本发明属于块菌菌丝分离和培养技术领域，具体涉及一种印度块菌菌丝快速分离和培养方法。
背景技术：
块菌(truffle)又称松露，无娘果，猪拱菌。是一类珍稀野生食用菌，隶属于子囊菌门，盘菌目，块菌科，块菌属。块菌作为一种药食两用真菌，每千克新鲜黑抱松露的价格更是高达1千多美元。块菌因其子囊果独特的香味与重要的营养价值而在欧洲市场久负盛名。法国黑孢松露，意大利白松露被誉为“地下黄金”、“厨房里的黑钻石”、“上帝的食物”等，近几十年来，人们积极进行着有关块菌的形态特征、系统演化、生理生态等研究。
块菌含有多种生物活性物质，含有丰富的蛋白质、18种氨基酸、不饱和脂肪酸、多种维生素、锌、锰、铁、钙、磷、硒等必需微量儿素，以及块菌多糖、鞘脂类、神经酰胺。α-雄烷醇、腺苷、块菌酸、甾醇、多肽等大量的代谢产物，具有极高的营养保健价值。如含有的α-雄烷醇是一种能调节女性月经周期和性功能的类固醇化合物；神经酰胺是一种天然的人体皮肤保湿成分，可用于化妆品的开发，同时可以用作抗衰老，抗肿瘤，调节免疫功能的药物；块菌多糖具有抗肿瘤和调节免疫功能的作用。
自然界中块菌需要在碱性土壤环境中与橡树、栋树等树种的根系共生，且常年埋没于地下难以被发现，产量相当有限。利用半人工模拟栽培技术获取块菌子实体，从接种到幼苗收获一般需要7-9年时间。因此，直接利用块菌子实体作为大规模生产α-雄烷醇、神经酰胺、块菌多糖等生物活性物质的原料难以实现。
发明的内容
本发明解决的技术问题是块菌菌丝不易分离、不易培养和培养时间漫长，直接利用块菌子实体作为大规模生产α-雄烷醇、神经酰胺、块菌多糖等生物活性物质的原料难以实现。
为解决上述问题，本发明采用组织分离法，在特异性培养基上以一定的操作技术促进块菌子囊孢子的萌发，以获得块菌菌丝，在此基础上可以通过优化菌丝的培养基成分及其生长条件，并且现代发酵工艺高度成熟，可以获得大量的代谢产物以及进行相关的形态特征、生理特性和栽培研究，从而节约资源和缩短培养时间，提高时效。
为达到上述目的，本发明提供一种印度块菌菌丝快速分离和培养方法，包括制备培养基、分离、培养的步骤，所述培养基包括以下组分：麦芽糖10～50g/l、硫酸铵1～5g/l、马铃薯100～400g/l、松针3～20g/l、小球藻水提取物2～10g/l、维生素b10.05～0.3g/l、植物激素(iaa、naa、2，4-d、ga)0～50mg/l、琼脂5～12g/l，调节ph6.5～8.5。麦芽糖在培养基中主要作为碳源和能源，由2个d型葡萄糖通过α-1,4糖苷键连接而成的双糖，与单糖相比较，具有微生物利用的不易性，从而实现所需分离块菌的生长优势；硫酸铵提供无机氮源；马铃薯的作用提供菌丝生长因子和可溶性多糖碳源；麦芽糖、硫酸铵和马铃薯分别从碳源、氮源和生长因子等方面提供了块菌的营养成分；松针提供促进子囊孢子的萌发因子和抑制其它杂菌生长的作用，提供了生态环境下块菌生长的必须营养元素，实现实验室内的自然生态模拟；小球藻提取物主要为小球藻活性生物生长因子(c.g.f.，chlorellagrowthfacter))，c.g.f.含有相当丰富的蛋白、核酸、多糖类成份等，能提高正常细胞再生能力达25％以上，产生更优质细胞，本发明以其作为提高子囊孢子及菌丝的繁殖能力为目的而添加，作为营养添加剂，促进细胞的分裂进而快速生长；维生素b1作为维生素快速促进菌丝生长；植物激素的作用促进细胞快速生长、分裂；小球藻活性生长因子、维生素b1、植物激素促进块菌菌丝快速生长；琼脂作为凝固剂添加，同时具有保持水分的作用；ph调节至块菌菌丝生长的自然条件下ph值的区间，以防止抑制其生长。