一种高纯度条斑紫菜多糖类α‑淀粉酶抑制剂的制备方法与流程

本发明涉及一种高纯度条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂的制备方法，属于植物有效成分的制备领域。

背景技术：

条斑紫菜(porphyrayezoensis)藻体卵形，长卵形，为紫红色或略带绿色。紫菜中含有丰富的维生素、矿物质、蛋白质、脂肪酸、紫菜多糖等各种营养成分和生理活性物质。紫菜是多糖含量最丰富的海藻之一，紫菜中的多糖含量随着藻的种类及生长时间、地点等而有所不同，通常多糖含量在20％-40％。

糖尿病是21世纪严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。其发病率与遗传因素、生活方式、饮食结构及年龄等因素有关，是一种常见的代谢性疾病。近年流行病学研究表明，餐后高血糖较空腹高血糖对2型糖尿病慢性并发症的发生发展更为重要，与糖尿病大血管、微血管并发症的发生与发展均有密切关系；并且严格控制餐后血糖异常升高能够延缓糖耐量异常患者向2型糖尿病的转化。因而，干预治疗餐后高血糖在防治2型糖尿病方面具有非常重要的意义。

α-淀粉酶抑制剂可以是蛋白质、多肽类或者多糖。20世纪70年代以来，因其在医学上的价值α-淀粉酶抑制剂而被广泛研究，目前已经从豆类、小麦、野生苋属等植物种子中分离得到α-ai，其中活性较高的是从白芸豆中提取的α-ai，它对哺乳动物胰α-淀粉酶有较强的抑制作用，国外已经将其作为减肥保健食品进行应用。蛋白质和多肽类的α-ai活性高但存在植物凝集素去除不完全，或者提取过程中需要酸碱条件会对生态环境造成严重影响，同时不耐高温处理，严重时会出现过敏休克等。多糖类的α-ai对温度、酸碱和胃肠消化有一定强度的稳定性，安全无毒，可以有效地预防和管理2型糖尿病，作为天然的降糖药物具有良好的开发前景。国内外研究者从海带和藻类中提取的多糖α-ai对α-淀粉酶有较强的抑制作用。传统的海藻多糖提取方法主要有水提取法、酸提取法和碱提取法，并对粗多糖组分进行分级分离，多采用乙醇或丙酮进行反复沉淀，除去一部分醇溶性杂质，之后采用离子交换，凝胶层析等处理，从中逐级分离纯多糖。传统的方法使用乙醇等有机溶剂会造成环境污染等，分离纯化也无法工业化应用，本发明采用酶解结合超滤的方法从条斑紫菜中获得高纯度的多糖α-ai，对α-淀粉酶有较强的抑制作用，可应用于工业化生产。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种酶解结合超滤的方法，以制备效率高，产物温度稳定性高、耐酸碱和耐胃肠道消化的高纯度条斑紫菜多糖α-淀粉酶抑制剂的工业化制备方法，有助于条斑紫菜α-淀粉酶抑制剂的实际生产和应用。

本发明的第一个目的是提供一种高纯度条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)磨粉：将条斑紫菜磨粉，过筛；

(2)水提取：将紫菜粉与水混合后，搅拌提取，获得提取液；

(3)离心：将步骤(2)的提取液进行离心，取上清液；

(4)调节ph：将步骤(3)的上清液的ph调节至3.0～8.0；

(5)酶解：搅拌状态下向步骤(4)溶液中加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；

(6)灭酶：对步骤(5)的酶解液进行灭酶；

(7)离心：将步骤(6)的溶液离心取上清液；

(8)超滤：将步骤(7)的上清液进行超滤，收集截留液；

(9)干燥：将步骤(8)的截留液进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中过筛是过60～80目筛。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中提取温度是50～90℃，提取时间为2～4h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中蛋白酶加酶量是步骤4溶液重量的1～5％。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的酶解温度是40～60℃，酶解时间为2～4h。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中的灭酶条件为：ph调至6.5～7.5，60～80℃水浴灭酶10～20min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(8)中超滤的超滤膜分子截留量为1～10kda。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)磨粉：将条斑紫菜磨粉，过60～80目筛子；

