一种外源物质导入鸡胚的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的外源物质导入鸡胚的方法。

背景技术：

鸡胚作为经典的胚胎生物学模型，一直以来被用作探究胚胎发育和胚胎细胞分化等研究，尤其是在医学模型上具有广泛的应用前景。将外源物质导入鸡胚对基因功能验证，转基因育种和嵌合体制备等生产研究具有重要的意义。因此一种高效简便的外源物质导入方法不仅能够为鸡胚发育生物学和转基因鸡制作等提供技术支持，也能为相关研究提供实验基础。目前国内外对鸡胚注射的方法已有大量报道。目前主要的注射方法有直接注射法，胚下腔注射法和血管注射法。国内外多数报道使用的是胚下腔注射法进行注射，这种方法胚胎位置难以寻找，操作复杂且孵化率太低。kwon等通过胚盘下腔注射法获得了13只转基因鸡，外源基因转入效率为10.08％。薛松磊等人报道胚盘下腔注射后孵化率仅为22.5％。血管注射法以其外源物质转入效率高具有明显的优点，但是血管注射的方法没有被统一明确描述，且多个血管注射方法存在操作繁琐，过程复杂，难以重复等缺点，限制了鸡胚血管注射的进一步应用，需要进一步的优化和改进。

技术实现要素：

本发明的目的克服现有技术缺点，提供了一种新的外源物质导入鸡胚的方法，旨在鸡胚早期(13-17hh)通过血管注射导入外源物质，为鸡胚注射的广泛应用奠定基础。本方法适用于鸡胚外源基因或细胞导入，转基因鸡和嵌合体制备，操作简便快速，外源物质导入效率高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种外源物质导入鸡胚的方法，包括如下步骤：

(1)对孵育48-58h的13-17hh早期胚蛋在无菌条件下开口，找到胚胎位置，剥去胚蛋外壳膜，露出胚胎血管；

(2)将需要导入的外源物质注入到玻璃注射针中，通过显微注射仪注射到鸡胚血管中；

(3)注射后加入青链霉素至注射部位，然后使用医用胶带封口。

优选的，所述早期胚蛋在无菌条件下开口使用镊子在钝端开口，使用眼科镊剥去外壳膜。

优选的，所述早期胚蛋开口大小为直径1-1.5cm的圆孔。

优选的，所述玻璃注射针外径为1mm，内径为0.6mm。

优选的，所述青链霉素的加入量是200ul。

优选的，所述外源物质为脂质体包裹好的质粒pegfp-n1进行注射，脂质体和质粒的质量体积比为1：3，将包裹好的质粒放在37度孵化箱中孵育30mins，然后使用微量移液器填入到所述玻璃注射针中，注射剂量为1-3ul。

优选的，所述微量移液器移液范围为0.5-10ul。

本发明的优越性在于：

1.本发明可以快速简便的将外源物质导入到鸡胚中，可用于外源基因或细胞导入，转基因鸡和嵌合体制备等生产研究。

2.本发明中的注射方法相对于胚下腔注射法，对胚胎的影响较小，孵化率高，转染效率好，且该时期血管位置清晰，操作简便，易于操作，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1a是本发明胚胎注射位置(注射血管位置)示意图；

图1b是本发明胚胎注射位置(血管注射位置放大图)示意图；；

图2a是本发明胚胎注射效果图(暗场下胚胎图)，图2a中左边为注射，右边为对照；

图2b是本发明胚胎注射效果图(明场下胚胎图)，图2b中左边为注射，右边为对照。

具体实施方式

一种新的外源物质导入鸡胚的方法：

(1)对孵育48-58h的早期胚蛋(13-17hh)在无菌条件下使用镊子在钝端开口，开口大小为直径1-1.5cm的圆孔，在体视显微镜下找到胚胎位置，使用眼科镊轻轻挑开外壳膜，露出胚胎血管。

(2)将需要导入的外源物质(如包裹好的质粒载体，细胞等)，本例使用脂质体包裹好的质粒(pegfp-n1)进行注射，脂质体和质粒的质量体积比为1：3，将包裹好的质粒放在37度孵化箱中孵育30mins，然后使用微量移液器填入到事先准备好的玻璃注射针中，通过显微注射仪注射到鸡胚血管中，注射部位如图所示(图1a、图1b)。

相关器材：

玻璃注射针外径为1mm，内径为0.6mm(narishige公司，货号：g-1)，使用拉针仪(narishige公司，货号：pn-31)将针正常拉出后使用。微量移液器移液范围为0.5-10ul(eppendorf公司，货号f27960o)。

(3)在注射后加入200ul青链霉素至注射部位，然后使用医用胶带封口。继续放入孵化箱，孵化温度为38℃，湿度为80％，根据要求在不同阶段取出检测。本例中注射由脂质体包裹的egfp载体质粒(pegfp-n1)，每个胚蛋注射2ul，质粒总量为1pg，于注射后24小时观察，发现质粒成功导入并表达绿色荧光(图2a、图2b)。且研究发现在注射量1-3ul范围内对孵化率影响不大，3ul之后孵化率随剂量上升而下降，5ul注射的孵化率对鸡胚孵化影响较大，故适宜注射剂量为1-3ul(表一)。

表一：不同注射剂量对孵化率的影响

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种外源物质导入鸡胚的方法，属于生物技术领域，具体包括如下步骤：（1）对孵育48‑58h的13‑17 HH早期胚蛋在无菌条件下开口，找到胚胎位置，剥去胚蛋外壳膜，露出胚胎血管；（2）将需要导入的外源物质注入到玻璃注射针中，通过显微注射仪注射到鸡胚血管中；（3）注射后加入青链霉素至注射部位，然后使用医用胶带封口。本发明旨在鸡胚早期（13‑17 HH）通过血管注射导入外源物质，为鸡胚注射的广泛应用奠定基础。本方法适用于鸡胚外源基因或细胞导入，转基因鸡和嵌合体制备，操作简便快速，外源物质导入效率高。

技术研发人员：李碧春;靳锴;左其生;张亚妮
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2017.10.30
技术公布日：2018.02.23