同时培养温度依据块菌生长繁殖的地温设定，培养过程需用黑色塑料袋或黑布包裹，均最大程度还原其实际生长环境。各种组分和培养条件从生态模拟、营养生长、快速生长三个角度出发并进行整合，协同作用，从而能促使块菌孢子的快速萌发并生长，从而提高了分离效率。
培养基的制备由以下步骤组成：
(1)取马铃薯100-400g，去皮切成1立方厘米块，加入800ml水中沸腾状态下煮30min后过滤取汁液；整个加热过程维持水量为500ml；其作用为马铃薯在高温蒸煮状态下，其水溶性成分溶于水中，过滤后得到的水溶性营养成分包括生长因子和可溶性多糖，易经菌丝吸收，促进生长的作用更明显。
(2)取松针(雪松、马尾松等)3-20g先加800ml水浸泡12h后，再在沸腾状态下煮1h后过滤取汁液；整个加热过程中维持水量为400ml；其作用为松针在高温水浸提的条件下，释放了针叶中的水溶性成分，该成分可以提供自然生态环境块菌生长的必须因子，实现实验室内的生态环境的营养成分和抑制杂菌生长的模拟，促进块菌子囊孢子萌发和菌丝生长。
(3)取蛋白核小球藻粉2-10g，加入100ml水中搅拌均匀，然后置于-20℃冷冻3h，然后置于室温融化，融化后再放入-20℃条件下冷冻，再融化，反复3次，然后离心5000r/min，20min，取上清液；其作用为小球藻内含活性生物生长因子，通过反复冷冻融化的方式最大程度保留c.g.f.活性，然后通过无菌操作和过滤除菌的方式，加入熔化的培养基内，混合振荡均匀后倒平板。
(4)将马铃薯汁液500ml，松针汁液400ml，加入麦芽糖和硫酸铵，然后加入琼脂5-12g，边搅拌边加热溶解后定容至900ml，调整ph至6.5-8.5，分装入三角瓶中，121℃，灭菌30min后，冷却至50℃待用。为下一步平板的制备准备培养基。
(5)取高压蒸汽灭菌的培养皿，在超净工作台内将上述制作好的培养基，以过滤除菌方式将维生素b1、植物激素(iaa、naa、2，4-d、ga)、小球藻水提取物100ml加入培养基中，使它们的终浓度分别为0.05～0.3g/l，0.5～50mg/l，0.01～10mg/l，0.01～30mg/l，1～30mg/l，2～10g/l，混合均匀待凝固后制作平板，培养皿中培养基厚度3～5mm；该厚度一方面保持培养过程中的水分需求；一方面保证子囊果组织块插入培养基内部时不会碰触培养皿底部，同时保证浸入培养基部分为为菌块的1/3～1/2。加入维生素b1以满足其生长对维生素的需求。
分离步骤由以下步骤组成：将块菌子囊果表面洗净后晾干，用75％乙醇消毒后，将子囊果用手掰开，在掰开的横截面上用灭菌的不锈钢手术刀片切削为正方体或长方体，不要接触子囊果外表层，切削后的菌块，放入0.1％氯化汞溶液中浸泡消毒120～180s后放入无菌水中漂洗1～3min，在超净工作台内晾干，然后用直径为6mm的胶塞打孔器打成直径为6mm的圆柱形菌块，再用解剖刀切成厚度为2～4mm的圆片，打孔取圆柱形菌块时，将菌块外围以切成薄片的形式去除，留取内部的菌块，用灭菌的镊子将圆片放入培养基中，并向下用力使菌块的1/3～1/2浸入培养基中，接种后的平板采用保鲜膜封闭。上述操作在保证没有外源杂菌污染的情况下，能够最大程度促进保湿保水；菌块浸入培养基中，深度为菌块的1/3～1/2，有利于整体菌块吸收水份，同时保鲜膜封皿能够长时间保留培养皿内的水分，从而利于块菌子囊孢子的萌发，提高了成功率，极大程度降低了污染率。