(2)水提取：将步骤(1)的紫菜粉与水按质量比1:20～1:30混合，50～90℃搅拌2～4h；

(3)离心：将步骤(2)的提取液4000～8000r/min离心10～20min取上清液；

(4)调节ph：将步骤(3)的上清液的ph调节至3.0～8.0；

(5)酶解：搅拌状态下向步骤(4)溶液中加入溶液重量1～5％蛋白酶酶解杂蛋白，40～60℃搅拌2～4h得到酶解液；

(6)灭酶：将步骤(5)的酶解液ph调至6.5～7.5，60～80℃水浴灭酶10～20min；

(7)离心：将步骤(6)溶液4000～8000r/min离心10～20min取上清液；

(8)超滤：将步骤(7)的上清液通过截留分子量为1～10kd的超滤膜，收集截留液；

(9)干燥：将步骤(8)的截留液喷雾干燥，超微粉碎后即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

本发明的第二个目的是提供一种上述方法得到的α-淀粉酶抑制剂。

本发明的第三个目的是提供上述α-淀粉酶抑制剂在制备降糖药物、保健食品中的应用。本发明的有益效果：

本发明高纯度条斑紫菜α-淀粉酶抑制剂提取方法为酶解结合超滤，具有简单、操作控制容易、纯度高、生物活性高、稳定性好的特点，α-淀粉酶抑制剂活力可达到8000u/g；制得条斑紫菜α-淀粉酶抑制剂对温度、酸碱和胃肠消化有一定强度的稳定性，安全无毒，可以有效地预防和管理2型糖尿病，作为天然的降糖药物具有良好的开发前景。

附图说明

图1：条斑紫菜酶解结合超滤提取多糖分子量分布图；

图2：条斑紫菜α-淀粉酶抑制剂对温度的稳定性曲线图；

图3：条斑紫菜α-淀粉酶抑制剂对酸碱的稳定性曲线图；

图4：条斑紫菜α-淀粉酶抑制剂耐胃肠道消化的稳定性曲线图；

图5：条斑紫菜传统方法提取多糖分子量分布图。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的具体说明，但应该理解本发明并不受这些内容所限制。

α-淀粉酶抑制剂活力的测定方法

将0.25mlα-淀粉酶液和0.25ml样品加入到0.5ml0.2mol/lpbs(ph6.9)中，37℃水浴反应10min后，加入1％可溶性淀粉溶液0.5ml，精确反应5min后加入1mldns试剂，沸水浴10min后迅速冷却，然后加入5ml去离子水，在540nm波长下测定吸光值。在测定过程中，设置空白管、空白对照管和抑制对照管。空白管中不添加样品，空白对照管中不加α-淀粉酶液和样品，抑制对照管中不加α-淀粉酶液。体积不足处均以pbs补足。

样品对α-淀粉酶的抑制率可按式(1)计算：

式中a1、a2、a3和a4分别为空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管在540nm下的吸光值。

实施例1：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂制备

将条斑紫菜进行粉碎，过80目筛，收集条斑紫菜粉；

取50g紫菜粉加1000ml去离子混合，70℃搅拌提取2h；

将提取物于4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液；

用1mol/lhcl溶液调节上清液ph至3.0，加入1％蛋白酶酶解杂蛋白，60℃搅拌2h后，用1mol/lnaoh溶液调节酶解液ph至6.5，于80℃水浴灭酶20min，离心8000r/min下离心20min，取上清液；

将上清液超滤，使用超滤膜孔径为10kda，收集截留液；

将截留液进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品，采用hplc测定多糖分子量分布。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为8000u/g。如图1所示，本发明提取多糖分子量均一，且对α-淀粉酶有较强的抑制作用。

实施例2：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂制备

将条斑紫菜进行粉碎，过60目筛，收集条斑紫菜粉；

取50g紫菜粉加1000ml去离子混合，50℃搅拌提取2h；

将提取物于4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液；

用1mol/lnaoh溶液调节上清液ph至8.0，加入2％蛋白酶酶解杂蛋白，50℃搅拌2h后，用1mol/lhcl溶液调节酶解液ph至7.5，于80℃水浴灭酶20min，离心8000r/min下离心20min，取上清液；

将上清液超滤，使用超滤膜孔径为10kda，收集截留液；

将截留液进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。

将α-淀粉酶抑制剂产品取适量溶于去离子水中，测定α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为5000u/g。

