本发明属于基因突变检测领域，尤其涉及人类egfr基因t790m突变检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
人类表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,egfr）是一种由原癌基因c-erbb-1(her-1)编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，广泛表达于大部分正常上皮细胞中。然而在许多实体肿瘤（如非小细胞肺癌）中往往存在egfr高表达或异常表达的情况，这与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡的抑制有关，因此egfr已经成为相关肿瘤（尤其是非小细胞肺癌）靶向治疗的一个重要靶点。目前应用于临床的egfr靶向药物包括:egfr酪氨酸激酶抑制剂（tkis，如吉非替尼即易瑞沙和厄罗替尼即特罗凯），以及egfr单克隆抗体如西妥昔单抗。大量研究表明，吉非替尼（gefitinib）和厄罗替尼（erlotinib）的疗效与egfr基因尤其是其18-21号外显子的突变状况密切相关。携带egfr基因突变的肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感，患者将得到很大的受益；反之野生型基因的患者将基本不受益，因此egfr基因检测作为非小细胞肺癌等癌症靶向药物选用的前提被列入了最新的nccn（美国国家综合癌症网络）肿瘤临床实践指南。
从2期临床试验阶段开始，egfr酪氨酸激酶抑制剂在女性、非吸烟者、腺癌、东方人中表现出较好的临床效果。而研究表明，egfr基因突变在这类肺癌患者中发生的频率较高。已有共计2880例病例表明，egfr基因突变的频率与东方人（32%）、女性（38%）、非吸烟者（47%）、腺癌（30%）等临床背景密切相关。egfr基因的体细胞突变与nsclc患者对吉非替尼的敏感性相关。这些突变均发生在酪氨酸激酶域的atp结合域附近，88%表现为19号外显子的非移码缺失突变和21号外显子的单碱基替代突变。其中初始发生第20外显子790位密码子的突变即t790m，则表明tki药物不适用。此外，临床上对于tki药物有效的患者，在用药后期均会产生耐药性，超过50%的患者发生了t790m突变。因此在临床用药选择时，t790m耐药突变的检测对于tki的用药指导十分重要。
技术实现要素：
本发明提供了一种基于耐热dna聚合酶、耐热dna连接酶和限制性内切酶的人类egfr基因t790m突变检测方法及试剂盒。针对t790m突变，可以实现高效检测，且十分简便经济。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
人类egfr基因t790m突变检测试剂盒，组分如表1-2所示：
表1本发明扩增试剂盒组分
表2序列表
其中，表1中seqidno.3的5’端的第一个核苷酸为磷酸化修饰，seqidno.4的5’端和3’端的第一个核苷酸均为磷酸化修饰，各扩增引物和连接引物的浓度均为10μmol/l。
利用所述试剂盒的人类egfr基因t790m突变检测方法，主要步骤包括如下：
（1）egfr基因第20号外显子特定片段扩增
提取待测样本基因组dna，以其为模板并采用本发明试剂盒（表1所示）配制扩增体系，扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性15s，50-54℃退火60-90s，72℃延伸60-90s，循环30-36次；72℃终延伸10min。
（2）目的基因片段的酶切和电泳分析
采用试剂盒中的限制性内切酶bstui对pcr扩增产物在60℃下酶切1h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若出现200bp和400bp的两条条带，则表明样品有egfr基因的t790m突变，若只有单条400bp的条带，则表明样品未发明egfr基因的t790m突变。
本发明的有益效果是，基于耐热dna聚合酶、耐热dna连接酶和针对egfr基因的t790m突变的特异连接引物，极大抑制了样品中的野生型egfr基因的扩增，使得t790m突变片段的比例高于50%，从而保证了限制性内切酶对于杂合基因片段体系的准确识别。本发明方法及试剂盒可以有效检测低至1%的egfr基因t790m突变，准确率极高，操作简便且检测费用低廉。
附图说明
图1是采用本发明方法对2例非小细胞肺癌患者组织样品中egfr基因第20号外显子扩增片段的电泳检测图谱。电泳条件为：上样量为5μl，1.5%琼脂糖凝胶，120v电泳45min。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。
实施例1
本实施例以2例非小细胞肺癌患者的组织样本为检测对象（1号和2号），分别采用本发明方法和sanger测序法进行egfr基因t790m突变的检测。具体如下：
（1）egfr基因第20号外显子特定片段扩增
采用组织基因组提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取样本基因组dna，以提取的基因组dna为模板采用本发明试剂盒（表1-2）按表3方案配制扩增体系。扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性15s，52℃退火60s，72℃延伸90s，循环36次；72℃终延伸10min。
表3扩增体系（25μl）
（2）目的基因片段的酶切和电泳分析
采用限制性内切酶bstui对pcr扩增产物在60℃下酶切1h，体系如表4所示。
表4酶切体系（20μl）
酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0.5μg/ml的eb溶液中染色20min并用清水脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。2例样本的结果如图1所示，可知两者均有一条600bp的条带，符合seq.idno.1-seq.idno.2扩增片段长度。而2号样本即对应第二泳道结果，其600bp条带很暗，除此之外还出现了300bp的亮带，系出现t790m突变而被bstui从中间酶解所致。综合分析，1号样本无t790m突变，2号样本检出t790m突变。同时采用sanger测序分析此2例样本，结果一致。因此本发明方法能够实现egfr基因t790m突变的有效检测，酶切操作十分简便且成本很低。
sequencelisting
<110>福建医科大学
<120>人类egfr基因t790m突变检测试剂盒及其检测方法
<130>4
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
cagatgcacccaggaggg18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gtttccacatgcagatgg18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
ctcaccgtgcagctcatcac20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gcagctcatgcccttcggct20