所述培养步骤由以下步骤组成：将用保鲜膜封闭的平板，放入黑色塑料袋中，提供自然生长状态下的黑暗环境，于19～25℃倒置培养，提供自然生长状态下的土壤温度(地温)，8-11天后菌丝开始萌发，20～30天后菌丝生长至约菌落直径为20～30mm；然后，用直径4～6mm的打孔器对长有菌丝的培养基进行打孔，打成的菌饼的有菌丝的一面贴于新制备的平板中，按照上述方法进行培养。
本研究能够分离培养得到单独的块菌菌丝，在琼脂平板上菌丝生长速度达到0.1cm/d，为获得大量代谢产物以及进行相关的形态特征、生理特性和栽培研究奠定了基础，能够节约资源和缩短培养时间，提高时效，值得推广。
本发明具有以下有益效果：
(1)采用特异的培养基，从生态模拟、营养生长、快速生长三个角度出发并进行整合，协同作用，能促使块菌孢子的快速萌发并生长，提高了分离效率。
(2)分离前得预处理操作在保证没有外源杂菌污染的情况下，能够最大程度促进保湿保水，即菌块浸入培养基中，深度为菌块的1/3～1/2，有利于整体菌块吸收水份，同时保鲜膜封皿能够长时间保留培养皿内的水分，从而利于块菌子囊孢子的萌发，提高了成功率，极大程度降低了污染率。
(3)利用本发明技术培养的块菌子囊孢子，能够在19～25℃培养8-11天后开始萌发，随后以0.1cm/d的速度生长繁殖，为了块菌的资源化利用和科学研究提供了原材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是实施例一分离培养得到单独的块菌菌丝平板的照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种印度块菌菌丝快速分离和培养方法，包括制备培养基、分离、培养的步骤，所述培养基包括以下组分：麦芽糖10g/l、硫酸铵5g/l、马铃薯100g/l、松针3g/l、小球藻水提取物2g/l、维生素b10.1g/l、植物激素iaa、ga分别为5mg/l，10mg/l、琼脂12g/l，调节ph6.5。
配置方法：
(1)取马铃薯块100g去皮切成1立方厘米块，加入800ml水中沸腾状态下煮30min后过滤取汁液；整个加热过程维持水量为500ml；
(2)取雪松松针3g加入水800ml浸泡12h后，再在沸腾状态下煮1h后过滤取汁液；整个加热过程中维持水量为400ml；
(3)取蛋白核小球藻粉2g，加入100ml水中搅拌均匀，然后置于-20℃冷冻3h，然后置于室温融化，融化后再放入-20℃条件下冷冻，再融化，反复3次，然后离心取上清液；
(4)将马铃薯汁液500ml，松针汁液400ml，加入麦芽糖和硫酸铵，然后加入琼脂12g，边搅拌边加热溶解后定容至900ml，调整ph至6.5，分装入三角瓶中，121℃，灭菌30min后，冷却待用。
(5)取高压蒸汽灭菌的培养皿，在超净工作台内将上述制作好的培养基，以过滤除菌方式将维生素b1、iaa、ga、小球藻水提取物加入培养基中，使它们的终浓度分别为0.1g/l，5mg/l，10mg/l，2g/l，混合均匀待凝固后制作平板，培养皿中培养基厚度3mm。