实施例3：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂制备

将条斑紫菜进行粉碎，过80目筛，收集条斑紫菜粉；

取50g紫菜粉加1500ml去离子混合，60℃搅拌提取2h；

将提取物于4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液；

用1mol/lhcl溶液调节上清液ph至5.0，加入4％蛋白酶酶解杂蛋白，40℃搅拌2h后，用1mol/lnaoh溶液调节酶解液ph至7.0，于60℃水浴灭酶20min，离心8000r/min下离心20min，取上清液；

将上清液超滤，使用超滤膜孔径为1kda，收集截留液；

将截留液进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为3600u/g。

实施例4：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂制备

将条斑紫菜进行粉碎，过80目筛，收集条斑紫菜粉；

取50g紫菜粉加1500ml去离子混合，70℃搅拌提取2h；

将提取物于4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液；

用1mol/lnaoh溶液调节上清液ph至8.0，加入5％蛋白酶酶解杂蛋白，60℃搅拌2h后，用1mol/hcl溶液调节酶解液ph至6.5，于80℃水浴灭酶20min，离心8000r/min下离心20min，取上清液；

将上清液超滤，使用超滤膜孔径为1kda，收集截留液；

将截留液进行喷雾干燥，即得粉末状的α-淀粉酶抑制剂产品。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为3100u/g。

实施例5：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂耐受性能

将实施例1制备得到的α-淀粉酶抑制剂产品取适量溶于去离子水中，取产品水溶液5ml分装到试管中，在50、60、70、80、90℃的恒温水浴锅中处理20min后，迅速流水冷却至室温，测定α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力。如图2所示，它在90℃下加热30min后，抑制活力基本上没有改变，具有良好的耐热稳定性。

将实施例1制备得到的α-淀粉酶抑制剂产品取适量溶于去离子水中，取产品水溶液100ml，用1mol/lhcl或1mol/mlnaoh将其ph于室温下分别调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0并持续搅拌30min，然后立即将ph调回至原液ph值，8000r/min下离心20min，取上清液，测定其对α-淀粉酶的抑制活力。如图3所示，它在ph值2-10之间化学结构稳定，抑制活性不受影响，具有广泛的酸碱耐受性。

将实施例1制备得到的α-淀粉酶抑制剂产品取适量溶于去离子水中，取产品水溶液于37℃的酶反应器中，分别用1mol/lhcl将其调至ph2.0，并加入1％的胃蛋白酶来模拟胃环境，在处理过程中每30min取20ml灭酶后进行测定；用1mol/lnaoh将其调至ph8.2，并加入1％的胰蛋白酶来模拟肠道环境，在处理过程中每30min取20ml灭酶后进行测定。如图4所示，在模拟胃肠处理时，抑制活性一直处于稳定状态。由此可见，α-淀粉酶抑制剂活性在胃肠道内可以发挥很好的降糖作用，其生理效果可靠。

对照例1：传统方法制备条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂

将条斑紫菜进行粉碎，过80目筛，收集条斑紫菜粉；

取50g紫菜粉加1000ml去离子混合，70℃搅拌提取2h；

将提取物于4℃，8000r/min下离心20min，收集上清液；

用乙醇或丙酮进行反复沉淀，8000r/min下离心20min，收集上清液；沉淀用去了离子水复溶，采用hplc测定多糖分子量分布。测定结果显示，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力为1000u/g。如图5所示，传统的方法提取多糖分子量不均一，需进一步分离纯化才可获得高纯度的多糖，且对α-淀粉酶抑制活力不高。

对照例2：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂制备

在蛋白酶酶解时，用1mol/lnaoh溶液调节上清液ph至10.0，其他步骤与实施例1一致，结果发现，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力仅为1100u/g；而在蛋白酶酶解时，用1mol/lhcl溶液调节上清液ph至2.0，其他步骤与实施例1一致，结果发现，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力仅为2000u/g。

对照例3：条斑紫菜多糖类α-淀粉酶抑制剂制备

将提取液进行离心后的上清液通过截留分子量为10kd的超滤膜过滤，然后再按照实施例1的酶解、灭酶步骤进行处理，条件与实施例1一致，结果发现，α-淀粉酶抑制剂产品中α-淀粉酶抑制剂活力仅为600u/g。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。