止，研究发现了几十个与ra遗传易感性相关的易感区域/位点，因此ra相关基因的多态性特别是占多数的单核苷酸位点多态性研究显得十分重要。然而已报道的ra相关基因位点多态性大多数是在欧美人群中开展的，亦有在韩国、日本与北印度等亚洲人群中开展的。不同种族人群间的ra遗传易感位点既有共同部分也有特异部分。目前尚未见我国ra单核苷酸多态性的系统研究。一氧化氮（nitricoxide,no）在ra的发病机制中起到重要。no由l-精氨酸胍基末端的氮原子与分子氧在nos的催化下合成，而nos是该反应唯一的限速酶，nos3是其中重要的一种。研究表明，nos3基因与ra、behcet’s病、系统性红斑狼疮(sle)、i型糖尿病等多种自身免疫性疾病相关。sanger测序是基因分析的黄金标准，也是基因单核苷酸多态性分析的重要手段；而实时荧光定量pcr可以对特定的单核苷酸多态性位点进行检测，具有灵敏度高、检测快速且很好地避免污染的优点。本发明通过对ra家族中nos3基因第1外显子片段的sanger测序分析，新发现了其第61位点的特定单核苷酸多态性尚未见报道，并通过构建的实时荧光定量检测方法在人群样本中进行了进一步的验证。技术实现要素：为了克服现有中国人群类风湿关节炎的易感基因多态性位点缺乏解析的不足，本发明的目的之一在于提供人nos3基因特定位点单核苷酸多态性，本发明的另一目的在于提供人nos3基因第61位点单核苷酸多态性的检测试剂盒和方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为，人nos3基因第61位点的单核苷酸多态性，其特征在于第61位点的单核苷酸为a核苷酸或g核苷酸即61a/g，其中健康人群nos3基因第61位点均为a核苷酸，类风湿关节炎人群nos3基因第61位点为g核苷酸的比例高达20%，两者具有显著性的人群分布差异；nos3基因第61位点为g核苷酸其所在片段对应的序列如seqidno.1所示，第61位点为a核苷酸其所在片段对应的序列如seqidno.2所示。需要指出的是由于是dna序列，本发明的的a或a核苷酸指的是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，g或g核苷酸指的是鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸。本发明提供的人nos3基因第61位点的a/g核苷酸多态性检测试剂盒为实时荧光定量pcr试剂盒，可以用于检测人nos3基因第61位点的a核苷酸或g核苷酸中的至少一个，该试剂盒包含特异性设计的上下游引物和两种taqman探针，其中上下游引物p1和p2序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示，两种taqman探针t1和t2序列如seqidno.5和seqidno.6所示，分别对应nos3基因第61位点的a和g核苷酸,其中t1探针其5’端标记fam荧光基团，而t2探针其5’端标记hex荧光基团，此两种探针3’端均标记tamra荧光淬灭基团。此外，本发明的实时荧光定量pcr试剂盒还包括定量pcr预混液，是预先混合好了的定量pcr缓冲液、dntp混合液和耐热dna聚合酶的混合液，可向商业化生物公司购买。对应于本发明提供的人nos3基因第61位点的单核苷酸多态性检测试剂盒，本发明的实时荧光定量pcr检测方法其体系为：2×定量pcr预混液10.0μl，上下游引物p1和p2的终浓度均为1μmol/l，taqman探针t1和t2的终浓度均为1.5μmol/l，基因组dna终浓度不少于10ng/μl，灭菌蒸馏水补足至反应总体积为20μl。实时荧光定量pcr检测条件为：95℃预变性3min，再95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，循环50次。本发明提供了人nos3基因第61位点的a/g核苷酸多态性，并揭示了其与类风湿关节炎易感性的关联，在此基础上构建其快速特异实时荧光定量检测试剂盒和方法，这些可以为中国人群类风湿关节炎的易感性机制解析、易感基因检测和精准诊治提供基础。附图说明图1是ra患者nos3基因扩增片段测序局部图谱，图中箭头表明第61位点测序结果为g核苷酸。图2是健康人nos3基因扩增片段测序局部图谱，图中箭头表明第61位点测序结果为a核苷酸。图3是ra患者nos3基因实时荧光定量pcr扩增图谱，图中曲线a代表的是第61位点为a核苷酸片段的扩增，曲线b代表的是第61位点为g核苷酸片段的扩增。图4是健康人nos3基因实时荧光定量pcr扩增图谱，图中曲线a代表的是第61位点为a核苷酸片段的扩增，曲线b代表的是第61位点为g核苷酸片段的扩增。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。研究表明，ra的致病具有遗传易感性人群，而nos3基因是ra发病重要诱导物质no合成的关键基因，且nos3基因1号外显子与其转录密切相关，因此本发明选择利用sanger测序首先在ra家系中测定nos3基因1号外显子的基因序列，发现了其第61位点的a/g核苷酸多态性，并构建特异的实时荧光定量pcr方法和试剂盒，在人群样本进行了验证。结果发现，健康人群nos3基因第61位点均为a核苷酸，类风湿关节炎人群nos3基因第61位点为g核苷酸的比例高达20%，两者具有显著性的人群分布差异，从而揭示出了nos3基因特定位点核苷酸多态性在人群ra患病的易感效应。此外，ra易感基因多态性位点并不止一个，本发明80%的ra患者人群第61位点仍和健康人一样为a核苷酸，经过检测发现有其它单核苷酸多态性位点。实施例1实施例1是8个ra家系人群中nos3基因1号外显子序列测定。（1）ra家系入组和样本采集本研究选取临床确诊的ra患者，通过询问其家族ra发病史，筛选有2个以上ra患者的家族，选择家族中所有ra患者和至少2名非ra健康成员。