分离步骤由以下步骤组成：将块菌子囊果表面洗净后晾干，然后用75％乙醇消毒后，将子囊果用手掰开，在掰开的横截面上用灭菌的不锈钢手术刀片切削为正方体或长方体，不要接触子囊果外表层，切削后的菌块放入0.1％氯化汞溶液中浸泡120s后放入无菌水中漂洗1min，在超净工作台内晾干，然后用直径为6mm的胶塞打孔器打成直径为6mm的圆柱形菌块，再用解剖刀切成厚度为2mm的圆片，用灭菌的镊子将菌块放入培养基中，并向下用力使菌块的1/2浸入培养基中，接种后的平板采用保鲜膜封闭。
所述培养步骤由以下步骤组成：将用保鲜膜封闭的平板，放入黑色塑料袋中，于19℃倒置培养，10天后菌丝开始萌发，30天后菌丝生长至约菌落直径为20mm。然后，用直径4mm的打孔器对长有菌丝的培养基进行打孔，打成的菌饼的有菌丝的一面贴于新制备的平板中，其它培养条件与上同，在琼脂平板上菌丝生长速度达到0.1cm/d，如图1所示。
实施例2：
一种印度块菌菌丝快速分离和培养方法，包括制备培养基、分离、培养的步骤，所述培养基包括以下组分：麦芽糖30g/l、硫酸铵1g/l、马铃薯200g/l、松针10g/l、小球藻水提取物10g/l、维生素b10.1g/l、植物激素iaa、naa、2，4-d分别为10mg/l，5mg/l，15mg/l、琼脂10g/l，调节ph7.5。
配置方法：
(1)取马铃薯块200g去皮切成1立方厘米块，加入800ml水中沸腾状态下煮30min后过滤取汁液；整个加热过程维持水量为500ml；
(2)取马尾松松针10g加入水800ml浸泡12h后，再在沸腾状态下煮1h后过滤取汁液；整个加热过程中维持水量为400ml；
(3)取蛋白核小球藻粉10g，加入100ml水中搅拌均匀，然后置于-20℃冷冻3h，然后置于室温融化，融化后再放入-20℃条件下冷冻，再融化，反复3次，然后离心取上清液。
(4)将马铃薯汁液500ml，松针汁液400ml，加入麦芽糖和硫酸铵，然后加入琼脂10g，边搅拌边加热溶解后定容至900ml，调整ph至7.5，分装入三角瓶中，121℃，灭菌30min后，冷却待用。
(5)取高压蒸汽灭菌的培养皿，在超净工作台内将上述制作好的培养基，以过滤除菌方式将维生素b1、iaa、naa、2，4-d、小球藻水提取物加入培养基中，使它们的终浓度分别为0.2g/l，10mg/l，5mg/l，15mg/l，10g/l混合均匀待凝固后制作平板，培养皿中培养基厚度5mm。
分离步骤由以下步骤组成：将块菌子囊果表面洗净后晾干，然后用75％乙醇消毒后，将子囊果用手掰开，在掰开的横截面上用灭菌的不锈钢手术刀片切削为正方体或长方体，不要接触子囊果外表层，切削后的菌块放入0.1％氯化汞溶液中浸泡180s后放入无菌水中漂洗3min，在超净工作台内晾干，然后用直径为6mm的胶塞打孔器打成直径为6mm的圆柱形菌块，再用解剖刀切成厚度为3mm的长方体或正方体块，用灭菌的镊子将菌块放入培养基中，并向下用力使菌块的1/3浸入培养基中，接种后的平板采用保鲜膜封闭。
所述培养步骤由以下步骤组成：将用保鲜膜封闭的平板，放入黑色塑料袋中，于22℃倒置培养，9天后菌丝开始萌发，25天后菌丝生长至约菌落直径为22mm；然后，用直径4mm的打孔器对长有菌丝的培养基进行打孔，打成的菌饼的有菌丝的一面贴于新制备的平板中，其它培养条件与上同，在琼脂平板上菌丝生长速度达到0.1cm/d。