在取得此种ra家系家族相关成员知情同意情况下，对患者以外的代表性家族成员进行检查，确认其确系ra患者和确非ra的健康人，这里健康人尤其是指非ra患者。研究对象均来自福建省，共收集到8个符合条件的ra家系。收集ra患者的临床病理资料，采集所有人的空腹静脉抗凝血各5ml。（2）nos3基因1号外显子片段扩增和测序针对（1）中收集的血样，采用血液直接pcr试剂盒（北京天根生化科技有限公司）和本发明设计的特异pcr引物seqidno.3和seqidno.4，参照试剂盒体系和扩增条件对nos3基因1号外显子片段进行扩增。扩增产物经电泳检测均成功，片段约为250bp，符合理论长度。将扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行sanger测序，结果发现有2个家系（编号j1和j2），其ra患者（r开头编码）nos3基因第61位点（位于1号外显子内）均为g核苷酸，而其健康成员（h开头编码）均为a核苷酸，详见表1。经文献和数据库查询，发现此多态性即nos3基因61a/g核苷酸尚未见报道。家系结果初步表明nos3基因第61位点的a/g核苷酸多态性和类风湿关节炎易感性相关。表1ra家系成员nos3基因第61位点核苷酸检测结果（3）实时荧光定量pcr试剂盒和方法构建针对nos3基因61a/g核苷酸多态性，本发明设计了特异性的实时荧光定量pcr的上下游引物（p1和p2）以及taqman探针（t1和t2），其中上下游引物p1和p2序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示，两种taqman探针t1和t2序列如seqidno.5和seqidno.6所示，分布对应nos3基因第61位点的a和g核苷酸,其中t1探针其5’端标记fam荧光基团，而t2探针其5’端标记hex荧光基团，此两种探针3’端均标记tamra荧光淬灭基团，相关引物和探针均在上海生工生物工程有限公司合成。采用北京天根生化科技有限公司的血液基因组提取试剂盒进行血样基因组dna提取。采用美国abi公司的7500实时荧光定量pcr仪和taqmangtxpressmastermix试剂盒检测，经过优化定量pcr体系为：2×taqmanmix10.0μl，上下游引物终浓度为1μmol/l，taqman探针1和2终浓度为1.5μmol/l，基因组dna终浓度为50ng/μl，灭菌蒸馏水补足至反应总体积为20μl。经过优化定量pcr条件为：95℃预变性3min，再95℃变性15s，60℃退火及延伸45s，循环50次。pcr产物为241bp。图3和图4结果显示，家系j1和j2中ra患者样品孔均检测到hex荧光扩增曲线（图3曲线b），表明为nos3基因第61位点为g核苷酸的片段扩增，家系中健康成员样品孔均检测到fam荧光（图4曲线a），表明为nos3基因第61位点为a核苷酸的片段扩增，相关结果与sanger测序一致。实施例2实施例2是利用本发明构建的nos3基因61a/g核苷酸多态性的实时荧光定量pcr检测方法在群体样本中进行验证。另外随机选取与实施例1不同的经临床确诊的ra患者100例以及250例健康人，在知情同意的情况下抽取每个人空腹静脉抗凝血样2ml，采用本发明构建的实时荧光定量pcr检测试剂盒和方法进行nos3基因61a/g核苷酸多态性检测，具体操作和参数同实施例1，扩增曲线健康人的参见图4，ra患者参见图3和图4。结果如表2所示。健康人第61位点均为a核苷酸（100%）；而ra患者第61位点为a核苷酸的只有80%（图4），为g核苷酸的则高达20%（图3）。nos3基因第61位点的a/g核苷酸多态性在ra患者群和健康人群中有不同的分布比例，人群结果验证了nos3基因第61位点的a/g核苷酸多态性和类风湿关节炎易感性显著相关。表2人群样本nos3基因第61位点a/g核苷酸多态性检测结果人群第61位点为a核苷酸人数/例第61位点为g核苷酸人数/例总计健康人2500250ra患者8020100虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>王思捷<120>人nos3基因第61位点的单核苷酸多态性及其应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>245<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>1actgaaactaggggcaaggagacgaagagaacatgaaagttaaactttaagatgaagaac60gaagctgaacatactgatgcattggatctttggagaggatctcagaactcattgtactta120atttacaggctaaaaccttagaagaggaatttattatatcctacacaagactccagggaa180gcacatggccttggactgaaggctggcatctggaagctgtcagccaccagcaccttctgc240agcag245<210>2<211>245<212>dna<213>智人(homosapiens)<400>2actgaaactaggggcaaggagacgaagagaacatgaaagttaaactttaagatgaagaac60aaagctgaacatactgatgcattggatctttggagaggatctcagaactcattgtactta120atttacaggctaaaaccttagaagaggaatttattatatcctacacaagactccagggaa180gcacatggccttggactgaaggctggcatctggaagctgtcagccaccagcaccttctgc240agcag245<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaaactaggggcaaggagac20<2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